检测LMAN2基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测LMAN2基因mRNA的可变腺苷酸位点 使用情况的引物及方法。
【背景技术】
[0002] 马立克氏病（Marek，sdisease,MD)是由马立克氏病病毒（(Marek，sdisease virus,MDV)引起的一种禽类高度接触性、传染性、淋巴组织增生性肿瘤病，主要危害鸡，鹤 鹑、山鸡也有发病。该病可引起内脏器官、肌肉和外周神经的淋巴细胞瘤的神经肿大。临床 上MD发病鸡群表现为生长不均匀、极度消瘦、死亡等症状，最常见的病变是神经损害和多 种实质脏器的淋巴肿瘤，以肝脏、脾脏肿瘤最为多见，因神经损害导致的不对称性进行性麻 痹，最终可引起单个或多个肢体的完全性麻痹。
[0003] MDV属于疱疹病毒科，有三种不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含 有特异性抗原。I型MDV感染能引起肿瘤，II型和III型MDV毒株无致病性，可用于疫苗株。 因I型MDV感染可引起肿瘤，其检测具有非常重要的意义。目前，临床上最常用鉴别诊断I 型MDV感染的方法是病毒分离培养、血清学检测、分子生物学方法等。病毒分离鉴定不但对 临床诊断很有价值，对流行病学及病原学研究亦至关重要，但该方法检测周期长，约需1~ 2个月，同时细胞培养的操作要求高，局限性较大。血清学方法如ELISA等主要用于检测羽 毛囊上皮、溶细胞感染的淋巴细胞组织及细胞培养物等样品，此类方法检测成本相对较高， 并且由于部分病例中病毒血症时间较短，病毒含量低，导致检出率较低。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，有必要针对现有技术中检测马立克氏病病毒存在的问题，提供检测 LMAN2(lectin,mannose-binding2,LMAN2)基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物 及方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种检测LMAN2基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物，所述引物包括第一 对引物和第二对引物，其序列与LMAN2基因3'非翻译区中的两对序列或其互补序列相同。
[0007] 优选地，所述第一对引物的序列与LMAN2基因3'非翻译区中common区域的部分 序列或其互补序列相同，所述第二对引物的序列为LMAN2基因3'非翻译区中Extended区 域的部分序列或其互补序列相同。
[0008] 优选地，所述第一对引物用于扩增common区域的Proximal片段，所述第二对引物 用于扩增Extended区域的Distal片段。
[0009] 优选地，所述第一对引物的序列如SEQIDNO:1_2所示或其互补序列，所述第二对 引物的序列如SEQIDN0 :3-4所示或其互补序列。
[0010] -种检测LMAN2基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的方法，包括以下步骤：
[0011] 提取样品总RNA，逆转录得到cDNA;
[0012] 以cDNA为模板，使用第一对引物qPCR扩增common区域的Proximal片段，得到CT 值一
[0013] 以cDNA为模板，使用第二对引物扩增Extended区域的Distal片段，得到CT值 dis?
[0014] 计算CT值dls与CT值pro的比值。
[0015] 优选地，所述qPCR的反应体系为：
[0016]
[0017] 优选地，所述qPCR的反应条件为：
[0018] 预变性：95°Clmin;扩增：95°C5s，62°C15s，72°C10s信号收集，40 个循环；溶解 曲线：95°Clmin;冷却：37°Clmin。
[0019] 3 '端非翻译区（3 'UTR)作为mRNA结构的一部分，对mRNA的稳定性、定位及翻译 效率都起着重要的作用。基因最后一个外显子上的可选择性P〇ly(A)位点，可以导致不同 长度的3'UTR，即tandem3'UTR(串联3'UTR)。目前已有大量文献报道在免疫应答、神经 活化、肿瘤形成及胚胎发育过程中均有3'UTR长度的改变。在基因动态的调节过程中，选择 性聚腺苷酸化（alternativepolyadenylation，APA)在近年来受到人们的广泛关注。最近 的研究表明有超过一半的人类基因含有APA位点。这些都暗示着APA对于基因功能可能有 着重要的调控作用，也有着巨大的潜力成为新的分子标记物。随着第二代高通量测序技术 的发展，研究人员近年来开发了多种高通量测序文库制备方法来对全基因组APA进行测序 和分析。随着APA研究的深入，APA越发成为新的基因转录与翻译调控的研究热点，目前， 已有研究开始将APA作为肿瘤发生的生物学标记。
[0020] 本发明利用鸡的LMAN2基因3'非翻译区中的两对序列或其互补序列，通过实时荧 光定量PCR方法对鸡只组织或血液中的LMAN2基因信使核糖核酸mRNA的可变腺苷酸位点 使用情况进行检测，发现宿主在感染MDV后LMAN2基因可变腺苷酸位点的使用情况发生了 明显改变，可将LMAN2基因可变腺苷酸位点的使用变化作为宿主（鸡只等）感染马立克病 毒的生物学标记。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明LMAN2基因mRNA的可变腺苷 酸位点使用情况的检测方法方便快捷，灵敏度高，特异性好，适合在条件简陋的实验室以及 发展中国家得到进一步推广。
【附图说明】
[0022] 图1为mRNA结构中qPCR引物设计位点示意图。
[0023] 图2为实施例1中LMAN2基因APA的变化情况。
【具体实施方式】
[0024] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和【具体实施方式】做进一步说明。本发明中 所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。 [00 25] 实施例1
[0026]用 1X105pfuMd5 (Marek，sdiseasevirusMd5,MDVMd5)感染单层CEF细 胞（鸡胚成纤维细胞），以不感染的CEF细胞为对照，分别收集18h、36h、54h、72h后的细 胞，提取总RNA;消化DNA后，检测0D260/280,比值在2. 0-2. 1为合格，对合格的总RNA 进行SAPAS(sequenceofalternativepolyadenylationsite,SAPAS)文库的构建， 构建好的文库用Hi-Seq-2500平台进行高通量测序，对测序结果进行APA(alternative polyadenylation,APA)的分析。
[0027] 结果如图2所示，对比感染Md5和不感染Md5的CEF细胞的APA分析结果，发现 LMAN2基因多聚腺苷酸化位点的使用情况发生了明显改变，感染Md5的CEF细胞的LMAN2基 因使用远端APA位点mRNA的比例提高，可作为感染MDV的一个生物标记。
[0028] 实施例2
[0029] 本实施例中检测LMAN2基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物如表1所示。 该引物是根据LMAN2 基因（genebankAccession:X