专利名称：一种黑杨花粉二倍体诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种黑杨花粉诱导方法，尤其是一种黑杨花粉二倍体(2n)的诱导方法。
背景技术：
我国的杨树栽培与育种实践证明，黑杨(section Aigeiros)是我国杨树人工林重要的造林树种和育种亲本资源，但是以利用种间杂交产生杂种优势为核心的传统黑杨改良育种方法经过了半个多世纪，单株材积超过对照亲本的幅度小于50％(中国杨树杂交育种研究进展.世界林业研究，李善文等，2004)，已很难有更大的突破。要想进一步利用引进的黑杨资源，使其能在我国的工业用材林和环境保护林建设中发挥更大的作用就必须采用其它育种方法，将传统育种方法与其它育种方法结合起来，才有可能产生突破性的进展。
Zhang，S.(A report of triploid populus of the section Aigeiros.Silvae Genetica，2004)报道在我国当前推广的黑杨优良无性系中染色体计数检查出有三倍体，这些三倍体当年生苗胸径达5cm，树高5m，生长很快。由于我国目前还没有发现四倍体，他们推测这些三倍体是通过不减数的2n配子与正常的1n配子杂交而得到的。多倍体育种已在白杨派树种的育种中获得成功，我国选育的毛白杨杂种三倍体8年生时是当地普通二倍体毛白杨材积的2-3倍，国外15年生的欧美山杨三倍体是美洲山杨二倍体材积的2倍(毛白杨异源三倍体B301等无性系选育的研究，林业科学，朱之悌等，1995)，可见培育多倍体是一条非常有效的途径。利用不减数的2n花粉是培育植物多倍体的重要方法。因此，如何诱导出稳定且高产的2n花粉是培育黑杨多倍体的关键技术之一。
有关黑杨2n花粉的研究报道很少，前苏联Mashkina(Method of obtaining diploidpollen of woody species.Lesovedenie，1989)曾用高温诱导过白杨的2n花粉，文献中提到2n花粉比率高达94.4％，具体步骤包括在恒温箱内湿度为30-40％的状态下，用38-40℃高温处理几种杨树及其杂种(P.balsamifera，P.alba，P.deltoids，P.alba×P.tremula)的雄花枝1.5-2h，之后在温度18-20℃，空气湿度为70-80％的条件下水培至花粉成熟。结果发现在花粉母细胞处于减数分裂的前期I，上述处理得到最高达94.4％的杨树2n花粉。
但是，文献中未指明对黑杨进行高温诱导的效果，也没有说明每花序的产粉量情况。本发明人在利用此方法对黑杨2n花粉诱导时，发现仅一次处理在粗线期得到90.25％的2n花粉，而且这些花粉粘连在干瘪的花药内无法散出，只能将不开裂的花药人为压碎才能在显微镜下进行检测，检测中发现花药内有许多是不正常的连体花粉。由于花芽经高温诱导后不散粉或散粉量极少且所得2n花粉是不正常的连体花粉，所以难以满足培育多倍体的需要。因此前苏联Mashkina的诱导方法不适用于黑杨2n花粉的诱导。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题提供一种诱导黑杨2n花粉的方法，该方法可获得高比率且花粉量大的2n花粉，通过用所得2n花粉杂交，得到黑杨多倍体植株。
为了实现本发明目的，本发明方法采取的技术方案包括以下步骤1)于冬春季采集黑杨长花枝于室温内水培；2)待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的细线期至终变期阶段，向花芽内多次注射秋水仙碱溶液；3)继续水培花枝，直至花粉散出。
其中，注射的秋水仙碱溶液的浓度为0.2-0.8％，优选0.4-0.8％；注射秋水仙碱溶液的次数为4至5次，相邻两次注射间隔时间2至3小时。
采集的黑杨花枝长度为75-100cm，在室温下水培，温度优选15-25℃。特别是水培期间，每两天将容器内的水更换一次，保持花枝下部培养用水清洁。
黑杨种类选自山海关杨、钻天杨、欧美杨和群众杨中的一种。
特别是，黑杨花枝浸入水中的高度一般是30-40cm。
本发明黑杨2n花粉诱导方法的优点是通过诱导，极大地提高了黑杨2n花粉的比率，实验数据表明采用本发明方法诱导的黑杨，2n花粉比率达40％至95％，每花序的花粉产量是对照的0.32至2倍，诱导效果稳定。而同期天然的黑杨2n花粉比率一般低于5％。
与前苏联Mashkina(1989)诱导方法相比，本发明不仅显著地提高了黑杨2n花粉的比率，而且能够收到正常散出的花粉，因此更适用于培育多倍体的杂交授粉。
具体实施例方式
下面通过实施例详细描述本发明方法。
实施例一至六为诱导山海关杨花粉的实施例。
实施例一1.于1月20至2月20日采集山海关杨雄花枝，在温度为20℃的温室内水培，水培期间，每两天将容器内的水更换一次，保持花枝下部培养用水清洁；2.待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的细线期，向花芽内注射浓度为0.8％的秋水仙碱溶液，注射次数4次，相邻两次注射间隔时间3小时。
3.继续水培花枝，直至花粉散出。
诱导效果是2n花粉比率为87.4％，每花序散粉量是对照的0.41倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
采取以下步骤对2n花粉比率进行检测在显微镜下统计2000粒花粉中花粉直径大于40μm的花粉所占比率。直径大于40μm花粉的DNA含量是直径小于40μm花粉的2倍。所有花粉均采用这一标准方法进行统计。
采用以下公式计算相对花粉量相对花粉产量＝各种诱导处理后的每序花粉产量/对照的每序花粉产量。
对照花粉是同时同批在温室水培的花枝上采集的，与诱导处理花枝的唯一区别就是没有进行秋水仙碱溶液诱导。
每花序散粉量的检测方法是每处理收集25个花序的花粉称重，除以花序数。
实施例二除了待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的粗线期向花芽内注射秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为59.15％，每花序散粉量是对照的0.62倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例三除了待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期，向花芽内注射秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为50.20％，每花序散粉量是对照的0.38倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例四除了待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期，向花芽内注射浓度为0.6％的秋水仙碱溶液，注射次数5次，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为40.53％，每花序散粉量是对照的0.37倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例五除了待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期，向花芽内注射浓度为0.4％的秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为40.22％，每花序散粉量是对照的0.44倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例六除了待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期，向花芽内注射浓度为0.4％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为43.15％，每花序散粉量是对照的0.36倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例七至十二为诱导钻天杨花粉的实施例实施例七除了采集钻天杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期，向花芽内注射浓度为0.2％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为55.67％，每花序散粉量是对照的0.32倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例八除了采集钻天杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为40.73％，每花序散粉量是对照的0.35倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例九除了采集钻天杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射秋水仙碱溶液，注射次数为5次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为40.61％，每花序散粉量是对照的0.32倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十除了采集钻天杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射浓度为0.6％的秋水仙碱溶液外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为40.23％，每花序散粉量是对照的0.53倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十一除了采集钻天杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射浓度为0.6％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为40.47％，每花序散粉量是对照的0.48倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十二除了采集钻天杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射浓度为0.4％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为42.44％，每花序散粉量是对照的0.41倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十三至十九为诱导欧美杨花粉的实施例实施例十三除了采集欧美杨花枝，向花芽内注射浓度为0.5％的秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为4小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为62.02％，每花序散粉量是对照的1.00倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十四除了采集欧美杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的粗线期向花芽内注射浓度为0.5％的秋水仙碱溶液外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为41.80％，每花序散粉量是对照的0.67倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十五除了采集欧美杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射秋水仙碱溶液，注射次数为5次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为57.94％，每花序散粉量是对照的0.62倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十六除了采集欧美杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射浓度为0.5％的秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为66.41％，每花序散粉量是对照的1.63倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十七除了采集欧美杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射浓度为0.4％的秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为48.61％，每花序散粉量是对照的1.02倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十八除了采集欧美杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射浓度为0.4％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次，相邻两次注射间隔时间为2次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为52.38％，每花序散粉量是对照的0.55倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例十九除了采集欧美杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽内注射浓度为0.2％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为95％，每花序散粉量是对照的2倍，对照花粉中检测到4.91％的2n花粉。
实施例二十至二十四为诱导群众样花粉的实施例实施例二十除了采集群众杨花枝，向花芽内注射浓度为0.6％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次，相邻两次注射的间隔时间为4小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为41.28％，每花序散粉量是对照的0.32倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例二十一除了采集群众杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽向花芽内注射秋水仙碱溶液，注射次数为5次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为70.62％，每花序散粉量是对照的0.39倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例二十二除了采集群众杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽向花芽内注射浓度为0.6％的秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为62.10％，每花序散粉量是对照的0.86倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例二十三除了采集群众杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽向花芽内注射浓度为0.4％的秋水仙碱溶液，相邻两次注射间隔时间为2小时外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为42.36％，每花序散粉量是对照的0.58倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
实施例二十四除了采集群众杨花枝，待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的终变期向花芽向花芽内注射浓度为0.4％的秋水仙碱溶液，注射次数为5次外，其余均与实施例一相同。
诱导效果是2n花粉比率为43.95％，每花序散粉量是对照的0.32倍，对照花粉中没有检测到2n花粉。
尽管各实施例中的温室温度设为20℃，但是本领域的普通技术人员可以理解该温度可取15-25℃范围内的任意值。
权利要求
1.一种黑杨花粉二倍体的诱导方法，其特征在于包括以下步骤1)于冬春季采集黑杨长花枝于室温内水培；2)待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的细线期至终变期阶段，向花芽内多次注射秋水仙碱溶液；3)继续水培花枝，直至花粉散出。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中使用的秋水仙碱溶液的浓度为0.2-0.8％。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述秋水仙碱溶液的浓度为0.4-0.8％。
4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中注射秋水仙碱溶液的次数为4-5次。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述次数为5次。
6.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于相邻两次注射间隔时间为2-3小时。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于相邻两次注射间隔时间为2-3小时。
8.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于所述黑杨种类选自山海关杨、钻天杨、欧美杨和群众杨中的一种。
9.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)中使用的黑杨浸入水中的高度是30-40cm。
10.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)中采集花枝的时间为1-2月，所述的室温为20±5℃。
全文摘要
本发明公开了一种黑杨花粉二倍体的诱导方法，包括以下步骤1)于冬春季采集黑杨长花枝于室温内水培；2)待花枝上的雄花芽发育至减数分裂的细线期至终变期阶段，向花芽内多次注射秋水仙碱溶液；3)继续水培花枝，直至花粉散出，其中注射的秋水仙碱溶液的浓度为0.2－0.8％，注射次数为4－5次，相邻两次注射间隔时间为2－3小时。通过本发明的诱导方法，极大地提高了黑杨2n花粉的比率，实验数据表明采用本发明方法诱导的黑杨，2n花粉比率达40％至95％，每花序的花粉产量是对照的0.32至2倍，诱导效果稳定。
文档编号A01G1/00GK1994066SQ200610169680
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者张金凤, 续九如, 卫尊征, 王丽华, 康向阳, 陈晓阳, 张志毅, 李云, 胡冬梅 申请人:北京林业大学