检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及乙型肝炎病毒（HBV)核酸的检测。更具体地，本发明涉及针对HBV多 个保守基因序列的特异性引物、引物组和/或探针，包含HBV特异性引物组和/或探针的用 于特异性检测HBV核酸的组合物，包含所述组合物的HBV高灵敏性检测试剂盒，以及用于高 灵敏特异性检测HBV核酸的方法。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，我国属于乙型肝炎感染地 方性流行区。HBV感染是多种肝脏疾病的主要原因，长期HBV感染易引起慢性肝炎、肝硬化、 肝衰竭和原发性肝癌等疾病。因此，对慢性乙型肝炎进行积极的治疗或干预具有重要的意 义。乙肝病毒复制是慢性乙型肝炎活动的根本原因。因此，需要定期对乙肝患者体内的HBV 病毒水平进行准确地定量检测，以确定慢性乙型肝炎的治疗时机和治疗方案。
[0003]HBV病毒水平的定量检测除用于慢性乙肝的监测外，感染者外周血中HBV的病毒 载量也是决定是否需要抗病毒治疗的重要指标，用药后病毒载量的变化也是判断抗病毒治 疗效果的重要依据，对判断疗效、预后和耐药发生至关重要，是对治疗方案进行优化和调整 的重要依据。因此，高敏感高特异的HBV核酸定量检测方法对乙肝的治疗具有重要的临床 指导意义。
[0004] 目前国内大多数医疗机构普遍采用国产的荧光定量PCR试剂来监测患者外周血 中的HBV病毒载量。此类国产试剂相比进口试剂往往价格较便宜，但普遍存在灵敏度不高， 重复性较差，对于较低水平的病毒载量（低于30IU/ml)往往不能准确地检出等问题。目前 在国内应用较多的进口试剂主要有罗氏的COBASamplicor及COBASTaqman，其中C0BAS TaqmanHBVDNA检测是美国批准的唯一一种采用Taqman技术的自动控制技术，是慢性乙型 肝炎临床实践指南中推荐的HBVDNA检测方法。该方法具有灵敏度高、线性范围宽、重复性 好等优点，检测范围可达20IU/ml~1.7X10sIU/ml，但其设备昂贵，检测费用高，目前还难 以在临床上广泛应用，特别是经济欠发达地区。另外，其检测下限为20IU/ml，治疗后病人 体内的HBVDNA水平可能低于其检测下限而被漏检。因此，目前亟需一种更加高灵敏、高特 异、重复性好的HBV核酸的检测方法，以指导慢性乙型肝炎的临床治疗。
[0005] 此外，目前市场上的HBVDNA检测试剂一般针对HBV基因中遗传变异较小的基因 区进行检测，如S区，C区，X区等。虽然这些区域较为保守，但也具有低概率的变异，如突 变，且不同亚型之间的序列也存在多态性。如果在引物探针结合的碱基序列中发生变异或 存在多态性，就有可能导致PCR扩增失败而出现假阴性结果，影响对HBV感染的诊断及慢性 乙型肝炎的治疗。如果同时针对HBV的两个或多个保守基因进行检测，则可以避免上述假 阴性结果的出现，从而大大提高检测试剂盒的灵敏度和准确性。目前已有针对HBV两个基 因区同时进行检测的报道，如凯杰生物工程（深圳）有限公司在专利"用于检测人乙型肝炎 病毒的引物组和探针"中的关于同时检测HBVS区及前核心区的报道。虽然相比于单基因 检测，双基因检测能大大降低漏检的风险，但当两个基因同时存在突变时，也可能会导致扩 增失败而漏检。另外，目前的方法仍存在检测灵敏度低（检测限仅为20IU/ml)、定量限低 (仅为40IU/ml)等问题。因此，仍然需要一种灵敏度更高、特异性更好、突变包容性更好的 HBV核酸定量检测方法。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明的目标在于提供能满足上述要求的用于高灵敏检测 HBV核酸的引物组、探针以及包含所述引物组和探针的试剂盒。本发明的引物组和探针可以 同时检测HBV基因的三个保守基因区域，因此可解决因HBV其中一个或两个基因序列突变 而产生漏检的问题。此外，为了解决由于不同基因型之间扩增效率差异而敏感度不同的问 题，本发明在引物和探针的变异位置引入了核苷类似物I碱基，提高了引物和探针对不同 基因序列的包容性，以保证不同基因型都具有较高的敏感性。
[0007] 本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 本发明的一个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的引物组，所述引物组 包括至少一种选自以下的引物组：
[0009] (1)引物组1，其包含具有SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 2 所示的核苷酸序列的引物；和
[0010] ⑵引物组2,其包含具有SEQIDN0. 3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 4 所示的核苷酸序列的引物；和
[0011] ⑶引物组3,其包含具有SEQIDN0. 5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 6 所示的核苷酸序列的引物。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的探针，所述探针包 括至少一种选自以下的探针，或者包括至少一种以下序列的反向互补序列：
[0013] (1)探针1，其具有如SEQIDN0. 7所示的核苷酸序列；和
[0014] (2)探针2,其具有如SEQIDN0. 8所示的核苷酸序列；和
[0015] (3)探针3,其具有如SEQIDN0.9所示的核苷酸序列；
[0016] 以上用于检测HBV核酸的探针的一个末端标记荧光基团，且用于检测HBV核酸的 探针的另一个末端标记淬灭基团。其中用于检测HBV核酸的探针的一个末端所标记的荧光 基团为FAM、R0X、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但 并不限于上述几种；用于检测HBV核酸的探针另一个末端所标记的淬灭基团为BHQ、TAMRA、 MGB和DABCYL中的任一种，但并不限于上述几种。
[0017] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒核酸的组合物。在一个实 施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2的引物对和具有碱 基序列SEQIDN0. 7的探针；在另一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQID NO. 3和SEQIDNO. 4的引物对和具有碱基序列SEQIDNO. 8的探针；在再一个实施方式中， 所述组合物包含具有碱基序列SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6的引物对和具有碱基序列SEQ IDN0. 9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 2的引物对、具有碱基序列SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引物对和具有碱基序列 SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8的探针；在又一个实施方式中，所述组合物包含具有碱基序列 SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2的引物对、具有碱基序列SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6的引物 对和具有碱基序列SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 9的探针；在又一个实施方式中，所述组合物 包含具有碱基序列SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO. 5和 SEQIDNO. 6的引物对和具有碱基序列SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9的探针；在又一个实 施方式中，所述组合物包含具有碱基序列SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2的引物对、具有碱基 序列SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引物对、具有碱基序列SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6 的引物对和具有碱基序列SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9的探针。此外，上述 组合物还均包含对HBV检测无干扰的具有碱基序列SEQIDNO. 10的内标探针，或者其反向 互补序列。该内标探针的一个末端标记荧光基团，且该内标探针的另一个末端标记淬灭基 团，其中所述内标探针的上述一个末端标记的荧光基团为FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、 TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但并不限于上述几种，且该内标探针所标记的荧 光基团不同于用于检测HBV核酸的探针末端所标记的荧光基团。
[0018] 本发明的第四个目的是提供一种用于特异性检测HBV核酸的试剂盒，其含有本发 明的上述至少一种引物组和/或上述至少一种探针。具体为，该试剂盒包含至少一种选自 以下所述的引物组：
[0019] (1)引物组1，其包含具有SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 2 所示的核苷酸序列的引物；和
[0020] (2)引物组2,其包含具有SEQIDN0. 3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 4 所示的核苷酸序列的引物；和
[0021] (3)引物组3,其包含具有SEQIDN0. 5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 6 所示的核苷酸序列的引物。
[0022] 该试剂盒还包含至少一种选自以下的探针，或者包含至少一种以下序列的反向互 补序列：（1)探针1，其具有如SEQIDN0. 7所示的核苷酸序列；和
[0023] (2)探针2,其具有如SEQIDN0. 8所示的核苷酸序列；和
[0024] (3)探针3,其具有如SEQIDN0. 9所示的核苷酸序列；
[0025] 以上所述探针的一个末端标记荧光基团，且另一个末端标记淬灭基团，其中荧光 基团为FAM、R0X、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一种，但并 不限于上述几种；