一种四倍体大白菜雄性不育系选育的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种四倍体大白菜雄性不育系选育的方法。

背景技术：

大白菜(Brassica rapa pekinensis)是主要的十字花科蔬菜之一，历史上曾经与萝卜一起作为北方的半年菜具有举足轻重的地位。近年来随着生产方式的多元化，大白菜在人们日常生活中的地位有所下降，但仍是北方人们秋冬及早春季节不可缺少的主要蔬菜。生产中采用的大白菜品种基本上都是二倍体，鉴于当前存在的大白菜种质资源的同质化，基因群体日渐稳定，创新面日渐狭窄等问题，新手段、新技术的研发成为大白菜育种的迫切需求。

由于四倍体大白菜为创新性资源，自然界尚未发现野生的四倍体大白菜资源，因此无法获得自然突变四倍体的雄性不育系，而利用远缘杂交(芸薹属异源多倍体)技术程序更加复杂，进程周期长。人工选育虽然可以获得四倍体大白菜，但是育成四倍体大白菜的稔性低；此外由于目前选育四倍体大白菜仅以自交亲和系为亲本的方向，形成亲本选择面窄的困局，限制了中间类型四倍体大白菜品种的选育，如卵圆形、炮弹型、高桩包头型等，还造成后继杂交种制种过程中纯度难提高的问题，甚至出现自交株、假杂交株，给实际生产带来很大风险，迫切需要开展四倍体大白菜雄性不育系育种。

技术实现要素：

本发明首先解决了为雄性不育系提供稳定可靠的花粉来源的问题，并克服了二倍体雄性不育系加倍后能否使后代存活、不育性能否保持、不育性的稳定性、能否在四倍体自交系间转育等诸多问题。

有鉴于此，本发明首先提供了一种四倍体大白菜雄性不育系的选育方法，包括以下步骤：

1)大白菜雄性不育源的选择：选择二倍体大白菜雄性不育系材料库中稳定的细胞质雄性不育系；

2)培育步骤1)的细胞质雄性不育系，选择获得四倍体雄性不育株；

3)以步骤2)获得的四倍体雄性不育株为母本，以稳定的高代四倍体自交系为父本，进行连续多代回交转育，分别获得了与父本性状一致的四倍体雄性不育系BCn。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述细胞质雄性不育系为二倍体细胞质雄性不育系‘CMS后36高’。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述步骤2)中培育步骤1)的细胞质雄性不育系‘CMS后36高’的方法包括催芽、播种的过程。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述催芽的方法包括：以二倍体大白菜细胞质雄性不育系材料‘CMS后36高’种子，55℃温汤浸种后用潮湿的软纱布包裹，在28℃恒温箱中催芽12小时-20小时，使得种子的80％种皮裂开吐白。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述播种的方法包括：采用50穴的穴盘播种2盘，每穴播种3-4粒，播种深度1cm，覆盖基质后盖地膜保湿，在人工气候室25℃、光照强度1000-1500lx下育苗，幼苗破土后及时去除地膜。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述步骤2)中选择获得四倍体雄性不育株的方法为使用多倍体诱变剂处理‘CMS后36高’幼苗，存活植株在真叶达到6-7片时进行倍性鉴定，之后人工气候室春化，抽薹后进行雄性不育性鉴定，并选择四倍体雄性不育植株作为四倍体雄性不育源。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述多倍体诱变剂为秋水仙素。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述高代四倍体自交系为D12、D22、D571、D574；所述与父本性状一致的四倍体雄性不育系为CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574(注：BCn指代次，每一个材料都需经过n代的回交转育，成型后的不育系以原保持系(自交系)名称前加“CMS-”来区分。)。

优选地，本发明所述四倍体大白菜雄性不育系的选育方法中，所述多代回交转育为至少5代。

本发明的另一方面在于提供了上述的方法获得四倍体大白菜雄性不育系BCn，及其非繁殖部分。优选地，所述四倍体大白菜雄性不育系BCn的非繁殖部分包括四倍体大白菜雄性不育系BCn的植物器官、植物细胞、植物原生质体、非繁殖性的组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团、植物移植体、或植物的部分；优选地，所述的括四倍体大白菜雄性不育系BCn的植物器官，包括非繁殖性植物胚、花粉、胚珠、果实、花、叶、根、茎、根尖、嫁接物(接穗)等。

本发明的方法及其获得的稳定四倍体大白菜雄性不育系，至少具有以下优点：

本发明方法适用于四倍体大白菜新品种的选育，通过将目标母本亲本创制为雄性不育系，能使父本亲本从有限的选择范围扩展大不受限制的选取，从而使培育的四倍体大白菜杂交种类型不再仅限于束心型、花心型、圆球型，通过跨类型亲本的选配，能培育出更多的中间类型四倍体大白菜品种如卵圆形、炮弹型、高桩包头型等，使四倍体大白菜品种类型更加丰富；

同时，采用雄性不育系制种，因母本亲本的自身雄蕊败育不可能产生花粉，一旦结籽必定为与父本的杂交种，可使杂交种的纯度提高到100％，而且可节约普通制种过程中后期的人工去雄和化学杀雄成本，具有显著的生态与经济效益。

附图说明

图1为本发明的一个实施例四倍体大白菜雄性不育系BCn的培育方法示意图；

图2为本发明的实施例1四倍体大白菜保持系(父本)与雄性不育系对比图；

图3为本发明的实施例1中四个四倍体大白菜雄性不育系染色体镜检图；

图4为本发明的实施例1四倍体大白菜保持系(父本)与雄性不育系田间生长对比照片。

具体实施方式

在本发明的一个实施例中，提供了一种四倍体大白菜雄性不育系的选育方法，包括以下步骤：

1)大白菜雄性不育源的选择：选择二倍体大白菜雄性不育系材料库中稳定的细胞质不育系；

2)培育步骤1)的细胞质不育系，选择获得四倍体雄性不育株；

3)以步骤2)获得的四倍体雄性不育株为母本，以稳定的高代四倍体自交系为父本，进行连续多代回交转育，分别获得了与父本性状一致的四倍体雄性不育系BCn。

在本发明的另一个实施例中，所述细胞质不育系为细胞质不育系‘CMS后36高’。

在本发明的另一个实施例中，所述步骤2)中培育步骤1)的细胞质不育系‘CMS后36高’的方法包括催芽、播种的过程。

在本发明的另一个实施例中，所述催芽的方法包括：以二倍体大白菜细胞质雄性不育系材料‘CMS后36高’种子，55℃温汤浸种后用潮湿的软纱布包裹，在28℃恒温箱中催芽12小时-20小时，使得种子的80％种皮裂开吐白。

在本发明的另一个实施例中，所述播种的方法包括：采用50穴的穴盘播种2盘，每穴播种3-4粒，播种深度1cm，覆盖基质后盖地膜保湿，在人工气候室25℃、光照强度1000-1500lx下育苗，幼苗破土后及时去除地膜。

在本发明的另一个实施例中，所述步骤2)中选择获得四倍体雄性不育株的方法为使用多倍体诱变剂处理‘CMS后36高’幼苗，存活植株在真叶达到6-7片时进行倍性鉴定，之后人工气候室春化，抽薹后进行雄性不育性鉴定，并选择四倍体雄性不育植株作为四倍体雄性不育源。

在本发明的另一个实施例中，所述多倍体诱变剂为秋水仙素。

在本发明的另一个实施例中，所述高代四倍体自交系为D12、D22、D571、D574；所述与父本性状一致的四倍体雄性不育系为CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574。在本发明的另一个实施例中，所述多代回交转育为至少5代。

在本发明的另一个实施例中，提供了四倍体大白菜雄性不育系CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574，及其非繁殖部分。

其中，二倍体细胞质雄性不育系‘CMS后36高’，四倍体自交系D12、D22、D571、D574可获得自可获得自河北农林科学院经济作物研究所，并可使用《大白菜2n配子发生的细胞学机制研究，《河北农业科学》第9卷第3期》所描述之方法培育获得。

以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1四倍体大白菜雄性不育系BCn的选育

如图1所示，四倍体大白菜雄性不育系BCn的选育，包括以下步骤：

(1)催芽：在12月下旬进行，取二倍体大白菜细胞质雄性不育系材料‘CMS后36高’种子1g，55℃温汤浸种后用潮湿的软纱布包裹，在28℃恒温箱中催芽12-20h，以80％种皮裂开吐白为宜。

(2)播种：采用50穴的穴盘播种2盘，每穴播种3-4粒(保障萌发种子1粒)，播种深度1cm，覆盖基质后盖地膜保湿，在人工气候室25℃、光照强度1000lx-1500lx下育苗，幼苗破土后及时去除地膜。

(3)子叶展开时将直径3-5mm的脱脂棉球紧紧贴合生长点卡在子叶中间，用0.2％重量秋水仙碱溶液点滴脱脂棉球，每天上午、下午各滴1次，持续处理48小时。

(3)四倍体大白菜雄性不育株的筛选：处理结束后，穴盘幼苗仍按照正常育苗程序管理，待穴盘中存活植株在真叶达到6-7片时用镊子摘取1cm²的心叶置于改良卡诺氏固定液中固定48h，在28℃恒温下用5％重量果胶酶解离1h，PIHCH染色法染色、压片、观察染色体数量，选出成功加倍的四倍体不育株。

(4)低温处理诱导春化抽薹：在人工气候室进行低温短日照处理，10℃下光照强度1000lx-1500lx，光照时数8h，连续处理20日，诱导幼苗通过春化达到抽薹开花的目的。

(5)选取稳定的高代四倍体自交系D12、D22、D571、D574分别为父本，以步骤(4)获得的春化后的四倍体不育株为母本，进行连续多代回交转育，5代以后可获得与父本性状一致的四倍体雄性不育系BC₅：CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574(注BCn指代次，每一个材料都需经过n代的回交转育，成型后的不育系以原保持系名前加“CMS-”来区分。)。四倍体不育系与保持系(父本)育性鉴定具体结果见下表1、四倍体不育系与保持系(父本)生物学性状比较结果见下表2：

表1四倍体大白菜雄性不育系转育后育性鉴定汇总表

表2四倍体不育系与保持系(父本)生物学性状对比表

如图2所示，A为父本四倍体大白菜保持系D571；B为雄性不育系CMS-D571；如图所示，D571雄蕊长于柱头，花药饱满呈绒毛状，为可育的正常状态；CMS-D571雄蕊远低于柱头，花药囊干瘪退化成长三角状，为无花粉的不育状态。

本发明对实施例1中所获得的四倍体雄性不育系CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574的染色体进行了电子显微镜检，结果见图3，其中，A为CMS-D571；B为CMS-D12；C为CMS-D574；D为CMS-D22。结果说明：通过镜检发现，四个雄性不育系的染色体数均稳定在40条，可确定为四倍体。

如图4所示，A为CMS-D574与D574；B为CMS-D571与D571；C为CMS-D12与D12；D为CMS-D22与D22的田间生长比对图，结果说明：四组不育系与保持系的田间生长各项表现性状相一致，不育系表现出生长势强、抗逆性强的特点。

如图2～4及表1、表2的所示，本发明方法能使杂交组合配制过程中父本亲本从有限的选择范围扩展大为不受限制的选取，可以按照包球类型互补的原则配制中间类型四倍体大白菜品种，高包型、束心型、牛心型，使四倍体大白菜品种类型更加丰富。

另外，通过表1中不育度所显示的，本发明的方法可使杂交种的纯度提高到100％，而且可节约普通制种过程中后期的人工去雄和化学杀雄成本，具有显著的生态与经济效益。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。