一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法
【专利摘要】一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，属于微生物农药生产技术领域。该方法以灰茶尺蠖为增殖载体生产茶尺蠖核型多角体病毒。本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：（1）以灰茶尺蠖作为增殖载体，克服了在病毒生产的首要环节即健虫大量饲养环节幼虫易被病毒感染的不足；（2）通过使用相应的饲毒技术参数，用灰茶尺蠖增殖EoNPV的病毒单产不低于用茶尺蠖增殖，总产量高于用茶尺蠖增殖。
【专利说明】
一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法
技术领域
[0001]本发明属于微生物农药生产技术领域，具体涉及一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法。
【背景技术】
[0002]茶尺蠖(fciropisobliqua Prout)和灰茶尺蠖(fciropis grisescens Warren)在我国茶区分布普遍，是我国茶树上最主要的两种尺蠖类害虫。由于其发生代数多、繁殖速度快，常暴发成灾，对茶叶产量、品质影响很大。茶尺蠖核型多角体病毒(Ec tropis obiiquanuclear polyhedrosis virus，简称EoNPV))是茶尺蠖(i?.0bliqua Prout)的病原天敌优势种，是田间控制茶尺蠖种群的重要因子。该病毒也可感染灰茶尺蠖U.grisescensWarren)，但对灰茶尺蠖的致病率远低于茶尺蠖。
[0003]—直以来，茶尺蠖核型多角体病毒的生产采用的是以茶尺蠖为增殖载体的活虫增殖法，即通过大量饲养茶尺蠖，再通过茶尺蠖幼虫活体增殖茶尺蠖病毒，进行病毒大量生产。其生产流程为:首先大量饲养茶尺蠖健康幼虫，在达到一定虫龄时(3龄中期)饲喂一定浓度(5X105 PIB/mL?lX106 PIB/mL)的EoNPV病毒，待病毒在虫体中增殖一定时间后，虫体开始解体，收集死虫，提取出病毒。在活虫增殖法中，健虫饲养是病毒生产的首要环节。昆虫的大量饲养是病毒生产的关键。
[0004]目前，在茶尺蠖病毒生产中存在的最主要问题是，健虫在饲养过程中易遭病毒感染致死。由于茶尺蠖核型多角体病毒对茶尺蠖幼虫具有高致病力，在健虫大量饲养过程中极易出现低龄期幼虫病毒感染的情况。在生产过程中，稍有不慎就会出现整批健虫在病毒增殖步骤之前就感染病毒而提早死亡，从而导致病毒增殖失败。更有甚者，会出现健虫保种困难、室内饲养中断的现象。因此，寻找一种新的病毒生产方法，确保健虫大量饲养连续、抗病毒感染是目前亟需解决的技术问题。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种茶尺蠖核型多角体病毒生产的方法的技术方案，该方法健虫大量饲养存活率高，病毒总产量高。
[0006]所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于以灰茶尺蠖为增殖载体生产茶尺蠖核型多角体病毒。
[0007]所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
1)灰茶尺蠖幼虫的大量饲养；
2)茶尺蠖病毒增殖
在灰茶尺蠖幼虫生长至2龄时，用I X 17多角体(PIB)/毫升EoNPV病毒液将虫枝全部喷湿，饲毒5?7天后添加不含病毒的茶枝继续饲养，饲养温度22?24°C，自然光照；
3)病毒收集
待出现死亡虫体时，每日收集死亡虫尸； 4)病毒提取
将收集得到的虫尸加少量水浸泡2?3天后，研磨过滤，取滤液先置于2000mL量筒中进行自然沉淀，待分层后，立即吸取上层液进行离心沉淀，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，显微测数后计算病毒含量，定量稀释成病毒原液，低温冷藏备用。
[0008]所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤I)中灰茶尺蠖幼虫的大量饲养具体为:用养虫笼群体饲养灰茶尺蠖成虫，笼纱外侧附白纸任其产卵；第二天用毛笔刷下虫卵，将卵分放在500mL广口玻璃瓶中饲养;卵孵化后，用嫩茶叶在瓶中饲养;饲养I?2天后，将虫连同茶叶转移到水培的茶树枝条上饲养，饲养温度22?24°C，自然光照。
[0009]所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤3)中虫尸集中放置在广口瓶中，室温保存;不马上提取，则4°C低温保存。
[0010]所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤4)中离心条件3000?4000r/min离心30min，连续离心2次。
[0011]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:(I)以灰茶尺蠖作为增殖载体，克服了在病毒生产的首要环节即健虫大量饲养环节幼虫易被病毒感染的不足；(2)通过使用相应的饲毒技术参数，用灰茶尺蠖增殖EoNPV的病毒单产不低于用茶尺蠖增殖，总产量高于用茶尺蠖增殖。
【具体实施方式】
[0012]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0013]实施例1:
首先进行灰茶尺蠖幼虫的大量饲养。用养虫笼(长25cm X宽25cm X高45cm，塑料纱网)群体饲养灰茶尺蠖成虫(每笼放置800-1000个蛹)，笼纱外侧附白纸任其产卵；第二天用毛笔刷下虫卵，将卵分放在500mL广口玻璃瓶中，用白纸和橡皮筋封口。卵孵化后，先用嫩茶叶在瓶中饲养。饲养I?2天后，将虫连同茶叶转移到水培的茶树枝条上饲养，即从田间剪取茶枝，成束插在500mL盛水的广口瓶中，将3?4瓶茶枝靠拢放在直径60cm的塑料盆内；将瓶中饲养的I龄幼虫倒出置于茶蓬上，任其在茶蓬上扩散取食。根据茶叶被取食情况，适时添加或更换茶枝。饲养至2龄时，大部分虫移至病毒室用于病毒繁殖，小部分虫用于繁殖后代继续饲养。幼虫老熟时会下坠掉落在盆内化蛹。饲养条件为恒温22?24°C，自然光照。
[0014]在幼虫饲养至2龄时进行饲毒。即用小喷雾器将I X 107PIB/mL的EoNPV病毒液均匀喷在插枝水培的的新鲜茶枝上，待病毒液干后，将饲养的2龄灰茶尺蠖幼虫敲落至茶枝上，任其取食带病毒叶片。或者用小喷雾器将I X 107PIB/mL的EoNPV病毒液直接喷洒在带虫的茶枝上，当叶片多数被取食时添加带病毒的新枝。饲毒5?7天后，将已取食病毒的灰茶尺蠖幼虫移接到养虫盒中，用无病毒叶片继续饲养。每盒接虫500?800头，盒盖上盖一块玻璃保湿。
[0015]饲养一定时间(一般12?15天)，幼虫开始死亡时进行病毒的收集保存。每天将死虫收集在罐头瓶中，一天收集I?2次。每瓶放置虫尸200?300头，于室温保存。如不需马上提纯病毒，可将3?4瓶虫尸合并后转移到4°C的冰箱中冷藏保存。
[0016]病毒提取前，将虫尸用少量无菌水(以刚浸没虫尸为度)浸泡I?2天。然后，用组织捣碎机将虫尸捣碎，过滤后将滤液先倒入2000mL量筒中进行自然沉淀，待分层后，立即吸取上层液，再将上层液进行离心沉淀。用离心机以3000?4000r/min离心30min，去上清液，病毒多角体沉淀搅匀后加水再离心I次，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，获得病毒原液。采用血球计数板计数法测定病毒多角体的数量，计算病毒产量。
[0017]上述病毒生产过程中饲养温度均控制在恒温22?24°C左右，自然光照。
[0018]上述茶尺蠖核型多角体病毒的生产工艺，同现行生产工艺相比，具有两大优点:
(I)健虫饲养存活率高。本发明以灰茶尺蠖作为病毒增殖的载体，克服了健虫大量饲养环节幼虫易被病毒感染的不足。EoNPV对茶尺蠖的致病力远高于对灰茶尺蠖。以2龄幼虫感染病毒9天后为例，EoNPV对茶尺蠖幼虫的致死中浓度(LC5q)为1.26 X 103PIB/mL，而对灰茶尺蠖幼虫的LC5q则为2.32 X 106PIB/mL，两者相差近两千倍。在低龄幼虫期，茶尺蠖幼虫稍有病毒感染就可能出现大量死亡，而灰茶尺蠖幼虫即使同样感染病毒也不会出现死亡或死亡率很低。健虫饲养的高存活率确保了病毒生产的后续环节和整个生产的连续性。(2)病毒总产量高。本发明采取适用于灰茶尺蠖的饲毒技术参数，即采用2龄期饲毒、饲毒浓度I X 17PIB/mL，可以获得高于茶尺蠖增殖的病毒总产量。相对于过去以茶尺蠖增殖EoNPV的生产方法，本发明提早I个龄期进行饲毒，并将饲毒浓度提高了 I个数量级。一方面缩短了健虫饲养的时期，减少了健虫饲养的死亡损失，另一方面，尽管EoNPV对灰茶尺蠖致病力远低于茶尺蠖，但运用该技术参数仍然可以获得较高的病毒单产。试验表明，用灰茶尺蠖增殖的病毒单产不低于茶尺蠖，病毒的总产量高于用茶尺蠖增殖。
【主权项】
1.一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于以灰茶尺蠖为增殖载体生产茶尺蠖核型多角体病毒。2.如权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤: 1)灰茶尺蠖幼虫的大量饲养； 2)茶尺蠖病毒增殖 在灰茶尺蠖幼虫生长至2龄时，用I X 17多角体(PIB)/毫升EoNPV病毒液将虫枝全部喷湿，饲毒5?7天后添加不含病毒的茶枝继续饲养，饲养温度22?24°C，自然光照； 3)病毒收集 待出现死亡虫体时，每日收集死亡虫尸； 4)病毒提取 将收集得到的虫尸加少量水浸泡2?3天后，研磨过滤，取滤液先置于2000mL量筒中进行自然沉淀，分层后立即吸取上层液，再对上层液进行离心，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，显微测数后计算病毒含量，定量稀释成病毒原液，低温冷藏备用。3.如权利要求2所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤I)中灰茶尺蠖幼虫的大量饲养具体为:用养虫笼群体饲养灰茶尺蠖成虫，笼纱外侧附白纸任其产卵;第二天用毛笔刷下虫卵，将卵分放在500mL广口玻璃瓶中饲养;卵孵化后，用嫩茶叶在瓶中饲养;饲养I?2天后，将虫连同茶叶转移到水培的茶树枝条上饲养，饲养温度22?24 °C，自然光照。4.如权利要求2所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤3)中虫尸集中放置在广口瓶中，室温保存;不马上提取，则4°C低温保存。5.如权利要求2所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤4)中离心条件3000?4000r/min离心30min，连续离心2次。
【文档编号】C12N7/00GK105925540SQ201610313714
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】唐美君, 殷坤山, 郭华伟, 肖强, 孙亮
【申请人】中国农业科学院茶叶研究所