专利名称：一种利用细胞工厂生产鸡马立克氏病疫苗的方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种生产鸡马立克氏病液氮苗(814株) 的方法，尤其是公开了一种利用细胞工厂制备鸡马立克氏病液氮疫苗(814株)的方法。
背景技术：
鸡马立克病是由细胞结合性疱疹病毒(MDV)引起的鸡的一种高度传染的淋巴组 织增生性疾病，鸡群感染马立克病毒后危害较大，对养禽业造成严重的危害。随着疫苗的广 泛应用和鸡品系的不断选育，MDV在自然选择和免疫压力的双重作用下，其毒力不断增强， 一次次地突破了疫苗所能提供的保护力。20世纪70年代所分离到的为标准强毒(VMDV)，70年代末到80年代MDV发生了很 大变化，毒力增强，成为超强毒；90年代出现了更强的超强毒(VV+MDV)。因此HVT冻干苗对 MD强毒和VV+MDV免疫效果差，可以说血清III型HVT疫苗的历史使命基本完成。目前，普遍使用的能够抵御超强毒和超超强毒的疫苗毒株主要有814株和 CVI988。814株是我国哈尔滨兽医生物药品研究所的童昆周先生从没有免疫过马立克疫苗 的健康鸡群分离出的一株没有致瘤性的马立克病毒，与CVI988同属于血清I型毒株。但 814株属于自然弱毒株，无致瘤性，是我国惟一没有致瘤性的血清I型疫苗株，因此，不存在 毒力返强的问题。本毒株遗传性能好，具有良好的免疫原性，不受母源抗体影响。传统的病毒性疫苗制备，关键是为病毒提供适宜其增殖的细胞基质，通常采用贴 壁培养的生长方式。贴壁培养系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。转瓶培 养是小量培养到大规模培养的过度方式，或作为生物反应器接种细胞的准备途径。转瓶培 养是目前国内疫苗生产厂家普遍采用的细胞培养方式，具有结构简单、投资少、技术成熟、 重复性好、容易扩大等优点，同时也存在着细胞生长密度低、转瓶间细胞生长差异大、劳动 强度大、占用空间大、能耗高、水耗量大等缺点。
发明内容
本发明提供一种利用细胞工厂生产的鸡马立克氏病液氮疫苗，包括如下组分每支成品(2mL)含以下组分及含量199综合营养液1. 4 1. 7mL犊牛血清0. 2 0. 4mL冷冻保护液 0. 1 0. 2mL病毒量所含病毒蚀斑数不低于6X IO6PFU的马立克氏病814株病毒。其中所述的199综合营养液购自美国Invitrogen公司。本发明还提供制备上述疫苗的方法，包括如下步骤1)、制备鸡成纤维细胞悬浮液选择9-10日龄发育良好的无特定病原体(SPF)鸡胚，先用4%碘酒消毒气室部位， 用75%酒精脱碘，无菌取出鸡胚，用Hank’ s液洗涤胚体，用无菌剪刀将胚体剪成米粒大小的组织块，用Hank’ s液洗涤3次后；按每个鸡胚4 6mL的比例加入0. 25%的胰酶(DE)， 在38°C消化20 30min后，弃去胰酶，用Hank’ s液洗涤3次；加入营养液，分散细胞，静置 后用10 15层纱布过滤，再次加入乳汉液，反复分散细胞，确认组织块被分散成单个细胞， 制成每一毫升含活细胞数80 120万的鸡成纤维细胞悬浮液，混合均勻后备用；2)接种及更换维持液往制备的鸡成纤维细胞悬浮液中加入工作毒种，分装在细胞工厂中，每层150 250mL，盖好进液口盖，放38°C的温室内静置培养。培养24 36h后弃去细胞生长液，加入 含有2 5%血清的199营养液，将营养液分勻拧紧瓶口帽，放入38°C温室培养；或者将制 备的鸡胚成纤维细胞悬浮液分装在细胞工厂中，每层150 250mL，盖好进液口盖，放38°C 的温室内静置培养。培养24 36h后弃去细胞生长液，加入含有工作毒种的199营养液， 将营养液分勻拧紧瓶口帽，放入38°C温室培养48 72h ；其中，优选的是，每平方厘米细胞工厂的平面上接种5-10万个鸡胚成纤维细胞。3)收获培养至80%以上的细胞出现致细胞病变效应(CPE)时，即可收获，弃去营养液，加 入EDTA-胰酶混合消化液250 350mL/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入 199营养液300 400mL/层，停止消化。收集，无菌检验后，分至离心瓶中；4)离心、提取细胞于2_8°C、1500r/min离心10 20分钟，离心后弃去上清，收集沉淀细胞；5)配苗与分装收集沉淀细胞，调节pH值7. 0 7. 4，加入配苗体积70 85 %的199综合营养液、 配苗体积10 20%的犊牛血清和配苗体积5 10%的冷冻保护剂，摇勻，取样做收获前无 菌检验，进行活细胞计数后，定量分装到无菌安瓶中封口 ；其中，冷冻保护剂可选用任何本 领域超低温保存的冷冻保护剂，优选为二甲基亚砜(DMSO)。6)程序降温利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至零下80°C 零下120°C时将疫苗放入 液氮中保存；7)清洗细胞工厂用消毒纯化水反复清洗用过的细胞工厂3 4次，包装好，进行钴源照射消毒后重 复使用。其中步骤2)中加入的工作毒种为血清I型的禽马立克氏病毒814株，接种量为每 平方厘米接种1000 2000PFU含量的种毒，优选为1500PFU。本发明通过细胞工厂生产的鸡马立克氏病液氮疫苗(814株)的质量优良，免疫效 力高，免疫效果稳定，与国外进口同类疫苗相比具有相同的预防效果，除此之外，其还有代 次低、蚀斑小、PFU含量高，免疫原性好、成本低、在较短的时间内产生免疫保护等优点。此外，在疫苗制剂中特别添加了犊牛血清，在解冻和使用过程中有助于提高细胞 存活率，减少病毒损失，提高免疫效力。本发明提供的利用细胞工厂生产鸡马立克氏病疫苗的方法，具有如下优点在细 胞工厂中，细胞生长更接近自然状态，可形成均一的细胞单层；由于材料对细胞的影响非常 小，细胞的活力更强，病毒在细胞内生长更快，感染细胞率明显提高；细胞与外界接触的机会更少，人为污染的几率就更低；此外还有体积小，节省空间，更容易操作等优点。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1选用美国CORNING公司出品的Cell STACK 10层(636cm2/层)，采用同步感染法 制备鸡马立克氏病液氮苗的制备工艺。液氮疫苗制备工艺主要步骤如下(1)鸡胚成纤维细胞单层的制备选择10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用4%碘酒消毒气室部位，用75%酒精脱 碘，无菌取出鸡胚，用Hank’ s液洗涤胚体，用无菌剪刀将胚体剪成米粒大小的组织块，用 Hank's液洗涤3次后；按每个鸡胚4mL的比例加入0. 25%的胰酶(DE)，在38°C消化30min 后，弃去胰酶，用Hank’ s液洗涤3次；按每个鸡胚加入2mL的营养液，制成每一毫升含活细 胞数300万的细胞悬液。混合均勻后备用。(2)接毒及更换维持液往细胞悬液中加入工作毒种，接种量为每平方厘米接种1500PFU含量的种毒，分 装在细胞工厂中，每层150mL，盖好进液口盖，放38°C的温室内静置培养。培养36h后弃去 细胞生长液，加入含有血清的199营养液，细胞工厂每层150mL，将营养液分勻拧紧瓶口帽， 火焰消毒瓶口，用锡纸包好，放入37°C 士0.5°C温室培养。(3)培养与观察接毒24h后每日观察1 2次，待80%以上细胞出现CPE时，即可收获。(4)收获弃去营养液，加入EDTA-胰酶混合消化液250mL/层，使消化液与细胞充分接触一 段时间后，弃去胰酶液，立即加入199综合营养液400mL/层，停止消化。收集，无菌检验后， 分至离心瓶中；(5)离心、提取细胞于2_8°C、1500r/min离心10分钟，离心后弃去上清，收集沉淀细胞。(6)配苗与分装收集沉淀细胞，调节pH值7. 0，加入配苗体积10%的犊牛血清、配苗体积5%的冷 冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)和配苗体积的85%的199综合营养液，摇勻，取样做收获前无 菌检验，进行病毒计数，每毫升中所含病毒蚀斑数不低于3 X 106PFU。2mL分装到无菌安瓶 中封口。(7)程序降温利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至零下80°C 零下120°C时将疫苗放入 液氮中保存。(8)清洗细胞工厂用消毒纯化水反复清洗用过的细胞工厂3次，包装好，进行钴源照射消毒后重复使用。实施例2选用美国CORNING公司出品的Cell STACK 40层(636cm2/层)，采用单层感染法 制备鸡马立克氏病液氮苗的制备工艺。液氮疫苗制备工艺主要步骤如下(1)鸡胚成纤维细胞单层的制备选择9日龄发育良好的SPF鸡胚，先用4%碘酒消毒气室部位，用75%酒精脱碘， 无菌取出鸡胚，去除头、内脏，放入无菌的玻璃器皿内，用Hank’ s液洗涤胚体，用无菌剪 刀将胚体剪成米粒大小的组织块，用Hank’ s液洗涤3次后，按每个鸡胚6mL的比例加入 0. 25%胰酶，在38°C消化20min后，弃去胰酶，用Hank’ s液洗涤3次；按每个鸡胚加入4mL 的营养液，制成每一毫升含活细胞数约200万的细胞悬液，放38°C的温室内静置培养。将细 胞悬液分装在细胞工厂中，每层250mL，盖好进液口盖，形成单层后备用。(2)接毒及更换维持液弃去细胞生长液，加入含有工作毒种的199营养液，细胞工厂每层250mL，其中，接 种量为每平方厘米接种2000PFU含量的种毒。将营养液分勻拧紧瓶口帽，火焰消毒瓶口，用 锡纸包好，放入38°C温室培养。(3)培养与观察接毒24h后每日观察1 2次，待80%以上细胞出现CPE时，即可收获。(4)收获弃去营养液，加入EDTA-胰酶混合消化液350mL/层，使消化液与细胞充分接触一 段时间后，弃去胰酶液，立即加入199综合营养液300mL/层，停止消化。收集，无菌检验后， 分至离心瓶中；(5)离心、提取细胞于2_8°C、1500r/min离心20分钟，离心后弃去上清，收集沉淀细胞。(6)配苗与分装收集沉淀细胞，调节pH值7. 4，加入配苗体积20 %的犊牛血清、和配苗体积10 %的 冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)和配苗体积70%的199综合营养液，摇勻，取样做收获前无 菌检验，进行病毒计数，每毫升中所含病毒蚀斑数不低于3 X IO6PFU, 2mL分装到无菌安瓶中 封口。(7)程序降温利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至零下80°C 零下120°C时将疫苗放入 液氮中保存。(8)清洗细胞工厂用消毒纯化水反复清洗用过的细胞工厂4次，包装好，进行钴源照射消毒后重复 使用。实施例3设计实验，比较利用实施例1生产的经检查合格的鸡马立克氏病液氮疫苗(814 株)与国外2个厂家生产的CVI988疫苗预防鸡马立克氏病的疗效。一、将1龄SPF白来航雏鸡(由北京梅里亚维通实验技术有限公司提供)132只随机分成6组，每组22只。免疫组共4组，分别接种814低代毒疫苗、814株疫苗、CVI988-A、 CVI988-B，每只颈背部皮下注射3000PFU。非免疫组2组，免疫后在隔离器中分别隔离饲养 21d。免疫后21d，将免疫组和阳性对照组的22只分别接种马立克氏病(MD)标准强毒株 京-1株(购自由北京市农林科学院畜牧兽医研究所，经农业部批准发放，批号980603， 2mL/支，攻毒时，用乳汉液稀释10倍，每只鸡腹腔注射0. 5mL)，连同阴性对照组22只，在进 口隔离器中继续隔离饲养。每天观察、记录发病和死亡情况，对死亡鸡及时剖检，观察大体 病变。攻毒2个月后，对所有存活鸡进行解剖，观察病变，计算病变指数和保护指数。试验 结果用SPSS软件进行t检验。通过实验观察和结合统计表1、2可知①阳性对照组鸡攻毒后，最早发病日龄为15日龄，最早发生死亡的日龄为17日 龄，死亡时间集中在17 40日龄，死亡比例为72. 73%。剖检死亡鸡均为典型的内脏型病 变，肌肉、皮肤和神经型病变少见，至62日龄时，存活的6只中有3只鸡呈阳性病变，脾脏病 变均明显，有1只鸡的卵巢有小鸡蛋大小的病变，总阳性率为86.4%。阴性对照组到实验结 束均表现健康生长，剖检器官无异常，表明本次实验阴阳性对照均成立，实验结果可信。②814低代毒组和814疫苗组在整个攻毒过程中，均没有死亡，62d的活鸡中个别 鸡睾丸和肾脏有淋巴瘤病变。③CVI988-A组在攻毒后60d时，有1只鸡因极度消瘦死亡，解剖发现卵巢、肾肿 大。活鸡中有3只有淋巴瘤病变。④CVI988-B组在攻毒48d时有1只鸡死亡，解剖发现肝脏上布满星状肿瘤，单侧 睾丸极度肿大，心脏呈阳性病变。表1免疫组和对照组接种强毒后的保护指数和死亡情况表
组别攻毒死亡鸡肿瘤阳存活鸡肿瘤总阳性数保护指数只数性数(只)阳性数(只)(只)(%)0083]814低代毒2203384.3814疫苗2202289.4CVI988-A2213478.9CVI988-B2213478.9阳性对照组221631986.4阴性对照组0----注保护指数=(攻毒对照组阳性率-免疫组阳性率)/攻毒对照组阳性 率 X 100%表2免疫组和对照组接种强毒后病变分布情况
权利要求
1.一种鸡马立克氏病疫苗，其特征在于，包括如下组分每支2mL成品含以下组分及含量199综合营养液1.4 1. 7mL犊牛血清 0. 2 0. 4mL冷冻保护液0. 1 0. 2mL病毒含量所含病毒蚀斑数不低于6X IO6PFU的马立克氏病814株病毒。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为液氮苗。
3.一种制备权利要求1或2所述疫苗的方法，包括如下步骤1)制备鸡胚成纤维细胞悬浮液将无特定病原体鸡胚用胰酶消化后制成鸡胚成纤维细胞悬浮液；2)接种及更换维持液往步骤1)制备的鸡胚成纤维细胞悬浮液中加入工作毒种，分装在细胞工厂中，每层 150 250mL，于38°C静置培养24 36h后弃去细胞生长液，加入含有2 5%犊牛血清的 199营养液，每层150 250mL，于38°C静置培养；或者将步骤1)制备的鸡胚成纤维细胞悬 浮液分装在细胞工厂中，每层150 250mL，盖好进液口盖，于38°C静置培养24 36h后弃 去细胞生长液，加入含有工作毒种的199营养液，于38°C静置培养；3)收获培养至80%以上的细胞出现致细胞病变效应时，即可收获，弃去营养液，加入EDTA-胰 酶混合消化液250 350mL/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入199营养液 300 400mL/层，停止消化，收集，无菌检验后，分至离心瓶中；4)离心、提取细胞于2 8°C、1500r/min离心10 20分钟，离心后弃去上清，收集沉淀细胞；5)配苗与分装收集沉淀细胞，调节pH值7. 0 7. 4，加入配苗体积70 85%的199综合营养液、配 苗体积10 20%的犊牛血清，和配苗体积的5 10%的冷冻保护剂，摇勻，取样做收获前 无菌检验，进行活细胞计数后，定量分装到无菌安瓶中封口 ；6)程序降温利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至零下80°C 零下120°C时将疫苗放入液氮 中保存；7)清洗细胞工厂用消毒纯化水反复清洗用过的细胞工厂3 4次，包装好，进行钴源照射消毒后重复使用。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述工作毒种为血清I型的禽马立克 氏病病毒814株。
5.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜。
6.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2)中工作毒种的接种量为 每平方厘米接种1000 2000PFU含量的种毒。
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2)中的工作毒种接种量为 每平方厘米接种1500PFU含量的种毒。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中胰酶的用量为每个鸡胚加 入4 6mL的0. 25%的胰酶。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的鸡胚成纤维细胞悬浮液 的活细胞数为每一毫升200 300万。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，公开了一种利用细胞工厂制备鸡马立克氏病液氮疫苗814株的方法及其利用这种方法制备的鸡马立克氏病液氮疫苗(814株)。本发明通过细胞工厂生产的鸡马立克氏病液氮疫苗(814株)的质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定；除此之外，其还有代次低、蚀斑小、PFU含量高，免疫原性好、成本低、在较短的时间内产生免疫保护等优点。
文档编号A61K39/255GK102000328SQ20101056226
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者周海琴, 常如军, 张发明, 张洪, 张红, 张连祥, 曹宁, 朱秀芝, 李然, 李静, 王文泉, 袁芳, 贾桂珍, 车竞, 邢雪莲, 郎立群, 郑杰, 金剑, 陈玲, 马力 申请人:北京市兽医生物药品厂