一种包含4-1bb的慢病毒制备方法及应用
【专利摘要】本发明提供了一种包含4?1BB的慢病毒制备方法及应用。通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可以不需要添加CD28，仅在转染前，于培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少Car?T细胞制备的程序，降低成本及污染风险；通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率以有效提高感染效率。
【专利说明】
-种包含4-1BB的慢病毒制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于医学生物技术领域，具体设及一种包含4-1BB的慢病毒制备方法及应 用。
【背景技术】
[0002] 慢病毒化entivirus)载体是WHIV-U人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的 基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可W将外源基因有效地整合到 宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、 屯、肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效 果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
[0003] 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒 可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度 的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包 装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离屯、取得上清液后，可W直接用于宿主细胞 的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效 应分子。
[0004] 如图1所示，慢病毒可作为CART淋己细胞治疗中的外源基因的载体，将外源基因 CAR导入到T淋己细胞中，从而对T淋己细胞进行基因组修饰，同时起到对T淋己细胞活化的 作用。嵌合抗原受体(CAR)基因修饰的T细胞是W能编码单链抗体-共刺激分子-免疫受体酪 氨酸活化基序的嵌合分子的融合基因修饰T细胞而产生的一种基因修饰的T细胞，具有肿瘤 抗原识别特异性强、亲和力高、非血K限制性并且可在体内外大量扩增。
[0005] 作为和本申请最接近的现有技术，公开号为CN201510279570.3的专利公开了一种 用于制备CART细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒，将CD3和CD28的相关序列 与VSVG重组后用于慢病毒的包装，将CD3的第一信号、CD28的第二信号，分别单独与VSVG重 组来共同活化T细胞，同时在感染T细胞前不使用任何抗体激活T细胞，运种活化方式具有一 定的风险性和不稳定性。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种包含4-1BB的慢病毒制备 方法及应用。通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可W不需要添加CD28,仅在转染前， 于培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少化r-T细胞制备的程序，降低 成本及污染风险;通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率W有效 提高感染效率。
[0007] 本发明所采用的技术方案为：
[000引一种包含4-1BB的慢病毒制备方法，包括W下步骤：
[0009] A、慢病毒载体质粒881-3-SJ19的构建：
[0010] A1、对CD19CAR基因进行PCR扩增：W全基因合成CD19CAR基因为模板，进行PCR扩 增，得到CD19CAR扩增产物；
[0011] A2、凝胶提纯CD19CAR扩增产物:使用凝胶提纯PCR扩增产物中CD19CAR的cDNA;
[0012] A3、用CD19CAR基因转染细胞：将步骤A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和 Solution r混合均匀，在16°C下保存16小时;然后加入化an巧a感受态细胞中，依次在冰中 保持30min，然后加热至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin，然后加入S0C/LB培养基，在37 °C 振荡培养60分钟，培养后离屯、，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在含有Amp的琼脂平板培 养基上培养；
[0013] A4、提取含有CD19CAR基因的质粒:从琼脂平板培养基上挑取881-3-SJ19质粒；
[0014] B、VSVG质粒的改造：
[0015] Bl、对4-1BB基因进行PCR扩增：W全基因合成4-1BB的基因片段为模板，进行PCR扩 增，得到4-WB扩增产物；
[0016] B2、对VSVG基因进行PCR扩增：W全基因合成VSVG的基因片段为模板，进行PCR扩 增，得到VSVG扩增产物；
[0017] B3、获得4-1BB-VSVG重组基因片段:将所述4-1BB扩增产物和VSVG扩增产物进行酶 切，并回收酶切产物进行连接反应，得到连接产物；
[001引 B4、用4-1BB-VSVG重组基因片段转染细胞:将步骤B3得到的连接产物加入TOPlO感 受态细胞中，混合均匀后依次在冰中保持30min，然后加热至42°C保持45s，再在冰中保持 Imin，然后加入S0C/LB培养基，在37 °C振荡培养60分钟，培养后离屯、，弃部分上清液后，将剩 余液体涂布在琼脂平板培养基上培养；
[0019] B5、改造 VSVG质粒的提取:用碱裂解法或质粒抽提试剂盒提取改造的VSVG质粒，命 名为4-1BB-VSVG质粒；
[0020] C、慢病毒的制备：
[0021] CU配制肥S溶液：将IOml 1.4M的化Cl、5ml 0.5M的邸S、500化150mM的化抽P〇4和 110化L IM的NaOH混合均匀、加双蒸水定容至50ml、调PH至6.95，过滤后保存，即为邸S溶液；
[0022] C2、配制转染试剂:将步骤A4得到的881-3-SJ19质粒、NRF质粒、步骤B5得到的4- IBB-VSVG质粒、IM CaC12和双蒸水，混合均匀后，逐滴加入步骤Cl得到的邸S溶液，滴加完毕 后，静置30min;即得转染试剂；
[0023] C3、细胞转染和培养:复苏293T细胞并进行培养，当所述293T细胞密度达到培养皿 底部70 %时进行转染，用不含血清的DMEM培养基对所述293T细胞进行换液;换液后，逐滴加 入步骤C2得到的转染试剂，混合均匀后，将所述293T细胞放入培养箱，静置2小时，静止后滴 加胎牛血清，继续培养8小时，然后使用含IOwt %胎牛血清的DMEM换液，继续培养48小时；
[0024] C4、病毒收集:步骤C3完成后，收集上清液，离屯、过滤后，即得病毒原液。
[0025] 通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可W不需要添加 CD28,仅在转染前，于培 养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少化r-T细胞制备的程序，降低成本 及污染风险;通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率W有效提高 感染效率。
[00%]根据本发明的一个实施例，凝胶提纯CD19CAR扩增产物的操作包括W下步骤：
[0027] I.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，切碎胶块。
[002引 2.称重胶块重量，计算胶块体积，Wlmg =化L计算，向胶块中加入Buffer GM(3个 凝胶体积量）。
[0029] 3.均匀混合后37°C水浴溶解，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5-10分 钟)。
[0030] 4.当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为澄色或粉 色，向上述胶块溶解液中加入3M醋酸钢溶液(P册.2) 1化1，均匀混合至溶液恢复黄色。当分 离小于40化P的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
[0031 ] 5.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection l\ibe上。
[0032] 6.将上述操作步骤4的溶液转移至Spin Column中，12,00化pm离屯、I分钟，弃滤液。
[0033] 7.将70化1的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12，000巧m离屯、30秒钟，弃滤液。
[0034] 8.再加入70化1 的Buffer WB，将Spin Column安置于Collection l\ibe上，室溫 12， 000巧m离屯、1分钟。
[0(X3日]9.将Spin Column安置于新的1.5ml的离屯、管上，在Spin Colu皿膜的中央处加入 30iil灭菌蒸馈水或Elution BuffeH加热至60°C使用时有利于提高洗脱效率。）室溫静置1 分钟。室溫12000巧m离屯、1分钟洗脱DNA。
[0036] 步骤Al中，所述PCR反应体系的总体积为50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq缓冲液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为 2.5mM，模板的浓度为1 OOng/化，引物的浓度为1 OuM。
[0037] 也就是说，所述dNTP、模板和引物，均为添加前的浓度。
[0038] 步骤Al中，使用的PCR扩增程序为:进行25个循环，其中每个循环依次包括W下步 骤:在98°C溫度下预变性10s，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25个 循环之后，即完成PCR扩增程序。
[0039] 步骤A4完成之后，还包括A5、酶切检测：依次进行酶切步骤和连接反应检测所述 881-3-SJ19质粒的序列;使用的酶切体系为:2化的881-3-SJ19质粒、1化的缓冲液、0.5化的 化Ol酶和6.扣L的cW出0;使用的连接体系为:2化的慢病毒载体、1化的缓冲液、0.5化的XbaI 酶和6.化L的dd出0。
[0040] 步骤Bl中，所述PCR反应体系的总体积为50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq缓冲液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为 2.5mM，模板的浓度为1 OOng/化，引物的浓度为1 OuM。
[0041] 步骤Bl中，使用的PCR扩增程序为:进行25个循环，其中每个循环依次包括W下步 骤:在98°C溫度下预变性10s，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25个 循环之后，即完成PCR扩增程序。
[0042] 步骤B2中，所述PCR反应体系的总体积为50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq缓冲液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为 2.5mM，模板的浓度为1 OOng/化，引物的浓度为1 OuM。
[0043] 步骤B2中，使用的PCR扩增程序为:进行25个循环，其中每个循环依次包括W下步 骤:在98°C溫度下预变性10s，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25个 循环之后，即完成PCR扩增程序。
[0044] 步骤步骤C4完成之后，还包括巧、病毒效价检测：用病毒效价检测试剂盒检测病毒 效价。
[0045] 根据本发明的实施例，使用病毒效价检测试剂盒检测时，病毒效价的标准曲线如 图2所示，病毒效价的检测结果如表2所示：
[0046] 本发明还公开了，所述慢病毒制备方法制备得到的慢病毒在感染T细胞中的应用。
[0047] 本发明的实施例2,公开了一例慢病毒感染T细胞及效果检测的实施例。从实施例 能够看出，通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可W不需要添加 CD28,仅在转染前，于 培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少化r-T细胞制备的程序，降低成 本及污染风险;通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率W有效提 高感染效率。
[0048] 为进一步明确本发明中的技术方案，做出W下说明，未进行着重说明的，均为行业 通用术语，在此就不在寶述。
[0049] CD137(4-1BB)是人类与小鼠4-1BB同源的细胞表达分子，为I型糖蛋白，属于肿瘤 坏死因子受体(TNFR)超家族成员，是除CD28/B7之外的另一重要的介导T细胞活化的共刺激 分子，CD137能激活下游的JNK，p38，MAPK和NFkB等信号途径，通过W下几个途径发挥抗肿瘤 效应:增强肿瘤特异性T细胞的增殖和活化;提高肿瘤特异性T细胞的肿瘤趋向性;促进肿瘤 抗原记忆性CD8巧细胞的产生；阻止活化诱导T细胞的死亡。将CD137作为刺激T细胞活化的 协同信号，结合慢病毒包装和T细胞活化方式的改进，重组到VSVG中，与祀向载体一同包装 成慢病毒，在早期和长期活化T细胞方面均具有积极意义。携带4-1BB-VSVG的慢病毒可W与 T淋己细胞表面的CD137结合，加强慢病毒与T淋己细胞的接触，有利于提高慢病毒感染效 率。
[0050] 在本发明中，VSVG的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0051 ] VSVG的结构图如图3所示；
[0化2] 4-1BB的核巧酸序列如沈Q ID NO:2所示；
[0化3] 4-188-￥5￥6的核巧酸序列如沈9 10備:3所示；
[0054] 4-188-￥5￥6的氨基酸序列如沈9 10備:4所示；
[0化5] 4-1BB-VSVG的结构图如图4所示。
【附图说明】
[0056] 图1为现有技术中T细胞活化过程的示意图；
[0057] 图2是实施例中使用病毒效价检测试剂盒检测时，病毒效价的标准曲线图；
[0化引图3是VSVG的结构图；
[0化9] 图4是4-1BB-VSVG的结构图；
[0060]图5是实施例2中感染效率的结果图；
[0061 ]图6是实施例2中CD69阳性表达率的结果图。
【具体实施方式】
[0062]下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限 于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0063] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均 可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规 方法。
[0064] 实施例1
[0065] -种包含4-1BB的慢病毒制备方法，包括W下步骤：
[0066] A、慢病毒载体质粒881-3-SJ19的构建：
[0067] A1、对CD19CAR基因进行PCR扩增：W全基因合成CD19CAR基因为模板，进行PCR扩 增，得到CD19CAR扩增产物；
[0068] 步骤Al中，所述PCR反应体系的总体积为50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq缓冲液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为 2.5mM，模板的浓度为1 OOng/化，引物的浓度为1 OuM;
[0069] 使用的PCR扩增程序为:进行25个循环，其中每个循环依次包括W下步骤:在98°C 溫度下预变性IOs，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25个循环之后， 即完成PCR扩增程序。
[0070] A2、凝胶提纯CD19CAR扩增产物:使用凝胶提纯PCR扩增产物中CD19CAR的cDNA;
[0071] A3、用CD19CAR基因转染细胞:将步骤A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和 Solution r混合均匀，在16°C下保存16小时;然后加入化an巧a感受态细胞中，依次在冰中 保持30min，然后加热至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin，然后加入S0C/LB培养基，在37 °C 振荡培养60分钟，培养后离屯、，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在含有Amp的琼脂平板培 养基上培养；
[0072] A4、提取含有CD19CAR基因的质粒:从琼脂平板培养基上挑取881-3-SJ19质粒；
[0073] A5、酶切检测:依次进行酶切步骤和连接反应检测所述881-3-SJ19质粒的序列;使 用的酶切体系为:2化的881-3-SJ19质粒、1化的缓冲液、0.5化的趾Ol酶和6.扣L的d地2〇;使 用的连接体系为:2iiL的慢病毒载体、化L的缓冲液、0.5iiL的甜al酶和6.化L的dd出0
[0074] 其中，凝胶提纯CD19CAR扩增产物的操作包括W下步骤：
[0075] 1.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，切碎胶块。
[0076] 2.称重胶块重量，计算胶块体积，Wlmg =化L计算，向胶块中加入Buffer GM(3个 凝胶体积量）。
[0077] 3.均匀混合后37°C水浴溶解，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5-10分 钟)。
[0078] 4.当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为澄色或粉 色，向上述胶块溶解液中加入3M醋酸钢溶液(P册.2) 1化1，均匀混合至溶液恢复黄色。当分 离小于40化P的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
[OOW] 5.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection l\ibe上。
[0080] 6.将上述操作步骤4的溶液转移至Spin Column中，12,00化pm离屯、I分钟，弃滤液。
[0081 ] 7.将70化1的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12，000巧m离屯、30秒钟，弃滤液。
[0082] 8.再加入70化1 的BufferWB，将Spin Column安置于Collection l\ibe上，室溫 12， 000巧m离屯、1分钟。
[0083] 9.将Spin Column安置于新的1.5ml的离屯、管上，在Spin Colu皿膜的中央处加入 30iil灭菌蒸馈水或Elution Buffer(加热至60°C使用时有利于提高洗脱效率。）室溫静置I 分钟。室溫12000巧m离屯、1分钟洗脱DNA。
[0084] 其中，Buffer GM使用量见表1
[0085] 表1:Buffer GM使用量表 「nnoi： 1 LUUB/j B、VSVG顶禪的巧造：
[008引 B1、对4-1BB基因进行PCR扩增：w全基因合成4-1BB的基因片段为模板，进行PCR扩 增，得到4-WB扩增产物；
[0089] 步骤Bl中，所述PCR反应体系的总体积为50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq缓冲液、4化的dNTP、2化的模板和4化引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为 2.5mM，模板的浓度为1 OOng/化，引物的浓度为1 OuM。
[0090] 使用的PCR扩增程序为:进行25个循环，其中每个循环依次包括W下步骤:在98°C 溫度下预变性IOs，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25个循环之后， 即完成PCR扩增程序。
[0091] B2、对VSVG基因进行PCR扩增：W全基因合成VSVG的基因片段为模板，进行PCR扩 增，得到VSVG扩增产物；
[0092] 所述PCR反应体系的总体积为50化:包括0.25化的Ex Taq酶、5化的Ex Taq缓冲液、 4化的dNTP、2化的模板和化L引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓 度为1 OOng/化，引物的浓度为1 OuM。
[0093] 使用的PCR扩增程序为:进行25个循环，其中每个循环依次包括W下步骤:在98°C 溫度下预变性IOs，在50°C溫度下退火30s;在72°C溫度下延伸2min;在完成25个循环之后， 即完成PCR扩增程序。
[0094] B3、获得4-1BB-VSVG重组基因片段:将所述4-1BB扩增产物和VSVG扩增产物进行酶 切，并回收酶切产物进行连接反应，得到连接产物；
[00巧]B4、用4-1BB-VSVG重组基因片段转染细胞:将步骤B3得到的连接产物加入TOPlO感 受态细胞中，混合均匀后依次在冰中保持30min，然后加热至42°C保持45s，再在冰中保持 Imin，然后加入S0C/LB培养基，在37 °C振荡培养60分钟，培养后离屯、，弃部分上清液后，将剩 余液体涂布在琼脂平板培养基上培养；
[0096] B5、改造 VSVG质粒的提取:用碱裂解法或质粒抽提试剂盒提取改造的VSVG质粒，命 名为4-1BB-VSVG质粒；
[0097] C、慢病毒的制备：
[009引 CU配制肥S溶液：将IOml 1.4M的化Cl、5ml 0.5M的邸S、500化150mM的化抽P04和 110化L IM的NaOH混合均匀、加双蒸水定容至50ml、调PH至6.95，过滤后保存，即为邸S溶液； [0099] C2、配制转染试剂:将步骤A4得到的881-3-SJ19质粒、NRF质粒、步骤B5得到的4- IBB-VSVG质粒、IM CaC12和双蒸水，混合均匀后，逐滴加入步骤Cl得到的邸S溶液，滴加完毕 后，静置30min;即得转染试剂；
[0100] C3、细胞转染和培养:提前两周复苏293T细胞，在IOcm培养皿内进行培养，每日观 察细胞；待细胞铺满2层左右，将1盘细胞消化传代至10盘，每日观察，至细胞密度达皿底 70 %左右时可进行转染。转染前，用8ml不含血清的DMEM培养基换液;换液后，逐滴加入步骤 C2得到的转染试剂，缓缓吹打混匀W上转染试剂，每盘细胞取Iml该试剂，逐滴均匀地加入 到已换液的293T细胞中。将培养皿前后方向、左右方向各轻轻晃动数十次混匀，将细胞放入 培养箱，静置2小时。每盘细胞补加 Iml胎牛血清，逐滴均匀地加入后，将培养皿前后方向、左 右方向各轻轻晃动数十次混匀，将细胞放入培养箱。约化后，每盘细胞用IOml含10%胎牛血 清的DMEM换液，将培养箱的C02浓度调整为3% ;
[0101] C4、病毒收集：步骤C3完成后，收集上清（共100ml)，1200rpm离屯、5min，0.2化m (PES)滤膜过滤上清，即为病毒原液。
[0102] C5、病毒效价检测：用病毒效价检测试剂盒检测病毒效价，检测结果约为lOVml， 病毒效价的标准曲线如图2所示，病毒效价的检测结果如表2所示：
[0103] 表2:病毒效价的检测结果表 「01041
[0105] 实施例2
[0106] 慢病毒感染T细胞及效果检测
[0107] 1、机采获取约1 X IO7个单核淋己细胞；Ficoll分离出单个核细胞，加含IL-2 (lOOOU/ml)的vivol5培养基进行培养，加少量CD3抗体刺激（lOOug/ml)。感染前将细胞浓度 调整为1 X IO^ml，取体积Iml，6孔板内培养;按MOI = 5来计算病毒量，加入病毒浓缩液前， 加入1ml完全培养液悬浮，0.22um过滤。加入病毒后，轻轻混匀，放入培养箱培养3天后，洗去 病毒继续培养。
[010引 2、感染效率检测
[0109] 收集5 X 1〇5细胞；用buff er(PBS+2%BSA)洗S次；细胞重悬于200化的buff er，加 Iug的protein kbiotin，4°C45min;用buffer洗一次；细胞重悬于200化的buffer，加 IOuL 的SA-PE(加 g/ml)，同时加化LCD3-APC，避光，4 °C 25min;用buf f er洗一次，用buf f er悬浮至 流式检测阳及APC巧光。VSVG重组后，感染效率由27.41 %提高至65.18 %，结果如图5 所示。
[0110] 3、活化效率检测
[011U 收集2 X 105细胞；用buff er(PBS+2%854)洗；次；细胞重悬于200化的buff er，加 2ug的CD69-門TC，4°C避光解育30min;用buff er洗一次，用buf fer悬浮至200化;流式检测巧 光。活化效率约为45%，可见改造后的慢病毒可W有效激活T细胞，结果如图6所示。
[0112]最后所应说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，W上所述仅为本发明的具体实施 方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种包含4-1BB的慢病毒制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 慢病毒载体质粒881-3-SJ19的构建： Al、对⑶19CAR基因进行PCR扩增：以全基因合成⑶19CAR基因为模板，进行PCR扩增，得 到CD19CAR扩增产物； A2、凝胶提纯CD19CAR扩增产物:使用凝胶提纯PCR扩增产物中CD19CAR的cDNA; A3、用CD19CAR基因转染细胞：将步骤A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和 Solution I混合均匀，在16°C下保存16小时;然后加入Trans5a感受态细胞中，依次在冰中 保持30min，然后加热至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin，然后加入S0C/LB培养基，在37 °C 振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在含有Amp的琼脂平板培 养基上培养； A4、提取含有⑶19CAR基因的质粒:从琼脂平板培养基上挑取881-3-SJ19质粒； B、 VSVG质粒的改造： Bl、对4-1BB基因进行PCR扩增：以全基因合成4-1BB的基因片段为模板，进行PCR扩增， 得到4-WB扩增产物； B2、对VSVG基因进行PCR扩增：以全基因合成VSVG的基因片段为模板，进行PCR扩增，得 到VSVG扩增产物； B3、获得4-1BB-VSVG重组基因片段:将所述4-1BB扩增产物和VSVG扩增产物进行酶切， 并回收酶切产物进行连接反应，得到连接产物； B4、用4-1BB-VSVG重组基因片段转染细胞:将步骤B3得到的连接产物加入TOPlO感受态 细胞中，混合均匀后依次在冰中保持30min，然后加热至42 °C保持45s，再在冰中保持Imin， 然后加入S0C/LB培养基，在37 °C振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液 体涂布在琼脂平板培养基上培养； B5、改造 VSVG质粒的提取:用碱裂解法或质粒抽提试剂盒提取改造的VSVG质粒，命名为 4-1BB-VSVG 质粒； C、 慢病毒的制备： C1、配制BES溶液：将IOml 1.4M的NaCl、5ml 0.5M的BES、500yL 150mM的Na 2HP〇4和 1100 yL IM的NaOH混合均匀、加双蒸水定容至50ml、调PH至6.95，过滤后保存，即为BES溶液； C2、配制转染试剂：将步骤A4得到的881-3-SJ19质粒、NRF质粒、步骤B5得到的4-1BB-VSVG质粒、IM CaCl2和双蒸水，混合均匀后，逐滴加入步骤Cl得到的BES溶液，滴加完毕后， 静置30min;即得转染试剂； C3、细胞转染和培养:复苏293T细胞并进行培养，当所述293T细胞密度达到培养皿底部 70 %时进行转染，用不含血清的DMEM培养基对所述293T细胞进行换液;换液后，逐滴加入步 骤C2得到的转染试剂，混合均匀后，将所述293T细胞放入培养箱，静置2小时，静止后滴加胎 牛血清，继续培养8小时，然后使用含IOwt %胎牛血清的DMEM换液，继续培养48小时； C4、病毒收集:步骤C3完成后，收集上清液，离心过滤后，即得病毒原液。2. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤Al中，所述PCR反应体系的 总体积为50yL:包括0 · 25yL的Ex Taq酶、5yL的Ex Taq缓冲液、4yL的dNTP、2yL的模板和4yL 引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为lOOng/yL，引物的浓度为 IOuM03. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤Al中，使用的PCR扩增程序 为:进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤:在98°C温度下预变性10s，在50°C温度 下退火30s;在72°C温度下延伸2min;在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。4. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤A4完成之后，还包括A5、酶 切检测：依次进行酶切步骤和连接反应检测所述881-3-SJ19质粒的序列；使用的酶切体系 为：2yL的881-3-SJ19质粒、IyL的缓冲液、0.5yL的XhoI酶和6.5yL的ddH 20;使用的连接体系 为:2yL的慢病毒载体、IyL的缓冲液、0.5yL的Xba頂每和6.5yL的ddH 20。5. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤BI中，所述PCR反应体系的 总体积为50yL:包括0 · 25yL的Ex Taq酶、5yL的Ex Taq缓冲液、4yL的dNTP、2yL的模板和4yL 引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为lOOng/yL，引物的浓度为 IOuM06. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤Bl中，使用的PCR扩增程序 为:进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤:在98°C温度下预变性10s，在50°C温度 下退火30s;在72°C温度下延伸2min;在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。7. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤B2中，所述PCR反应体系的 总体积为50yL:包括0 · 25yL的Ex Taq酶、5yL的Ex Taq缓冲液、4yL的dNTP、2yL的模板和4yL 引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为lOOng/yL，引物的浓度为 IOuM08. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤B2中，使用的PCR扩增程序 为:进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤:在98°C温度下预变性10s，在50°C温度 下退火30s;在72°C温度下延伸2min;在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。9. 根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤步骤C4完成之后，还包括 C5、病毒效价检测：用病毒效价检测试剂盒检测病毒效价。10. 权利要求1-9任一所述慢病毒制备方法制备得到的慢病毒在感染T细胞中的应用。
【文档编号】C12N15/867GK105925544SQ201610482530
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】董坚, 杨益, 刘玉芝, 何群, 周棠怡, 梁福蓉
【申请人】武汉思安医疗技术有限公司