一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒，包括以下步骤：DNA打碎得到DNA片段，末端修复，加A，加接头，进行Pre?Capture LM?PCR；将4000人类致病靶基因的Pre?capture LM?PCR产物混合得到混合文库样本，使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交，磁珠捕获DNA并洗脱；进行Post?capture LM?PCR。所述试剂盒包含DNA末端修复试剂、加A试剂、加接头试剂、LM?PCR试剂和捕获试剂。本发明选择4000个人类致病基因作为的靶点并组合在一起，通过生物素探针捕获技术一次性富集这些个基因序列，并行高通量测序，可同时检查基因的多种变异类型，检测敏感度高，可使4000致病基因成为临床上的主要诊断检测手段，有利于降低成本，减少漏诊，提高检测阳性率，利于其临床推广。
【专利说明】
-种富集4000人类致病卽基因的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及基因检测领域，尤其设及一种富集4000人类致病祀基因的方法及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 人类基因组是由23对染色体组成，含有约30亿个DNA碱基对。人类基因组计划中调 查人类基因组中的真染色质基因序列含有大约20000到25000个蛋白质编码基因。蛋白质编 码序列(也就是外显子)在人类基因组中少于1.5%。在基因与调控序列之外，仍然有许多功 能未知的广大区域，包括许多重复序列、转位子或伪基因等。当一个或多个基因发生不正常 表现时，便可能会使某个相对应的表型产生一些临床症状。遗传异常的原因包括了基因突 变和染色体数目异常。如果受损的基因会从亲代遗传到子代，那就会成为一种遗传性疾病。 目前已知有大约7000种遗传疾病，但只有近4000个基因是有明确人类致病机制的，并且能 够在家族中进行传递。
[0003] 基因检测是从血液、其他体液或细胞中检测一个人的DNA序列，对受检者基因编码 的序列进行测定和定位比对分析。但如何有效、低成本对人类致病基因中识别导致特殊疾 病的几个突变是有非常大的挑战性。运是因为，当对20000个人类基因进行检测，有16000个 基因的功能不明，对测序数据的大量使用造成对外显区域的低覆盖，从而造成很大程度的 漏诊。如果对全部20000个基因的外显子的使用高通量测序方法进行测序检测，成本非常 高，不利于其临床推广。
[0004] 高通量测序技术也称二代测序、下一代测序技术、深度测序或大规模平行测序，它 是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。其核屯、 思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确 定DNA的序列。高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可 能。目前，主要有S种主流的测序平台：iIlumina公司化seq平台、life technologies公司 的PGM平台W及Roche公司的454平台。
[0005] 高通量测序技术由于其超高的测序能力在科研和临床中具有极为重要的应用。然 而，虽然二代测序大大降低了 DNA分析的成本，其样本制备过程依然繁琐，成为其今后广泛 应用中的一种障碍。因此，人们对其DNA文库构建方法进行了大量研究，W期简化样本的制 备步骤，获得高质量的检测样本。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，本发明提供一种富集4000人类祀基因的方法 及试剂盒。本发明从〇MIM、HGMD、化iProt、HUG0、NCBI和Refseq数据库W及目前已知的人类 致病基因中选择4000个作为的祀点并组合在一起。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[000引一种富集4000人类致病祀基因的方法，包括W下步骤：
[0009] SI、提取总DNA并将其打碎，得到DNA片段；
[0010] S2、对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
[0011] S3、在平末端DNA片段3'端加A，得到加A的DNA片段；
[0012] S4、在加A的DNA片段的3 '端加接头，得到加接头的DNA片段；
[0013] S5、对加接头的DNA片段进行Pre-capture LM-PCR;
[0014] S6、将4000人类致病祀基因的Pre-capture LM-PCR产物混合得到混合文库样本， 使用4000人类致病祀基因特异性探针文库与混合文库样本杂交，磁珠捕获DNA并洗脱；
[0015] S7、磁珠捕获的DNA样本进行化st-cap1:ure LM-PCR。
[0016] 优选地，Pre-cao1:ureLM-PCR的反应体系如下：
[0017]
[0018] 优选地，Pre-Capture LM-PCR的反应条件如下：98°C45sec;98°C 15sec，6(TC 30sec，72°C 30sec，9cycles;72°C lmin;4°C。
[0019] 优选地，Post-captureLM-PCR反应的体系如下：
[0020]
[0021] 优选地，Post-Capture LM-PCR反应的条件如下：98°C45sec;98°C 15sec，60°C 30sec，72°C 30sec，14cycles;72°C lmin;4°C。
[0022] 优选地，本发明中4000人类致病祀基因特异性探针与混合文库样本杂交步骤如 下：向离屯、管中加入COT DNA和sample library,得到混合物1;混合物1中分别加入SeqCap 肥Universal Oligo和SeqCap肥Index Oligos,得到混合物2;混合物2在DNA真空浓缩仪 浓缩至液体蒸干，加入2 XHybridization Buffer和Hybridization Component A，得到混 合物3;将混合物3混匀离屯、后置于95°C加热lOmin，加入4000人类致病祀基因特异性探针文 库中，得到混合物4，混合物4在47°C解育24小时。
[0023] 优选地，磁珠与DNA的结合方法为:将杂交的样本加入到预处理好的磁珠中，混匀 后置于热循环仪中47°C结合45分钟。
[0024] 优选地，磁珠-DNA结合物依次使用Wash Buffer I,Shingent Wash Buffe;r、Wash Buffer I、Wash Buffer H和Wash Buffer III洗脱。
[0025] 优选地，所述步骤S2-S5和步骤S7包含纯化步骤。
[0026] 优选地，纯化步骤为：向样本中加入相应的反应液混匀，室溫解育10分钟，使DNA与 磁珠充分结合;将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，弃掉上清，将管继续留在磁力架上， 加入80%酒精，室溫解育30秒W上，吸走酒精，将管继续留在磁力架上，加入80%酒精，室溫 解育30秒W上，吸走酒精;室溫下充分干燥。
[0027]更优选地，当需要将DNA与磁珠分离时，纯化后将管从磁力架上取出，加入d地2〇或 pH 8.0的IOmM Tris-HCl,室溫解育2分钟即可。
[00%] -种富集4000人类祀基因的试剂盒，包含DNA末端修复试剂、加A试剂、加接头试 剂、LM-PCR试剂和捕获试剂。
[0029] 优选地，所述捕获试剂包含4000人类致病祀基因特异性探针文库、捕获磁珠和标 记序列。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0031] 本发明从OMIM、HGMD、UniProt、HUGO、NCBI和Refseq数据库W及目前已知的人类致 病基因中选择4000个作为的祀点并组合在一起，通过生物素探针捕获技术一次性富集运些 个基因序列，并行高通量测序，可同时检查基因的多种变异类型，检测敏感度高，可使4000 致病基因成为临床上的主要诊断检测手段，有利于降低成本，减少漏诊，提高检测阳性率， 利于其临床推广。本发明试剂盒便于致病基因的富集，简化了检测操作，节省时间。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明流程图。
[0033] 图2为步骤Sl中片段打碎电泳图。
[0034] 图3为步骤S5中前LM-PCR产物纯化后电泳图。
[0035] 图4为步骤S7中后PCR产物纯化后电泳图。
【具体实施方式】
[0036] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和【具体实施方式】做进一步说明。除有特殊 说明外，本发明中所用的试剂、设备或方法等都是本领域技术人员所熟知的，在此不再寶 述。
[0037] 本发明中使用的W下试剂的配方如下：
[0038] 末端修复反应混合物化nd Repair Master Mix,20]il):
[0039] 水 祉 I
[0040] 10 XKAPA End Repair Buffer 7yl
[0041] KAPA End R邱air Enzyme Mix 化1。
[0042] 加A反应混合物（A-Tailing Master Mix,5化1):
[0043] 水
[0044] 10 XKAPA A-Tailing Buffer 5yl
[0045] KAPA A-Tailing Enzyme 化1。
[0046] 连接混合物(Xigation Master Mix,5化1):
[0047] 水 3化1
[0048] 5XKAPA Ligation Buffer IOyl
[0049] KAPA T4DNA Ligase 5iU。
[(K)加]实施例1
[0051]为了简便说明，本实施例仅W6个样本为例来说明本发明富集人类致病祀基因的 方法，如图1所示，包括W下步骤：
[0化2] Sl、提取总DNA并将其打碎，得到DNA片段
[0化3] 按照常规方法从每个样本的30化1全血中提取DNA，取化1 DNA样本在化no化OP上 进行浓度测定。测得DNA浓度要求0D260/0D280比值在1.8~2.0之间，0D260/0D230比值在 1.8~2.2之间，W上两个比值可W判断所提取的DNA纯度如何。若超出上述范围，则可认为 提取DNA纯度不符合要求，需重新提取或再纯化。根据测定的浓度，用DNA溶解缓冲液进一步 稀释到浓度为25ngAU。
[0化4] 总DNA用Q800R超声波破碎仪打断。具体步骤如下：
[0055] 往杯式探头杯中加入纯水，且没过铁合金探头。在0.5ml的离屯、管中转入40iil 25ng/山的DNA，将其固定在样本固定器上，并轻轻弹走底部的气泡。将样本固定器放入到杯 式探头中，并再次往杯式探头中加入纯水，直至纯水液面与管中DNA液面平齐。
[0056] 提前开启Q800R的循环冷凝水系统，设置溫度在：rC。在主机上设置好打断程序： Pulse on20sec;Pulse off30sec;Time20min;Amplitude 40%。待溫度降到设定溫度3°C 时，即可开启打断程序。程序运行完成后，将微管中的样本置于-20°C保存。所有样本完成打 断后，关掉循环冷凝水系统，关闭发动机。
[0057] 每例样本取化1打碎后的DNA片段，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，最终每例样本的 片段长度应在5(K)bpW下，峰值在35化P为合格。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。第1泳道是 分子大小标记，第2~7泳道是为对不同样本进行DNA打断，片段大小约在50化pW下，后续步 骤纯化收集峰值约35化P左右片段。
[0化引 S2、末端修复
[0059] 每例样本取50山DNA片段，加入末端修复反应混合物，总体积70iil。在热循环 仪(扩增仪)上20°C解育30min，结束后立即进行纯化。
[0060] 纯化的具体方法如下：向每例样本中加入12化1的AgencourtKAMPureKxp reagent， 总体积19化1。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室溫解育10分钟，使DNA与磁珠充分 结合。将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小屯、弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入 200iil 80%酒精。室溫解育30秒W上，小屯、吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80%酒精。室溫解育30秒W上，小屯、吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要 吸走底部的磁珠。室溫充分干燥。将管从磁力架上取出。
[0061] S3、加A
[0062] 向每个含有修复DNA-磁珠的管中加入50山的加A反应混合物反应液，总体积50山。 移液枪上下反复吸打，充分混匀样本。热循环仪(扩增仪)上30°C解育30min，结束后立即进 行纯化。
[0063] 纯化的具体方法如下：向每例样本中加入90iil的PEG/化clSPRlKSolution，总体积 14化1。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室溫解育10分钟，使DNA与磁珠充分结合。将 管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小屯、弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80 %酒精。室溫解育30秒W上，小屯、吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80 %酒 精。室溫解育30秒W上，小屯、吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底 部的磁珠。室溫充分干燥。将官从磁力架上取出。
[0064] S4、加接头
[0065] 向每个加了 A的DM-磁珠样本管中加入W下反应液：
[0066] 水 2jll 连接混合物（LigationMasterMix) 45川
[0067] 接头 3.Jll 总体积 SOjiIr
[0068] 用移液枪上下反复吸打，充分混匀样本。热循环仪(扩增仪)上20°C解育15min，结 束后立即进行后续纯化步骤。纯化的具体方法如下：
[0069] 向每例样本中加入SOiil的阳GMiclSPRlKSolution，总体积10化1。用移液枪上下 反复吸打，充分混匀溶液。室溫解育10分钟，使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上， 直至溶液变清澈，小屯、弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80%酒精。室溫解育 30秒W上，小屯、吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80 %酒精。室溫解育30秒W 上，小屯、吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室溫充分 干燥。将管从磁力架上取出。加入50iil的IOmM化is-HCl(pH 8.0)，室溫解育2分钟，使得DNA 从磁珠上分离开来。将上清全部转移至一个新的管中，继续后面的操作。
[0070] S5、Pre-cap 1:ure LM-PCR
[0071] 按照表1和表2所示的标准建立Pre-capture LM-PCR的反应体系和反应条件。
[0072] 表l、Pre-capture LM-PCR的反应体系 r00731
[0077] 样本在4°C或-20°C保存72小时，或者直接进行后续的纯化实验。Pre-cap化re LM- PCR产物纯化的具体方法为：
[007引每例样本中加入SOul的Agencou;rtRAMPureRXP reagent，总体积100山。用移液枪上 下反复吸打，充分混匀溶液。室溫解育10分钟，使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架 上，直至溶液变清澈，小屯、弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80 %酒精。室溫解 育30秒W上，小屯、吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80 %酒精。室溫解育30秒 W上，小屯、吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室溫充 分干燥。将管从磁力架上取出。加入d地20,室溫解育2分钟，使得DNA从磁珠上分离开 来。将离屯、管放回到磁力架上直至溶液变清澈。取SOiil上清转移至一个新的管中，继续后面 的操作。用1.5%琼脂糖凝胶电泳、Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度及片段大小。琼脂糖 凝胶电泳结果如图3所示，第1泳道是分子大小标记，第8~26泳道是为对不同样本进行前 LM-PCR，片段大小约在40化P左右。如bit测定扩增后的DNA浓度结果见表3。
[0079] 表3、如bit测定扩增后的DNA浓度 1
[0081]
[0082] S6、杂交捕获
[0083] (I)试剂和仪器准备
[0084] ①杂交准备
[0085] a)打开PCR仪器，设置溫度为95°C并保持该稳定溫度。
[0086] b)取适量4000人类致病祀基因特异性探针文库4.化1，放置室溫解冻。
[0087] ②W6个样本为例来说明肥化iversal Oligo和肥Index Oligo的配制。
[008引 表4、肥Universal Oligo和肥 IndexOligo配制表
[0089]
[0090] ③DNA样本混合液的准备
[0091] 根据化no化OP测定的样本浓度，每例样本取300ng混合于一个1.5ml管中制成混合 文库样本，最终取1.化g的混合文库样本用于杂交。
[0092] ④序列捕获与磁珠洗脱液的准备
[0093] 将NimbleGenSeqC^ip EZ Hybridization and Wash kit中的10 X 洗脱液（I, II, III and Stringent)和2.SXBead洗脱液稀释成I X的工作液，制备I个捕获单位量工作液 的洗脱液用量如表5所示。
[0094] 表5、洗脱液的稀释用量表 [00951
LUWW 丄作徽仕至温h A保巧周。仕化脫丽巧丽小町将buffers置于4'ru氷衡甲进化 平衡。
[0097] ⑤捕获磁珠Kapture Beads)预处理
[0098] 使用前提前30分钟将捕获磁珠恢复至室溫。将磁珠充分满旋混匀15秒。W每个捕 获单位加10化1磁珠于1.5ml离屯、管中。每个离屯、管最多可加6个捕获单位的磁珠量。将管置 于磁力架上，当液体变澄清时(此过程不超过5分钟），小屯、弃掉上清（勿吸走底部的磁珠）， 残留的液体将在后续洗脱步骤被去除。
[0099] 力日2倍于磁珠体积的I XBead Wash Buffer于磁力架的管中。将管从磁力架中取出 并满旋10秒。将管放回磁力架中W结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。重复本步骤 一次。
[0100] 用等体积的IXBead Wash Buffer重悬磁珠。取10化1重悬磁珠加入新的0.2ml离 屯、管中。将管放回磁力架中W结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。此时，捕获磁珠预 处理完成，可W结合捕获的DNA。此步骤结束后应立即进行后续的操作，避免捕获磁珠失水 变干。少量的磁珠洗脱液不会干扰捕获磁珠与DNA结合。
[0101] (2)杂交
[0102] 往新的1.5ml离屯、管中加入扣1的Img/ml COT DNA和1.扣g混合文库样本，得到混 合物1。混合物1中分别加入化1的SOOiiMSeqCap皿Universal Oligo和化1的SOOiiMSeqCap 皿 Index 01igo(W6个样本为例），得到混合物2(sample libra巧/COT DNA/^SeqCap HE 化iversal Oligo-Seq化P肥Index Oligo混合物），混合物2的组成如表6所示。
[0103] 表6、混合物2的组成 「01041
[0105] 将混合物2的管盖打开，放入DNA真空浓缩仪中60°C，浓缩15min。随着加入液体的 体积增多，需适当延长浓缩时间，直至液体蒸干。
[0106] 往蒸干的混合物2中加入：7.5]il of 2XHyb;ridization BuffeHvial 5)和化 1 of Hybridization Component A(vial 6)，得到混合物3。混合物3的组成如表7所示。
[0107] 表7、混合物3的组成 「ninRl
LU…/」 1可中化口1乂^〇中化〇丄^/|^?了厂1丄外\:化|乂口^巧'。，'|天>\||'^^巧乂^\十^乂丘巧'1^，丄^心/〇/]可中化口1乂^且 于95 °C加热模块上加热IOmins W变性DNA。室溫下W最大转速离屯、10秒。将变性的混合物加 入4.化1 4000人类致病祀基因特异性探针文库的0.2ml管子中。满旋混匀3秒并离屯、10秒。 将W上的混合物全部转移至0.2ml管中，并盖好管盖，得到混合物4。混合物4在热循环仪上 热模块47 °C (热盖57 °C)解育24小时。混合物4的组成如表8所示。
[0110] 表8、混合物4的组成 「ni111 LWUj (3)捕巧磁珠与UNA的结曾
[0113] 将杂交的样本加入到预处理好的捕获磁珠中。用移液器上下充分混匀10次，置于 热循环仪中47°C (热盖57°C)结合45分钟。每15分钟将样本满旋混匀3秒，W确保磁珠均匀悬 浮。
[0114] (4)磁珠 -DNA结合物洗脱
[0115] 往15iil的磁珠-DNA结合物中加入100山47°C的1 XWash Buffer I。满旋混匀10秒。 瞬时离屯、，将0.2ml管中内容物全部转移至0.5ml的管中。
[0116] 将管放回磁力架中W结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。将管从磁力架中 取出，加入20化1 47°C的IX Stringent Wash Buffer,移液枪上下吸打10次混匀。此过程47 °C恒溫快速操作W确保溫度不下降。47°C解育5分钟。重复本步骤一次。
[0117] 将管放回磁力架中W结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。加200iil室溫IX Wash Buffer I，满旋混匀2分钟。若管盖上有液体残留，继续下一步骤前轻轻敲打管子收集 管盖上液体。将管放回磁力架中W结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。加200山室溫 IXWash Buffer II，满旋混匀1分钟。将管放回磁力架中W结合磁珠。一旦液体变澄清，便 可弃掉上清。加200iU室溫IXWash Buffer III，满旋混匀30秒。将管放回磁力架中W结合 磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。将管从磁力架上取出，每管beads-DNA结合捕获样本 加50iil dd此0。将磁珠捕获的样本于于-15°C至-25°C保存。DNA不用进行再次分离磁珠，磁 珠捕获的样本将作为模板用于接下来的化st-cap化re LM-PCR。
[0118] S7、化st-capUire LM-PCR
[0119] 按照表9和表10的要求建立化st-cap化re LM-PCR反应的体系和反应条件。
[0120] 表9、化st-cap1:ure LM-PCR反应体系 「01211
[0122]表 10、Post-capture LM-PCR反应条件
[0123]
[0124] 样本在4°C或-20°C保存72小时，或者直接进行后续的纯化实验。Post-capture LM-PCR后纯化的方法为：
[01巧]往每个样本管中加入90山的AgencourtRAMPureRxp reagent，总体积140山，用移液 枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室溫解育15min，使DNA与磁珠充分结合。将管置于磁力架 上，静置直至液体变得清澈。小屯、弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80%酒精， 室溫解育30秒W上，小屯、吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入20化1 80%酒精，室溫解 育30秒W上，小屯、吸走酒精，室溫充分干燥。将管从磁力架上取出，加入的dd此0,室溫 解育2min，使DNA从磁珠上分离开来。将离屯、管放回到磁力架中直至溶液变清澈。每例样本 直接转移50iil至1.5ml离屯、管中，继续后面的操作。
[01%]用1.5%琼脂糖凝胶电泳、Nano化op、如bit及qPCR测定扩增后的DNA浓度及片段大 小。琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，第1泳道是分子大小标记，第2~4泳道是为对不同样本 进行后PCR，峰值约在400bp左右。如bit及qPCR测定扩增后的DNA浓度结果如表11所示。 [0127] 表11、如bit及qPCR测定扩增后的DNA浓度结果 「01281 LUI乙7」 迎大以化'|別1 乂衣乂i J斗、汉W 口Xiy
L个T大以化刀：Al,巧了田迎年乂/苗巧'I半作。巧丘。，IM开 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种富集4000人类致病靶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 提取总DNA并将其打碎，得到DNA片段； 52、 对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段； 53、 在平末端DNA片段3 '端加 A，得到加 A的DNA片段； 54、 在加 A的DNA片段的3 '端加接头，得到加接头的DNA片段； 55、 对加接头的DNA片段进行Pre-Capture LM-PCR; 56、 将4000人类致病靶基因的Pre-capture LM-PCR产物混合得到混合文库样本，使用 4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交，磁珠捕获DNA并洗脱； 57、 磁珠捕获的DNA样本进行Post-capture LM-PCR。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Pre-Capture LM-PCR的反应体系如下： 2x K.APA HiFiHotStartReadyN4ix 25μI Pre-capture LM-PGR Qligos 1&2? 5μΜ 5μ1 加接头的文库 20μΙ 总体积 50μ1 。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Pre-Capture LM-PCR的反应条件如下：98 〇C45sec ；98〇C 15sec ?60〇C30sec ?72〇C30sec ?9cycles ； 72〇C lmin；4°C 〇4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Post-capture LM-PCR反应的体系如下： 与磁珠结合的DNA 20μ1 ΚΑΡΑ HiFiHotStartReadvMix 25μ1 Post-capture LM-PCR Oligos 1 & 2, 5 uM 5μ1 总体积 50μ1。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Post-capture LM-PCR反应的条件如下:98 °C45sec ;98°C 15sec，60°C30sec，72°C30sec，14cycles; 72°C lmin;4°C。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，4000人类致病靶基因特异性探针文库与混 合文库样本杂交步骤如下：向离心管中加入COT DNA和sample library，得到混合物1;混合 物 1 中分别加入SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligos，得到混合物2;混 合物2在DNA真空浓缩仪浓缩至液体蒸干，加入2XHybridization Buffer和Hybridization Component A，得到混合物3;将混合物3混勾离心后置于95°C加热10min，加入4000人类致病 靶基因特异性探针文库中，得到混合物4，混合物4在47°C孵育24小时。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磁珠与DNA的结合方法为:将杂交的样本加 入到预处理好的磁珠中，混匀后置于热循环仪中47°C结合45分钟。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2-S5和步骤S7包含纯化步骤。9. 一种富集4000人类靶基因的试剂盒，其特征在于，包含DNA末端修复试剂、加 A试剂、 加接头试剂、LM-PCR试剂和捕获试剂。10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获试剂包含4000人类致病靶基 因特异性探针文库、捕获磁珠和标记序列。
【文档编号】C12N15/10GK105925562SQ201610309309
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】张巍
【申请人】广州嘉检医学检测有限公司