专利名称：一种利用棉铃虫核型多角体蛋白制备铂纳米粒子的方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米材料的制备方法，特别是制备贵金属钼纳米粒子的方法。
背景技术：
贵金属纳米材料由于具有良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、光学效应和良好的生物相容性等特点，在光学、传感器、催化和生物检测分析等领域具有重要的应用价值，因而越来越受到人们的广泛关注。近年来研究热点集中在通过控制纳米粒子的尺寸、形貌及其复合结构来制备可调控的新型纳米粒子。目前贵金属钼纳米粒子的制备方法很多，但是要获得结构、形态、尺寸可调控、分布均匀、稳定性较好的贵金属钼纳米粒子依然比较困难。近年来，人们常采用不同形态的碳材料或者其他模板作为载体来控制小粒径贵金属钼纳米粒子的生长及分布。例如，Ping Lin K μ ο等人(ACS.Appl.Mate.1nterfaces.2011，3，115-118)和 Robert VHyll 等人(Chem.Mater.2006，18，1780-1788)分别报道了利用多孔碳纳米管和多壁碳纳米管制备分散的钼纳米粒子，由于作为负载的碳材料本身缺乏活性吸附基团，在制备过程中需要经过前期处理引入可以与贵金属结合的基团。这些操作使得制备工艺复杂化，提高了生产成本，并且所得到的金属粒子的分布具有很大的随机性。Dan Wen等发表在《物理化学C》(J.Phys.Chem.C.2009，113，13023-13028)文章中报道了 TiO2胶体球负载Pt纳米粒子的制备，制备的产物可以用于生物传感器材料。然而，由于TiO2本身缺乏吸附基团，很难使贵金属纳米粒子附着于其表面，需要加入氨丙基三甲氧基硅烷以引入NH2_作为中间体来连接TiO2与贵金属粒子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够通过控制蛋白的碱解度有效的控制贵金属钼纳米粒子的分布，制备条件温和、产率高、工艺简单，并且该方法直接采用自然界存在的生物蛋白纳米结构做为贵金属钼纳米粒子的载体，来源广泛，重复性高，生产成本低的一种利用棉铃虫核型多角体蛋白制备钼纳米粒子的方法。本发明主要是采用天然的棉铃虫核型多角体蛋白作为载体控制合成高度分散的贵金属钼纳米粒子。本发明首先对棉铃虫核型多角体进行纯化碱解，得到多角体蛋白片，然后加入PtCl4溶液进行共孵化，使得贵金属离子吸附到核型多角体蛋白表面含的特定官能团(如巯基官能团)的活性位点上，孵化特定时间后通过超声辅助共还原处理，在蛋白表面就形成了排布有序，尺寸均勻的贵金属Pt纳米粒子。本发明的技术方案具体包括如下步骤:( I)棉铃虫核型多角体的纯化和碱解:将0.5 1.0g棉铃虫核型多角体病毒原粉溶于60 IOOmL超纯水中，超声促进其溶解。本发明所用的超纯水均由超纯水仪制备。500 1200r/min离心5 IOmin后取上清,3000 5000r/min离心20 30min后取沉淀,沉淀用超纯水重悬。如此低速,高速反复离心3 5次，至最后一次高速离心的上清无色澄清为止，即得到较纯净的多角体。将所得多角体用1.5 2.5mL冷的超纯水重悬，加入150 250 μ L碱解液处理10 25min。上述的碱解液为0.3mol/L碳酸钠，0.5mol/L氯化钠和0.03mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液。然后用0.5mol/L的冰醋酸调节pH至7 8，5000 7000r/min离心2 3次，取上清液。后在4 10°C，25000 30000r/min下超速离心I 2h，弃去上清液后将所得沉淀斑用I 2mL超纯水重悬。(2)制备棉铃虫核型多角体蛋白负载的贵金属钼纳米粒子:取100 300 μ L碱解处理的棉铃虫核型多角体蛋白液体加入100 300 μ L浓度为I IOmM的PtCl4溶液中，充分混匀，于20 30°C，130 170r/min下摇床孵化15 25h。然后逐滴加入50 100 μ L新配制的浓度为5 IOmM的NaBH4溶液，边超声边还原。还原后于20 30°C，130 170r/min下摇床孵化3 6h，即得到棉铃虫核型多角体蛋白负载贵金属钼纳米粒子。由于生物蛋白包含各种活性基团、氨基酸序列排布规则、可生物降解、生物兼容、具有完善且严格的分子识别功能，在贵金属钼纳米粒子制备中既可作为保护剂或调控剂制备不同尺寸、形貌的贵金属钼纳米粒子，又可作为引导剂规则排列贵金属钼纳米粒子。同时生物分子自身的结构特征及其空间限域效应可以对纳米粒子的合成进行精确调控，从而得到具有预期尺寸大小且排布规则的纳米粒子。本发明采用的棉铃虫核型多角体蛋白是棉铃虫核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生的，自身形成结构致密的超大分子蛋白质晶体。棉铃虫核型多角体蛋白是由一种致密的三聚体的亚基结构构成，三聚体之间通过二硫键连接。这种蛋白质晶体结构的一个重复单元的理论长度为10nm，每个三聚体长度为5nm。这种特定的结构重复性排布，其外表面富含大量的氨基酸，所含有的活性官能团能够吸附多种金属离子到其表面。而且该蛋白一个显著特点就是还可以通过调节多角体的碱解时间来调节蛋白的碱解度，进而控制贵金属钼纳米粒子的分布。所述的贵金属钼纳米粒子具有以下结构特征:棉铃虫核型多角体蛋白结构规则，单层蛋白呈现有序的网格状结构，而且蛋白表面有特定的活性位点容易与金属离子结合。所得贵金属钼纳米粒子均匀分布在蛋白表面，分散度高，粒子的大小、分散度与棉铃虫核型多角体蛋白一致。这种方法不但减少了传统钼纳米粒子载体复杂的制备工艺，而且无需引入外源活性基团，蛋白本身含有的活性官能团即作为调控剂控制了钼纳米粒子的尺寸，又作为引导剂控制钼纳米粒子的排布和分散度。本发明的有益效果是:直接采用天然的棉铃虫核型多角体蛋白作为载体，不用进行任何特殊处理，经过与材料体系共孵化，超声辅助共还原处理，即可获得棉铃虫核型多角体蛋白负载的贵金属钼纳米粒子。与现有的碳材料和多孔氧化物作为载体调控生长的贵金属钼纳米粒子相比，本发明得到的贵金属钼纳米粒子具有尺寸小、粒径分布更均匀、分散高等优点。该制备方法工艺简单，条件温和，环保高效，且载体来源广泛易得，成本低廉，易于实现大规模生产。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的阐述。
图1是碱解15min得到的棉铃虫核型多角体蛋白的TEM图；图2是制备的碱解15min的棉铃虫核型多角体蛋白负载的钼纳米粒子的 Μ图；图3是碱解25min得到的棉铃虫核型多角体蛋白的TEM图；图4是制备的碱解25min的棉铃虫核型多角体蛋白负载的钼纳米粒子的 Μ图。
具体实施例方式实施例1 将0.5g棉铃虫核型多角体病毒原粉溶于60mL超纯水中，超声促进其溶解。所用的超纯水均由英国海威考姆勃市威望迪纯水系统有限责任公司生产的PL5124-PALL型号超纯水仪制备的。1000r/min离心IOmin后取上清,4000r/min离心30min后取沉淀,沉淀用超纯水重悬。如此低速，高速反复离心4次，至最后一次高速离心的上清无色澄清为止，即得到较纯净的多角体。将所得多角体用2mL冷的超纯水重悬,加入200 μ I碱解液处理15min。然后用0.5mol/L的冰醋酸调节pH至7,5000r/min离心5min后取上清液,6000r/min离心5min取上清液,7000r/min离心5min,取上清液。后在4°C, 28000r/min下超速离心Ih,弃去上清液后将所得沉淀斑用1.5mL超纯水重悬。透射电镜下观察其形貌见图1。图1为实施例I纯化和碱解后的棉铃虫核型多角体蛋白的 Μ图，从图中可以看出所得的棉铃虫核型多角体蛋白呈现单层的网格状结构，单个格为一个三聚体呈菱形，近似为正方形，大小为5nm，多个三聚体重复排列形成网状蛋白片，蛋白片的大小为20 80nm，主要集中为40 50nm。每个三聚体上都有活性官能团，为贵金属粒子的形核提供位点，同时其空间限位效应限制了贵金属钼纳米粒子的粒径为4 5nm。取200 μ L碱解处理的棉铃虫核型多角体蛋白液体加入100 μ L浓度为5mM的PtCl4溶液，充分混匀，于25°C，140r/min下摇床孵化24h。然后逐滴加入75 μ L新配制的浓度为5mM的NaBH4溶液，边超 声边还原。还原后于25°C，140r/min下摇床孵化6h，即得到棉铃虫核型多角体蛋白负载的钼纳米粒子。透射电镜下观察其形貌见图2。图2为实施例1制备的棉铃虫核型多角体负载的钼纳米粒子的TEM图，从图中可以所得的钼纳米粒子均匀的分散，大小和形状与核型多角体蛋白基本一致，单个纳米粒子粒径为4 5nm，没有团聚现象。实施例2将0.5g棉铃虫核型多角体病毒原粉溶于60mL超纯水中，超声促进其溶解。所用的超纯水均由英国海威考姆勃市威望迪纯水系统有限责任公司生产的PL5124-PALL型号超纯水仪制备的。1000r/min离心IOmin后取上清,4000r/min离心25min后取沉淀,沉淀用超纯水重悬。如此低速，高速反复离心4次，至最后一次高速离心的上清无色澄清为止，即得到较纯净的多角体。将所得多角体用1.5mL冷的超纯水重悬，加入200 μ I碱解液处理15min。然后用0.5mol/L的冰醋酸调节pH至7, 5000r/min离心5min后取上清液,6000r/min离心5min取上清液,7000r/min离心5min,取上清液。后在4°C, 28000r/min下超速离心1.5h,弃去上清液后将所得沉淀斑用1.5mL超纯水重悬。取300 μ L碱解处理的棉铃虫核型多角体蛋白液体加入100 μ L浓度为5mM的PtCl4溶液，充分混匀，于25°C，140r/min下摇床孵化24h。然后逐滴加入75 μ L新配制的浓度为5mM的NaBH4溶液，边超声边还原。还原后于25°C，140r/min下摇床孵化6h，即得到棉铃虫核型多角体蛋白负载的钼纳米粒子。
实施例3将0.5g棉铃虫核型多角体病毒原粉溶于60mL超纯水中，超声促进其溶解。所用的超纯水均由英国海威考姆勃市威望迪纯水系统有限责任公司生产的PL5124-PALL型号超纯水仪制备的。500r/min离心IOmin后取上清,4000r/min离心20min后取沉淀,沉淀用超纯水重悬。如此低速，高速反复离心3次，至最后一次高速离心的上清无色澄清为止，即得到较纯净的多角体。将所得多角体用2mL冷的超纯水重悬,加入200 μ I碱解液处理25min。然后用0.5mol/L的冰醋酸调节pH至7,5000r/min离心5min后取上清液,6000r/min离心5min取上清液,7000r/min离心5min,取上清液。后在4°C, 28000r/min下超速离心Ih,弃去上清液后将所得沉淀斑用1.5mL超纯水重悬。透射电镜下观察其形貌见图3。图3为实施例3纯化和碱解后的棉铃虫核型多角体蛋白的TEM图，从图中可以看出碱解时间加长，所得的核型多角体蛋白的蛋白片更加细碎，大小主要集中为10 20nm。取200 μ L碱解处理的棉铃虫核型多角体蛋白液体加入100 μ L浓度为5mM的PtCl4溶液，充分混匀，于25°C，140r/min下摇床孵化20h。然后逐滴加入75 μ L新配制的浓度为5mM的NaBH4溶液，边超声边还原。还原后于25°C，140r/min下摇床孵化6h，即得到棉铃虫核型多角体蛋白负载的钼纳米粒子。透射电镜下观察其形貌见图4。图4为实施例3制备的棉铃虫核型多角体负载的钼纳米粒子的TEM图，从图中可以所得的钼纳米粒子分散度高，大小和形状与核型多角体蛋白基本一致，单个纳米粒子粒径为4 5nm，没有团聚现象。实施例4将0.5g棉铃虫核型多角体病毒原粉溶于60mL超纯水中，超声促进其溶解。所用的超纯水均由英国海威考姆勃市威望迪纯水系统有限责任公司生产的PL5124-PALL型号超纯水仪制备的。500r/min离心5min后取上清,3000r/min离心30min后取沉淀,沉淀用超纯水重悬。如此低速，高速反复离心5次，至最后一次高速离心的上清无色澄清为止，即得到较纯净的多角体。将所得多角体用1.5mL冷的超纯水重悬,加入150 μ I碱解液处理IOmin0然后用0.5mol/L的冰醋酸调节pH至7, 5000r/min离心5min后取上清液,6000r/min离心5min取上清液,7000r/min离心5min,取上清液。后在4°C, 25000r/min下超速离心lh，弃去上清液后将所得沉淀斑用ImL超纯水重悬。取100 μ L碱解处理的棉铃虫核型多角体蛋白液体加入300 μ L浓度为ImM的PtCl4溶液，充分混匀，于20°C，130r/min下摇床孵化25h。然后逐滴加入50 μ L新配制的浓度为5mM的NaBH4溶液，边超声边还原。还原后于20°C，130r/min下摇床孵化6h，即得到棉铃虫核型多角体蛋白负载的钼纳米粒子。实施例5将1.0g棉铃虫核型多角体病毒原粉溶于IOOmL超纯水中，超声促进其溶解。所用的超纯水均由英国海威考姆勃市威望迪纯水系统有限责任公司生产的PL5124-PALL型号超纯水仪制备的。1200r/min离心IOmin后取上清,5000r/min离心20min后取沉淀,沉淀用超纯水重悬。如此低速，高速反复离心3次，至最后一次高速离心的上清无色澄清为止，即得到较纯净的多角体。将所得多角体用2.5mL冷的超纯水重悬，加入250 μ I碱解液处理25min。然后用0.5mol/L的冰醋酸调节pH至8, 5000r/min离心5min后取上清液,6000r/min离心5min取上清液,7000r/min离心5min,取上清液。后在10°C, 30000r/min下超速离心2h,弃去上清液后将所得沉淀斑用2mL超纯水重悬。
取300μ L碱解处理的棉铃虫核型多角体蛋白液体加入IOOyL浓度为IOmM的PtCl4溶液，充分混匀，于30°C，170r/min下摇床孵化15h。然后逐滴加入100 μ L新配制的浓度为IOmM的NaBH4溶液，边超声边还原。还原后于30°C，170r/min下摇床孵化3h，即得到棉铃虫核型多角体蛋白负载的钼纳米粒子。
权利要求
1.一种利用棉铃虫核型多角体蛋白制备钼纳米粒子的方法，其特征是:所述方法包括如下步骤: (1)棉铃虫核型多角体的纯化和碱解: 将0.5 1.0g棉铃虫核型多角体病毒原粉溶于60 IOOmL超纯水中，超声促进其溶解。500 1200r/min离心5 IOmin后取上清，3000 5000r/min离心20 30min后取沉淀，沉淀用超纯水重悬。如此低速，高速反复离心3 5次，至最后一次高速离心的上清无色澄清为止，即得到较纯净的多角体，将所得多角体用1.5 2.5mL冷的超纯水重悬，力口入150 250 μ I碱解液处理10 25min。然后用0.5mol/L的冰醋酸调节pH至7 8，5000 7000r/min离心2 3次，取上清液，后在4 10°C，25000 30000r/min下超速离心I 2h,弃去上清液后将所得沉淀斑用I 2mL超纯水重悬； (2)制备棉铃虫核型多角体蛋白负载的贵金属钼纳米粒子: 取100 300 μ L碱解处理的棉铃虫核型多角体蛋白液体加入100 300 μ L浓度为I IOmM的PtCl4溶液中，充分混匀，于20 30°C，130 170r/min下摇床孵化15 25h。然后逐滴加入50 100 μ L新配制的浓度为5 IOmM的NaBH4溶液，边超声边还原。还原后于20 3(TC, 130 170r/min下摇床孵化3 6h,即得到棉铃虫核型多角体蛋白负载贵金属钼纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的核型多角体蛋白负载的贵金属纳米粒子的制备方法，其特征是:所述的步骤(I)中的碱解液为0.3mol/L碳酸钠,0.5mol/L氯化钠和0.03mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液。
全文摘要
一种利用棉铃虫核型多角体蛋白制备贵金属铂纳米粒子的方法，该方法利用棉铃虫核型多角体蛋白固有的结构特征，将PtCl4溶液加入到提纯的棉铃虫核型多角体溶液中，经过孵化、超声辅助还原处理，即可在棉铃虫核型多角体蛋白表面获得排布均匀、粒径一致的贵金属铂纳米粒子。该方法采用的棉铃虫核型多角体蛋白载体本身具有天然的官能团重复性排布的特定结构，避免了常规载体复杂的制备工艺，从而降低了生产成本。该方法能够通过控制棉铃虫核型多角体蛋白的碱解程度从而高度有效的控制贵金属铂纳米粒子的尺寸及分布，有望在催化燃料电池或生物传感等方面有重要应用。
文档编号B82Y40/00GK103170641SQ20131008721
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者高发明, 庞桂桂, 罗京京, 李娜, 侯莉 申请人:燕山大学