专利名称：一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法
技术领域：
本发明属生物学领域，具体是一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别 方法。
背景技术：
马立克氏病是由马立克氏病病毒引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性肿 瘤疾病。近年来在国内对马立克氏病的预防主要是用保护效果比较好的马立克氏病病毒血 清1型人工致弱毒的荷兰毒株CVI988和中国哈尔滨兽医研究所研制的中国特有的自然弱 毒疫苗株814。存在的问题是首先雏鸡在免疫之后的7-10天才产生良好的细胞免疫和体 液免疫应答的能力，而一般情况下雏鸡免疫完就暴露在可能存在马立克氏病强毒株的环境 里，其次免疫接种不能阻止强毒感染和给鸡提供完全保护，疫苗毒与强毒可以在鸡体内长 期共存。马立克氏病病毒血清1型CVI988和814株的使用给马立克氏病的确切诊断带来 很大的困难，研究区分马立克氏病病毒疫苗株与野毒株的鉴别诊断一直受到极大的关注。 CVI988株pp38基因上游启动子序列有连续5个核苷酸缺失，其它毒株包过814株没有发现 这样的缺失，针对这缺失区序列设计两对引物，一对引物只能扩增出CVI988，另外一对引物 能扩增出除了 CVI988以外包过814的其它毒株，可以通过PCR方法把CVI988与其它包括 814在内的毒株区别开，但未能将814株与其它强毒株区分开，因此在生产及科研上不能对 曾经使用过814疫苗株的鸡群进行马立克氏病确定性的诊断。通过实时定量PCR方法检测 鸡外周血淋巴细胞马立克氏病病毒基因组DNA载量证实强、弱毒株的复制动力学存在一定 差别，作为马立克氏病用于早期诊断的标准，但是这种方法比较难运用到实际生产中。
发明内容
为了克服现有技术的不足本发明提供一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒 株的鉴别方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下1. 一种可用于区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法，采用PCR技 术，对马立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回归鸡体内一代分离株CVI988/ BP1 和特超强毒株 648A、超强毒株 G2、N 以及强毒株 YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、 GX070079、GX070092、GX080036、GX08005U GX080059 等 16 个毒株进行 PCR 扩增，并对 PCR 产物进行核苷酸序列的测定得到了确认，具体操作步骤如下1)设计并合成引物根据GenBank登录号为AF243438的马立克氏病病毒Md5株的序列设计合成一对 引物，上游引物 USF CTAACCACAGCGTGTCTCC,下游引物 USR TGTATCTTTCCTCTGCCTTG,使用前 用超纯水溶解，浓度为25pmol，置于-20°C保存备用；2)毒株的处理从液氮中取出冻存毒株马立克氏病病毒血清1型活疫苗CVI988和814株、CVI988回归鸡体内一代分离毒CVI988/BP1株、10个强毒分离株分别为YL040920、GXY1、 GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059，迅速放入 37°C 水浴锅使其融化，在室温1500r/min的条件下离心5min，弃去上清，用无血清的细胞培养基 DMEM lmL重新悬浮，进行细胞基因组总DNA的提取；3)DNA 的提取a.抽提液的制备，将 pH8. 01mol/L Tris-Cl 4u L, pH8. 00. 5mol/L EDTA80 u L, 20 u g/ml 胰 RNA 酶 0. 8 ii L、重量浓度 10 % SDS 20 u L、20mg/mL 蛋白酶 K3 ii L 和超纯水 42.2UL混合均勻，得到抽提液；b.取步骤2)的各细胞培养基悬浮液250 iiL分别置于13个1.5mL离心管中，每管 加配制好的150 u L抽提液，混合均勻后置55°C水浴2小时；c.从水浴中取出消化后的样品，在每管中加入饱和苯酚400 yL，充分震荡摇勻后 在室温12000r/min的条件下离心8分钟；d.取上步骤的上清液400 ii L然后加入200 ii L的饱和苯酚和200 ii L的氯仿溶液， 震荡摇勻后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；e.取上步骤的上清液400 u L再加入体积40 y L pH5. 23mol/L的乙酸钠和_20°C 条件下保存的无水乙醇800 y L，震荡摇勻，然后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；f.弃去上步骤的上清液，加入lmL 75%的酒精洗涤一次后，将所得核酸沉淀物放 在42°C烘箱内烘干，得到DNA;g.在每管中加入20ii L的超纯水，溶解DNA，获得的DNA样品置_20°C保存备用；3)PCR反应体系采用50 y L的反应体系，在冰浴条件下，按下列试剂用量在16个PCR反应管中 分别加入各成分10 XBuffer 5. 0uL,10mM dNTP 2. 0 y L，上、下游引物各 1. 0 y L，5U/y L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，各个反应管分别加入2. 0 y L的648A、G2、N株的基因组DNA和步骤 2)各样品模板DNA，用灭菌双蒸水补足至总体积为50y L ；4)PCR反应条件将PCR反应管置于PCR扩增仪中进行循环，反应循环参数95°C预变性3min ；30个 循环94°C变性 30sec、60°C退火 30sec、72°C延伸 lmin ；72°C延伸 5min，得到 PCR 产物；5)PCR产物的检测取8 ii L PCR反应产物与1 P L重量浓度10%溴酚蓝染料混合，放入含溴化乙锭 0.5ug/mL重量浓度为琼脂糖凝胶孔中，在80V电压的条件下电泳1小时后，在紫外透 射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小，在凝胶成像系统下拍照、并记录试验结 果；6)结果与判定在紫外灯下观察并于标准分子量相对照，所有毒株都只扩增出一条带，CV1988、 814、CVI988/BP1、648A、G2、N、YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、 GX080036、GX080051、GX080059 出现的片段分别是 738bp、735bp、738bp、818bp、952bp、 951bp、968bp、972bp、974bp、968bp、970bp、966bp、970bp、1187bp、1185bp、1188bp。7) PCR产物的纯化在紫外灯下切下步骤6)判定的片段，用SIGEMA凝胶回收试剂盒进行回收；
8)PCR产物的克隆将PCR产物与载体pMD18-T Vector进行连接，按常规方法将转化产物分别转化感 受态细胞，挑取白色单个菌落接种至含氨苄青霉素培养基中，37°C恒温震荡增菌培养12 16h ；9)对步骤8)菌液PCR鉴定a.反应体系的配制，在PCR反应管内分别加入lOXBuffer 5. 0 u L, 10mM dNTP2. 0 ii L，上、下游引物各1. 0 ii L，5U/ u L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，步骤8)的菌液 1. 0 u L，用灭菌双蒸水补足至总体积为50 y L ；b. PCR反应条件与步骤4)相同、结果判定与步骤6)相同；10)扩增产物的序列测定与比较分析将步骤9)筛选到的阳性克隆交由广州Irwitrogen有限公司和上海生物工程有限 公司进行DNA序列测定，并把所测得序列在GenBank进行Blast分析，确定PCR扩增所得的 核苷酸序列属于马立克氏病病毒基因组。本发明与现有技术比较的益效是马立克氏病病毒血清1型疫苗株与强毒株的致 病性差异很大，但是基因组很相似，CVI988和814疫苗株的使用给马立克氏病的确切诊断 带来很大的困难。本专利所建立的方法能区分马立克氏病病毒疫苗CV1988和814株与强 毒株的鉴别方法。解决目前还未能解决的区分马立克氏病病毒血清1型疫苗毒与强毒特别 是超强毒和特超强毒株的难题，可以对国内外广泛使用疫苗株CV1988以及814的养殖场进 行肿瘤病毒的检测与疾病的诊断以及实验研究中这些病毒株的相互鉴别。这对于调查鸡群 出现马立克氏病免疫失败的原因、调查鸡群早期感染强毒、疾病的流行病学以及临床肿瘤 病的确切诊断、环境病毒的检测和马立克氏病的预防与控制均具有十分重要的意义及应用 价值。
图 1 是本发明具体实施例中 PCR 检测 CV1988、814、CVI988/BP1、648A、G2、N、 YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、 GX080059毒株的电泳结果。图中1 :DL2000bp Ladder DNA Marker ；2 :CVI988 ；3 814 ；4 :CVI988/BP1 ；5 648A ；6 :G2 ；7 :N ；8 :YL040920 ；9 :GXY1 ；10 :GXY2 ；11 :GXYL1 ；12 :GX070060 ；13 :GX070079 ； 14 :GX070092 ；15 :GX080036 ；16 :GX080051 ；17 :GX080059 ；18 :150bp Ladder DNAMarker。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。1)设计并合成引物根据GenBank登录号为AF243438的马立克氏病病毒Md5株的序列设计合成一对 引物，上游引物 USF CTAACCACAGCGTGTCTCC,下游引物 USR TGTATCTTTCCTCTGCCTTG,使用前 用超纯水溶解，浓度为25pmol，置于-20°C保存备用。2)毒株的处理从液氮中取出冻存毒株马立克氏病病毒血清1型活疫苗CVI988和814株、CVI988回归鸡体内一代分离毒CVI988/BP1株、10个强毒分离株分别为YL040920、GXY1、 GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059，迅速放入 37°C 水浴锅使其融化，在室温1500r/min的条件下离心5min，弃去上清。用无血清的细胞培养基 DMEM lmL重新悬浮，进行细胞基因组总DNA的提取。3)DNA 的提取a.抽提液的制备，将 pH8. 01mol/L Tris-Cl 4 ii L、pH8. 00. 5mol/L EDTA80 u L, 20 u g/ml 胰 RNA 酶 0. 8 ii L、重量浓度 10 % SDS 20 u L、20mg/mL 蛋白酶 K3 ii L 和超纯水 42.2UL混合均勻，得到抽提液；b.取步骤2)的各细胞培养基悬浮液250 iiL分别置于13个1.5mL离心管中，每管 加配制好的150 u L抽提液，混合均勻后置55°C水浴2小时；c.从水浴中取出消化后的样品，在每管中加入饱和苯酚400 yL，充分震荡摇勻后 在室温12000r/min的条件下离心8分钟；d.取上步骤的上清液400 u L然后加入200 u L的饱和苯酚和200 u L的氯仿溶液， 震荡摇勻后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；e.取上步骤的上清液400 u L再加入体积40 ii L pH5. 23mol/L的乙酸钠和_20°C 条件下保存的无水乙醇800 y L，震荡摇勻，然后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；f.弃去上步骤的上清液，加入lmL 75%的酒精洗涤一次后，将所得核酸沉淀物放 在42°C烘箱内烘干，得到DNA;g.在每管中加入20 ii L的超纯水，溶解DNA，获得的DNA样品置_20°C保存备用；3)PCR反应体系采用50 y L的反应体系，在冰浴条件下，按下列试剂用量在16个PCR反应管中 分别加入各成分10 XBuffer 5. 0uL,10mM dNTP 2. 0 y L，上、下游引物各 1. 0 y L，5U/y L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，各个反应管分别加入2. 0 y L的648A、G2、N株的基因组DNA和步骤 2)各样品模板DNA，用灭菌双蒸水补足至总体积为50yL。4) PCR反应条件将PCR反应管置于PCR扩增仪中进行循环，反应循环参数95°C预变性3min ；30个 循环94°C变性 30sec、60°C退火 30sec、72°C延伸 lmin ；72°C延伸 5min，得到 PCR 产物。5)PCR产物的检测取8 ii L PCR反应产物与1 P L重量浓度10%溴酚蓝染料混合，放入含溴化乙锭 0.5ug/mL重量浓度为琼脂糖凝胶孔中，在80V电压的条件下电泳1小时后，在紫外透 射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小，在凝胶成像系统下拍照、并记录试验结果。6)结果与判定在紫外灯下观察并于标准分子量相对照，所有毒株都只扩增出一条带，CV1988、 814、CVI988/BP1、648A、G2、N、YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、 GX080036、GX080051、GX080059 出现的片段分别是 738bp、735bp、738bp、818bp、952bp、 951bp、968bp、972bp、974bp、968bp、970bp、966bp、970bp、1187bp、1185bp、1188bp。7) PCR产物的纯化在紫外灯下切下步骤6)判定的片段，用SIGEMA凝胶回收试剂盒进行回收；8)PCR产物的克隆
将PCR产物与载体pMD18-T Vector进行连接，按常规方法将转化产物分别转化感 受态细胞，挑取白色单个菌落接种至含氨苄青霉素培养基中，37°C恒温震荡增菌培养12 16h。9)对步骤8)菌液PCR鉴定a.反应体系的配制，在PCR反应管内分别加入10 XBuffer 5. 0 u L, 10mM dNTP2. 0 ii L，上、下游引物各1. 0 ii L，5U/ u L Taq DNA聚合酶0. 5 y L，步骤8)的菌液 1. 0 u L，用灭菌双蒸水补足至总体积为50 u L。b. PCR反应条件与步骤4)相同、结果判定与步骤6)相同。10)扩增产物的序列测定与比较分析将步骤9)筛选到的阳性克隆交由广州Irwitrogen有限公司和上海生物工程有限 公司进行DNA序列测定，并把所测得序列在GenBank进行Blast分析。确定PCR扩增所得 的核苷酸序列属于马立克氏病病毒基因组。
权利要求
一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法，其特征在于，采用PCR技术对马立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回归鸡体内一代分离株CVI988/BP1和特超强毒株648A、超强毒株G2、N以及强毒株YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059等16个毒株进行PCR扩增，并对PCR产物进行核苷酸序列的测定得到了确认，具体操作步骤如下1)设计并合成引物根据GenBank登录号为AF243438的马立克氏病病毒Md5株的序列设计合成一对引物，上游引物USFCTAACCACAGCGTGTCTCC，下游引物USRTGTATCTTTCCTCTGCCTTG，使用前用超纯水溶解，浓度为25pmol，置于-20℃保存备用；2)毒株的处理从液氮中取出冻存毒株马立克氏病病毒血清1型活疫苗CVI988和814株、CVI988回归鸡体内一代分离毒CVI988/BP1株、10个强毒分离株分别为YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059，迅速放入37℃水浴锅使其融化，在室温1500r/min的条件下离心5min，弃去上清，用无血清的细胞培养基DMEM 1mL重新悬浮，进行细胞基因组总DNA的提取；3)DNA的提取a.抽提液的制备，将pH8.01mol/L Tris-Cl 4μL、pH8.00.5mol/L EDTA80μL、20μg/ml胰RNA酶0.8μL、重量浓度10％SDS 20μL、20mg/mL蛋白酶K3μL和超纯水42.2μL混合均匀，得到抽提液；b.取步骤2)的各细胞培养基悬浮液250μL分别置于13个1.5mL离心管中，每管加配制好的150μL抽提液，混合均匀后置55℃水浴2小时；c.从水浴中取出消化后的样品，在每管中加入饱和苯酚400μL，充分震荡摇匀后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；d.取上步骤的上清液400μL然后加入200μL的饱和苯酚和200μL的氯仿溶液，震荡摇匀后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；e.取上步骤的上清液400μL再加入体积40μL pH5.23mol/L的乙酸钠和-20℃条件下保存的无水乙醇800μL，震荡摇匀，然后在室温12000r/min的条件下离心8分钟；f.弃去上步骤的上清液，加入1mL 75％的酒精洗涤一次后，将所得核酸沉淀物放在42℃烘箱内烘干，得到DNA；g.在每管中加入20μL的超纯水，溶解DNA，获得的DNA样品置-20℃保存备用；3)PCR反应体系采用50μL的反应体系，在冰浴条件下，按下列试剂用量在16个PCR反应管中分别加入各成分10×Buffer 5.0μL，10mM dNTP 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，各个反应管分别加入2.0μL的648A、G2、N株的基因组DNA和步骤2)各样品模板DNA，用灭菌双蒸水补足至总体积为50μL；4)PCR反应条件将PCR反应管置于PCR扩增仪中进行循环，反应循环参数95℃预变性3min；30个循环94℃变性30sec、60℃退火30sec、72℃延伸1min；72℃延伸5min，得到PCR产物；5)PCR产物的检测取8μL PCR反应产物与1μL重量浓度10％溴酚蓝染料混合，放入含溴化乙锭0.5μg/mL重量浓度为1％琼脂糖凝胶孔中，在80V电压的条件下电泳1小时后，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小，在凝胶成像系统下拍照、并记录试验结果；6)结果与判定在紫外灯下观察并于标准分子量相对照，所有毒株都只扩增出一条带，CV1988、814、CVI988/BP1、648A、G2、N、YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059出现的片段分别是738bp、735bp、738bp、818bp、952bp、951bp、968bp、972bp、974bp、968bp、970bp、966bp、970bp、1187bp、1185bp、1188bp。7)PCR产物的纯化在紫外灯下切下步骤6)判定的片段，用SIGEMA凝胶回收试剂盒进行回收；8)PCR产物的克隆将PCR产物与载体pMD18-T Vector进行连接，按常规方法将转化产物分别转化感受态细胞，挑取白色单个菌落接种至含氨苄青霉素培养基中，37℃恒温震荡增菌培养12～16h；9)对步骤8)菌液PCR鉴定a.反应体系的配制，在PCR反应管内分别加入10×Buffer 5.0μL，10mM dNTP2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，步骤8)的菌液1.0μL，用灭菌双蒸水补足至总体积为50μL；b.PCR反应条件与步骤4)相同、结果判定与步骤6)相同；10)扩增产物的序列测定与比较分析将步骤9)筛选到的阳性克隆交由广州Invitrogen有限公司和上海生物工程有限公司进行DNA序列测定，并把所测得序列在GenBank进行Blast分析，确定PCR扩增所得的核苷酸序列属于马立克氏病病毒基因组。
全文摘要
本发明公开了一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法。该方法采用PCR技术对马立克氏病病毒血清1型疫苗株CVI988、814、CVI988回归鸡体内一代分离株CVI988/BP1和特超强毒株648A、超强毒株G2、N以及强毒株YL040920、GXY1、GXY2、GXYL1、GX070060、GX070079、GX070092、GX080036、GX080051、GX080059等16个毒株进行PCR扩增，并对PCR产物进行核苷酸序列的测定得到了确认。本发明所建立的方法可以对国内外广泛使用疫苗株CV1988以及814的养殖场进行肿瘤病毒检测与疾病诊断以及实验研究这些病毒株的相互鉴别。它对鸡群早期感染强毒、疾病的流行病学以及临床肿瘤病的确切诊断、环境病毒的检测和马立克氏病的预防与控制均具有十分重要的意义及应用价值。
文档编号C12Q1/70GK101875978SQ20101010779
公开日2010年11月3日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者滕丽琼, 韦平 申请人:广西大学