二聚探针同时检测樱桃绿环斑驳病毒和桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及二聚探针同时检测樱桃绿环斑驳病毒和 桃潜隐花叶类病毒的斑点杂交试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 桃潜隐花叶类病毒（Peachlatentmosaicviroid，PLMVd)属于Avsunviroidae 科，主要侵染桃树、李、杏等核果类果树。1997年，Hadidi等报道PLMVd在欧洲、亚洲、 北美和南美的桃种质中广泛分布（约为55 % ) (Hadidi,A,Giunchedi,L,Shamloul,AM ,etal.,OccurrenceofPeachlatentmosaicviroidinstonefruitsandits transmissionwithcontaminatedblades.PlantDisease, 1997, 81:154-158.)〇PLMVd 在桃树上潜隐期可达5~7年，症状一般表现为花叶、延迟发芽，严重时引起早衰、甚至死 亡（DesvignesGC.PeachlatentmosaicanditsrelationtoPeachyellowmosaic virusdisease.ActaHorticulture, 1986, 193:51-57)。据报道，在我国辽宁、山东、河 北、陕西，四川，湖北等地样品检测到PLMVd，有的果园桃树PLMVd发生普遍（张少瑜，张 尊平，洪霓，等.桃潜隐花叶类病毒的鉴定.中国果树，2000,（1) :30-31.;刘晓，Barba M，Br〇ggi〇M，etal.，四川核果类果树病毒类病害田间普查与检测鉴定.西南农业学报， 2004，17(5) :613-617.;徐文兴，王国平，何云蔚，等.桃潜隐花叶类病毒中国分离株P3 的克隆与序列分析·植物病理学报，2005,35(4) :300-304. ;Yu，Y.，Zhao，Z.，Qin，L.，et al. ,IncidenceofmajorpeachvirusesandviroidsinChina.JournalofPlant Pathology, 2013, 95(3) :603-607.)。楼桃绿环斑驳病毒（Cherrygreenringmottle virus，CGRMV)是李属植物中发生较普遍，危害较严重的病毒之一。能侵染多种李属植物 包括甜樱桃，酸樱桃，樱花，桃和杏（ZhangYP,KirkpatrickBC,SmartCD，etal.cDNA cloningandmolecularcharacterizationofCherrygreenringmottlevirus. JournalofGenVirol, 1998, 79:2275-2281·)。CGRMV属于线形病毒科（Flxeviiridae) 凹陷病毒属（Foveavirus)(KingAMQ，AdamsMJ，CarstensEB，etal.Virus taxonomy:classificationandnomenclatureofviruses:Ninthreportofthe internationalcommitteeontaxonomyofviruses.ElsevierAcademicPress,San Diego, 2011.)，该病毒在北美、欧洲、新西兰、非洲和亚洲等地区分布极广。2011年我国 首次利用RT-PCR检测技术在甜樱桃和桃等李属植物中发现了CGRMV(ZhouJF，WangG P,KuangR.F. ,etal.FirstreportofCherrygreenringmottlevirusoncherry andpeachgrowninChina.PlantDisease，2011，95(10):1319·)。王文文等（王文文， 宗晓娟，陈立伟，等.山东地区樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV)的RT-PCR检测及外壳蛋白基因 的克隆.山东农业大学学报（自然科学版），2012,43(2) :206-210,219.)对山东地区甜 樱桃生产园进行病原检测，发现CGRMV发生较普遍。近年来，我们对我国主要桃产区病毒 病进行了系统调查及RT-PCR分子检测，结果表明：分别在新疆，甘肃，福建，河南，云南，广 西，河北，北京，山东等地桃树样品上均检测到PLMVd;在山东、福建和甘肃等地桃树样品上 检测到CGRMV(Yu，Y.，Zhao,Z.，Qin，L.，etal.，Incidenceofmajorpeachvirusesand viroidsinChina.JournalofPlantPathology，2013,95 (3) :603-607. )。2013 年6 月 我们对福建不同果园桃树43个显症和不显症的样品进行了 6种主要病毒：苹果褪绿叶斑 病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV)，李属坏死环斑病毒（Prunusnecrotic ringSpotviru S，PNRSV)，CGRMV，杏假褪绿叶斑病毒（APCLSV)，李树皮坏死与茎痘伴随病毒 (Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus，PBNSPaV)，白蝶兰（属）花叶病 毒（Pecteilismosaicvirus，PcMV)，2 种类病毒（PLMVd和啤酒花矮化类病毒（Hopstunt viroid，HSVd)检测，43个样品中只检测到PLMVd，HSVd和CGRMV三种病原，而且，CGRMV主 要是与PLMVd复合侵染为主，复合侵染率较高。
[0003] 目前关于果树病毒和类病毒检测方法主要有：生物学方法、血清学方法和电子显 微镜测定方法和分子生物学方法。分子生物学检测法包括核酸分子杂交和PCR测定法等， 因其快速、灵敏、准确等特点，已逐渐成为植物病毒和类病毒研究和检测的重要方法之一。 虽然PCR，RT-PCR等方法敏感度高，但该方法需要专门的仪器设备，由于污染，可能产生假 阳性，而核酸分子杂交方法灵敏性和特异性都较强，其中斑点杂交方法在尼龙膜上进行，只 要具备探针，检测操作简单方便，适合基层应用，能够一次检测大量样品。
[0004] 在过去的几年，同时检测多种植物病毒非同位素标记的分子杂交技术已成为 重要的途断方法（reviewsinJamesD.，Varga，A.，Pallas，V.，etal.Strategiesfor simultaneousdetectionofmultipleplantviruses.CanadianJournalofPlant Pathology，2006,28:16-29.)〇Herranzetal. (Herranz,M.C. ,Sanchez-Navarro,J. A.，Aparicio,F.，etal. ,Simultaneousdetectionofsixstonefruitvirusesby non-isotopicmolecularhybridizationusingauniqueriboprobeor'polyprobe' · JournalofVirologicalMethods，2005, 124:49-55.)报道，通过分子克隆和连接，串 联几个病毒核酸序列，合成非同位素标记的digoxigenin标记的单一分子探针，叫多聚 探针（polyprobe)，能同时检测六个核果的病毒（苹果花叶病毒（Applemosaicvirus， ApMV)，PNRSV，李矮缩病毒（Prunedwarfvirus，PDV)，美洲李线纹病毒Americanplum linepatternvirus(APLPV)，李痕病毒（Plumpoxvirus，PPV)，ACLSVD 相比混合在一 起单探针，polyprobe能减少处理时间和总成本。随后，这方法应用于同步检测核果多个 类病毒（Cohen，0·，Batuman，0·，Stanbekova，G.，etal. ,Constructionofamultiprobe forthesimultaneousdetectionofviroidsinfectingcitrustrees.Virus Genes, 2006, 33:287-292. ；Lin,L. ,Li,R. ,Mock,R. ,etal. ,Developmentofapolyprobe todetectsixviroidsofpomeandstonefruittrees.JournalofVirological Methods，2011，171:91-97.；ZhangZ. ,Peng,S. ,Jiang,D. ,etal. ,Developmentofa polyprobeforthesimultaneousdetectionoffourgrapevineviroidsingrapevine plants.EuropeanJournalofPlantPathology，2012, 132:9-16·)。而同时检测病毒与 类病毒的polyprobe，目前有一篇报道，Peiroetal(Peiro,Α·，Pallds，V.，S(inchez-Nav arro,J.A. ,Simultaneousdetectionofeightvirusesandtwoviroidsaffecting stonefruittreesbyusingauniquepolyprobe.EuropeanJournalofPlant Pathology，2012, 132:469-475.)在Herranzetal. (Herranz,M.C. ,Sanchez-Navarro,J. A. ,Aparicio,F.,etal. ,Simultaneousdetectionofsixstonefruitvirusesby non-isotopicmolecularhybridizationusingauniqueriboprobeor<polyprobe,. JournalofVirologicalMethods, 2005, 124:49-55.)用多聚探针同时检测六个核果病毒 的基础上，又增加了两个核果病毒和两个核果类病毒（HSVd，PLMVd)。目前，尚未有用于果 树病毒和类病毒