一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法
【专利摘要】一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，属于酶工程和淀粉加工技术领域。本发明采用一种10×普鲁兰酶前处理溶液处理来源于重组菌解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980?BdP的普鲁兰酶，经过处理的重组酶与土豆淀粉反应获得的反应液中直链淀粉含量比未经处理的重组酶处理同样土豆淀粉后得到的反应液中直链淀粉含量明显提高。本发明获得的方法在以土豆淀粉为原料的直链淀粉制备中有应用潜力。
【专利说明】
-种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，属于酶工程和淀 粉加工技术领域。
【背景技术】
[0002] 普鲁兰酶(PulIulanase，EC3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中 a-l，6糖巧键，形成直链淀粉的解支酶。用普鲁兰酶水解淀粉可W提高淀粉中直链淀粉的含 量，在直链淀粉制备工艺中可W通过使用普鲁兰酶来提高直链淀粉的得率。
[0003] ±豆淀粉是一类价格低廉的淀粉原料，是制备直链淀粉的理想原料。本课题组在 前期工作中，W解淀粉芽抱杆菌为宿主菌构建了一株表达重组普鲁兰酶的重组菌:解淀粉 芽抱杆菌/PUC980-化/户[孙娟娟沈微石贵阳王正祥.普鲁兰酶基因在解淀粉芽抱杆菌 BF7658菌株中的分泌表达.工业微生物，2011，41(6): 18-22]。该重组菌产生的重组普 鲁兰酶降解±豆淀粉可W提高直链淀粉的产量，但提高幅度不大。采用理化因子对酶进行 前处理可W在一定程度上改变酶的性质。
[0004] 本发明公开一种对解淀粉芽抱杆菌/PUC980-&//來源的重组酶进行前处理的方 法，经过前处理的重组酶催化±豆淀粉获得直链淀粉的得率明显高于未经前处理的酶催化 获得的直链淀粉的得率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是通过对重组菌解淀粉芽抱杆菌/PUC980-化//萊达的普鲁兰酶的预 处理，改变酶的特性，用其水解±豆淀粉获得的水解液的蓝值比用未经处理的酶液水解± 豆淀粉得到的蓝值明显提高，直链淀粉含量提高。
[0006] 本发明的技术方案:一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，采用10 X普鲁兰酶前处理溶液与9倍体积的重组普鲁兰酶酶液混合，将混合液在60°C保溫30min， 即得到处理后的重组普鲁兰酶。
[0007] 所述10 X普鲁兰酶前处理溶液具体为含100 mM巧樣酸-巧樣酸钢、60 mM抓了八- 船2、10臟〇1/1化(：1、10臟〇1/11((：1、口册.5±0.5的溶液。
[000引所述重组普鲁兰酶酶液具体为采用重组菌解淀粉芽抱杆菌BF7658/PUC980-仇/户 进行发酵获得。
[0009] 所述提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法的应用，^±豆淀粉为原料， 用所制得的处理后的重组普鲁兰酶为催化剂制备直链淀粉。
[0010] (1)重组普鲁兰酶发酵及制备方法： 将-70°c甘油管保藏的重组菌解淀粉芽抱杆菌/PUC980-化巧在含20 mg/L卡那霉素的LB 平板上划线，挑取单菌落。接种含20 mg/L卡那霉素的LB液体培养基。在500 mLS角瓶中装 液量为100 mL。200巧m，34 °C摇瓶发酵24 h，按10 %接种量接种5 L发酵罐发酵培养基;发 酵过程用氨水控制pH在6.8-7.5; 发酵结束后取发酵液于离屯、管中，12,000 rpm离屯、10 min,上清液普鲁兰酶酶活一般 在20-30 U/mL。取上清液15 mL于3 kD超滤离屯、管中，12,000 rpm离屯、10 min,即得普鲁兰 酶酶液。
[0011] 此过程中，分子量小于SkD的小分子物质被过滤到收集管中。酶分子等大于3 kD 的分子被截留在上层超滤管中，一般15mL发酵上清液可W被浓缩至0.5 mL左右，酶活一般 在600-900U/mL，此浓缩液即为下述普鲁兰酶酶液。
[0012] 将浓缩液取出后，空的超滤离屯、管可W再次使用，一个离屯、管一般可W反复使用5 次，制取大约2-3mL普鲁兰酶酶液。
[001引 3 kD超滤离屯、管为Millipore(密理博)公司产品，型号为:3邸/UFC900396。
[0014] (2)10X普鲁兰酶前处理溶液配制方法： 在1 L容量瓶中加入800 mL去离子水。加入抓TA-Nas *2出0 22.3 g，无水巧樣酸 15.25 g，无水巧樣酸钢5.16 g，氯化钢0.58 g，氯化钟0.746 g，pH 3.5±0.5,如果抑偏 离则用化OH或肥1调整抑至3.5±0.5,用去离子水定容至1L，即得10 X普鲁兰酶前处理溶 液。
[0015] (3)普鲁兰酶酶液的前处理方法:采用IOX普鲁兰酶前处理溶液与9倍体积的重组 普鲁兰酶酶液混合，将混合液在60°C保溫30 min,即得到处理后的重组普鲁兰酶。
[0016] (4)水解处理:±豆淀粉为原料，W步骤(3)制备所得处理后的重组普鲁兰酶为催 化剂制备直链淀粉，并对淀粉蓝值进行测定。
[0017] 淀粉蓝值的测定： 蓝值的大小表示着淀粉与舰结合能力的大小，蓝值越大，表示淀粉结合舰的能力越强， 线性聚合度越大。淀粉溶液中直链淀粉的含量与蓝值之间存在着接近于线性的关系，淀粉 中直链淀粉的含量可W通过蓝值测定进行计算[李彬，李海普，张莎莎，谢涛.玉米直链 淀粉、支链淀粉的分离、表征及浮选应用.2011，矿产保护与利用，巧-6):64-68 ]，蓝值越 高直链淀粉含量越高。直链淀粉的线性聚合度高，故蓝值一般可达到0.8~1.2，支链淀粉的 线性聚合度相对较低，故蓝值一般在0.08~0.22。蓝值测定方法一般是参照Gi化ert等使用 方'法[Gilbert GT, Spra邑邑 SP. Iodimetric determination of amylase iodine sorption: blue value[C]//WhistIer RL. Methods in carbohydrate chemistry. New York: Academic Press, 1964: 168-169.]，操作步骤就是先将样品的酸性水溶液与舰-舰 化钟试剂充分混合，取10 mg/100 mL新鲜淀粉溶液于比色管中，加入5 mL舰-舰化钟试剂 (含舰5 mg/100 mL)显色5 min。^蒸馈水为空白溶液，使用紫外-可见分光光度仪于400~ 750 nm范围内扫描，扫描最高峰处的光谱波长就记为最大吸收波长，最大吸收波长处的吸 光度记为AAmax,蓝值计算如式
重组普鲁兰酶酶活测定：按文献[B;Lbel M, ftrett C, Gosslar U, et al. Isolation and analysis of amylolytic enzyme of the hyperthermophiIic bacterium Thermotoga maritime. FEMS Microbiol Lett, 1998，158:9-15]方法进行。
[001引培养基； LB在"Sambrook等1989分子克隆实验手册"中描述。发酵培养基:乳糖50 g/L，豆饼粉30 g/L，酵母膏0.5 g/L，硫酸锭10 g/L，无水氯化巧0.5 g/L。
[0019] 本发明的有益效果：本发明在^±豆淀粉为原料W重组菌解淀粉芽抱杆菌 BF7658/PUC980-化//发酵获得的普鲁兰酶为催化剂制备直链淀粉时可W提高淀粉水解液中 直链淀粉的含量。
[0020] 生物材料样品保藏:解淀粉芽抱杆菌/PUC980-化/户，公开于[孙娟娟沈微石贵阳 王正祥.普鲁兰酶基因在解淀粉芽抱杆菌BF7658菌株中的分泌表达.工业微生物，2011， 41(6): 18-22]。
【附图说明】
[0021 ]图1是实施例2中Al溶液淀粉蓝值随时间变化情况示意图。
[0022] 图2是实施例2中Bl溶液淀粉蓝值随时间变化情况示意图。
【具体实施方式】
[0023] 通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不W任何方式限制本发明的范围。
[0024] 实施例1:普鲁兰酶发酵液的预处理 (1)重组普鲁兰酶发酵及制备方法： 将-70°C甘油管保藏的重组菌解淀粉芽抱杆菌/PUC980-化//巧含20 mg/L卡那霉素的 LB平板上划线，挑取单菌落。接种含20mg/L卡那霉素的LB液体培养基。在SOOmLS角瓶中装 液量为IOOmL。20化pm，34°C摇瓶发酵2地，按10 %接种量接种化发酵罐发酵培养基;发酵过 程用氨水控制抑在6.8-7.5; 发酵结束后取发酵液于离屯、管中，12000巧m离屯、10 min,上清液普鲁兰酶酶活一般在 20-30 U/mL。取上清液15 mL于3 kD超滤离屯、管中，12,000 rpm离屯、10 min,即得普鲁兰酶 酶液。
[00巧](2)10X普鲁兰酶前处理溶液配制方法： 在1 L烧杯中加入SOOmL去离子水。加入EDTA-化2* 2出0 22.3 g，无水巧樣酸15.25 邑，无水巧樣酸钢5.16 g，氯化钢0.58 g，氯化钟0.746 g，pH 3.5±0.5,如果抑偏离则用 NaOH或肥1调整抑至3.5 ± 0.5，即得10 X普鲁兰酶前处理溶液。
[00%]取化发酵罐发酵并浓缩制取的普鲁兰酶酶液两份各9 mL，分别标记为A和B，60°C 水浴5min，在A中加入双蒸水1血，在B中加入10 X普鲁兰酶前处理溶液1 mL，再继续保溫30 min。取出于冰水中降溫10 min。上述获得的酶液即为经过预处理的普鲁兰酶。检测普鲁兰 酶酶活，一般与原酶液相比除了因加入水或预处理液引起的稀释外，酶活不会有很大变化， 即一般在600-900U/mL，为便于实验结果的比较加入适量双蒸水将酶液稀释至400 U/mL，两 种稀释后的酶液分别称为酶液A和酶液B，分别在4°C保存待用。
[0027]实施例2: ^±豆淀粉为原料的直链淀粉制备 取±豆淀粉10 g，加水至100 mL，揽拌使淀粉悬浮，在100°C水浴中剧烈揽拌，至淀粉糊 化。室溫放置，待淀粉溶液冷却至50°C时，取2份各30 mL，分别标注为Al和Bl。在Al中加入实 施例1中经双蒸水预处理并稀释得到的酶液A 0.1 mL，在Bl中加入经过10 X普鲁兰酶前处理 溶液处理并稀释得到的酶液B，两种溶液都置于50°C水浴中保溫，每间隔10 min取适量反应 液稀释1000倍(稀释后的液体中淀粉浓度大约为10 mg/100 mL)，检测蓝值，Al和Bl溶液蓝 值随时间变化情况分别如图I和图2。
[00%]由图1可见，未经IOX普鲁兰酶前处理溶液处理的普鲁兰酶酶液A与淀粉反应后淀 粉液的蓝值最高不超过0.4,而且如果不能及时终止反应的话会出现蓝值下降的现象。
[0029] 由图2可见，经过10 X普鲁兰酶前处理溶液处理过的普鲁兰酶酶液B与淀粉反应 后，淀粉液的蓝值最高可接近于0.6，明显高于用普鲁兰酶酶液A处理的结果，而且随着反应 的进行蓝值不会下降。
[0030] 蓝值与淀粉中直链淀粉含量有直接的关系，由蓝值差异可W看出，用酶液B催化淀 粉溶液降解得到的直链淀粉的量可W明显增加。
【主权项】
1. 一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，其特征在于:采用10 X普鲁兰 酶前处理溶液与9倍体积的重组普鲁兰酶酶液混合，将混合液在60°C保温30min，即得到处 理后的重组普鲁兰酶。2. 根据权利要求1所述提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，其特征在于:所 述10 X普鲁兰酶前处理溶液具体为含IOOmM柠檬酸-柠檬酸钠、60 mM EDTA-Na2、10mmol/L NaCl、10mmol/L KCl、pH 3·5±0·5的溶液。3. 根据权利要求1所述提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，其特征在于:所 述重组普鲁兰酶酶液具体为采用重组菌解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980-及//进行发酵获 得。4. 权利要求1所述提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法的应用，其特征在于： 以土豆淀粉为原料，用权利要求1制得的处理后的重组普鲁兰酶为催化剂制备直链淀粉。
【文档编号】C12N9/44GK105925553SQ201610552087
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】沈微, 肖亚朋, 朱金寸, 王冰波, 陈献忠, 樊游
【申请人】江南大学