检测叶酸代谢相关基因的方法和试剂盒的制作方法

检测叶酸代谢相关基因的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测叶酸代谢能力相关基因的方法，包括：获取受检者核酸，核酸包含DNA片段；检测以下至少两个SNP位点的基因型，MTRR基因c.66A>G、MTHFR基因c.677C>T和MTHFR基因c.1298A>C，其中包括，利用第一引物扩增包含SNP位点的DNA片段，获得扩增产物，将第二引物与扩增产物结合，延伸一个碱基，获得延伸产物，依据延伸产物与第二引物的分子量差异，确定SNP位点的碱基类型。本发明还公开一种检测叶酸代谢能力基因的试剂盒。利用本发明的方法和/或试剂盒，能够高通量、低成本、高准确度、耗时短的对叶酸代谢相关基因进行分型，分型结果能够用以辅助指导受检者补充叶酸。
【专利说明】
检测叶酸代谢相关基因的方法和试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体的，本发明涉及一种检测叶酸代谢相关基因的方 法和一种试剂盒。
【背景技术】
[0002] 叶酸（蝶酰单谷氨酸）是指具有相关生物活性的一类同效维生素，由蝶啶、对氨 基苯甲酸和1个或多个谷氨酸结合而成，即由a-氨基-4-羟基蝶啶与对氨基苯甲酸相连 接，再以-NH-C0-键与谷氨酸连接组成，其不同的辅酶形式可以作为一碳单位的供体或载 体而发挥作用，主要参与以下几类反应：①蛋氨酸合成；②嘌呤和嘧啶的合成；③丝氨酸和 甘氨酸的相互转化；④组氨酸的降解。大量的科学研究表明，叶酸摄入绝对或相对的缺乏， 是引起高同型半胱氨酸血症的直接原因。高同型半胱氨酸血症可能导致新生儿神经管缺陷 (NTDs)、唐氏综合症（DS)、先天性心脏病（CHD)、唇腭裂；孕妇妊娠期高血压、早产、自发性 流产。
[0003] 目前了解到涉及叶酸代谢能力的关键基因包括亚甲基四氢叶酸还原酶 (methylenete-trahydmfolate reductase, MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶（methionine synthase reductase, MTRR)。这两种酶的基因出现位点变异导致酶活性降低，会显著影响 机体的叶酸代谢能力。

【发明内容】

[0004] 依据本发明的一方面，本发明提供一种检测叶酸代谢能力基因的方法，包括如下 步骤：获取受检者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述DNA片段来自断裂的基因组DNA和 /或游离DNA;检测以下叶酸代谢能力基因的SNP位点中的至少两个的基因型，MTRR基因 c. 66A>G、MTHFR基因 c. 677C>T和MTHFR基因 c. 1298A>C，其中包括，利用第一引物扩增包 含所述SNP位点的DNA片段，获得扩增产物，将第二引物与所述扩增产物结合，延伸一个碱 基，获得延伸产物，依据所述延伸产物与所述第二引物的分子量差异，确定所述SNP位点的 碱基类型。受检者可以是人或者其它哺乳动物。上述3个SNP位点是发明人经过收集、 筛选组合获得的与个体叶酸代谢能力遗传强相关的多态性位点。亚甲基四氢叶酸还原酶 (methylenete-trahydmfolate reductase, MTHFR)的 C677T 位点和 A1298C 位点催化产生 5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递及核苷酸合成通路，MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸在体 内积累。甲硫氨酸合成酶还原酶（methionine synthase reductase, MTRR)的A66G位点将 失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，维持甲基传递通路继续进行，MTRR酶的活性降低， 易致同型半胱氨酸血症、神经管缺陷等疾病。上述SNP位点是根据HGVS命名法标注该位点 在参考cDNA上的位置来表示的，是为简便指代某个特定SNP位点，一个SNP位点还可以有 其它表示方式，如以下会出现的的以"rs"开头的SNP位点表示方式，rsl801394与MTRR基 因 c. 66A>G(A66G)表示同一个位点，该方式是GenBank SNP数据库的命名方法，以rs加7 位阿拉伯数字来表示一个SNP，本领域普通技术人员知道，采用其它命名方式比如以该SNP 在参考gDNA上的位置来标注指代与本发明一样的SNP或SNP组合也属于本发明范围。根 据数据库如SNP数据库中确定并获得特定SNP位点在基因序列上的位置信息的同时，也能 获得其前后序列、分布频率等。本发明利用上述3个SNP位点中的至少两个，确定各SNP位 点的前后序列，依据其前后序列设计第一引物和第二引物，利用第一引物扩增待检核酸，能 够将待检核酸中的包含相应SNP位点的DNA片段扩增出来，接着基于扩增出来的包含上述 位点的DNA片段，利用第二引物利用单碱基延伸方法检测那些位点的碱基类型，获得那些 位点的基因型。该方法是一种高通量、低成本、高准确度、检测周期短的叶酸代谢相关基因 分型方法，能够用以辅助指导受检者补充叶酸。当受检者为孕妇时，在正确的时间补充合适 剂量的叶酸，能够避免孕妇发病风险和婴儿出生缺陷。
[0005] 在本发明的一个实施例中，所述第一引物包括多条第一序列，用于分别扩增包含 不同目标SNP位点的DNA片段，所述第一序列的5'端包含相同的标签，利于扩增产物的识 另IJ，在本发明的一个实施例中，所带的标签都为acgttggatg(SEQ ID N0:10)。在本发明的 一个实施例中，扩增产物为约l〇〇bp的DNA片段。
[0006] 在本发明的一个实施例中，在延伸反应之前，还包括利用碱性磷酸酶（AP)，例如利 用重组虾碱性磷酸酶（rSAP)去除扩增反应体系中的的dNTP，防止dNTP参与下一步的单碱 基延伸PCR反应。
[0007] 在本发明的一个实施例中，所述第二引物包括多条第二序列，用于分别对包含不 同目标SNP位点的扩增片段进行单碱基延伸，任两条所述第二序列的分子量差异不小于 30Da，以使能够一起使用同时检测出各自延伸的碱基。在本发明的一个实施例中，所述第二 序列的长度为17~28nt，有利于多条第二序列在同一反应体系各自进行单碱基延伸，使获 得的延伸产物的3'端碱基为相应SNP位点，以使能够准确检测出位点的碱基类型。
[0008] 在本发明的一个实施例中，所述第二序列的5'端包含不多于5个不能结合上所述 扩增产物的核苷酸。这里，所说的5'端包括从一条序列的5'末端的首个碱基到该序列的 中心碱基的部分，剩下部分可相应的称为3'端。所说的不能结合上指不能互补配对。
[0009] 在本发明的一个实施例中，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸序 列的分子量差异不小于30Da，利于检测出各延伸序列上所带的延伸得的单碱基的类型。 [0010] 较佳的，本发明中的第一引物的多条第一序列之间或者第二引物的多条第二序列 之间无明显的二聚物（dimer)、错配（mismatch)或发卡结构（hairpin)。在本发明的一个 实施例中，提供一组包含至少4条能够能够在同一反应体系中一起使用的具体序列，例如， 当所述SNP位点包含MTRR基因 c. 66A>G，所述第一引物包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2， 所述第二引物包含SEQ ID N0:3;当所述SNP位点包含MTHFR基因 c. 677C>T，所述第一引 物包含SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5,所述第二引物包含SEQ ID N0:6;当所述SNP位点包 含MTHFR基因 c. 1298A>C，所述第一引物包含SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8,所述第二引物 包含SEQ ID NO :9。上述各第一引物或第二引物包含的序列分别能够扩增或延伸包含各自 所包含的SNP位点的DNA片段，而且上述任两组或者全部三组第一引物都能够在同一反应 体系中扩增各自的目标DNA片段，上述任两个或者全部三个第二引物都能够在同一反应体 系中单碱基延伸各自的目标扩增产物。SEQ ID N0 :1~9及其与位点的对应关系如表1所 不。
[0011]表 1
[0013] 在本发明的一个实施例中，利用质谱确定所述SNP位点的碱基类型，例如，通过 MALDI-T0F质谱检测纯化后延伸产物的分子量。较佳的，在单碱基延伸之后，对所述延伸 产物进行纯化，例如利用阳离子交换树脂纯化以减少阳离子对质谱检测准确度的影响。延 伸产物分子量的检测过程包括：通过点样设备将纯化后的延伸产物转移到芯片的基质上， 延伸产物分子和基质形成共结晶薄膜，基质在激光激发下电离，产物分子带上等量电荷，通 过高压电场通道到达信号接收器。产物分子通过高压电场通道的时间和产物分子量成正 比。通过比较延伸产物和延伸引物分子量的差值，根据A\T\C\G碱基之间道尔顿分子量的 差异，进行目标位点的基因分型。表2显示一组延伸引物及对应的延伸产物的信息。
[0014] 表 2
[0017] 在本发明的一个实施例中，该方法还包括：当SNP位点的基因型包含（i)，判定受 检者叶酸代谢高度障碍，当SNP位点的基因型包含（ii)，判定受检者叶酸代谢中度障碍， 当SNP位点的基因型包含（iii)，判定受检者叶酸代谢能力低度障碍，当SNP位点的基因型 不包含任一（丨)-(^丨），判定受检者叶酸代谢正常；所称（丨)1了1^基因(3.664>6的基因型 为GG，或者MTHFR基因 c. 677C>T的基因型为TT，或者MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型为 CC，（ii)MTRR基因 c. 66A>G的基因型为AG，（iii)MTHFR基因 c. 677C>T的基因型为CT，并 且MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型为AC。依此，可以辅助进一步对受检者给出判断建议。 表3显示3个位点的基因型对叶酸代谢能力的影响程度以及可划分出的风险等级。进一步 的，由于一般认为叶酸代谢能力是由2个基因共同决定的，受检者的叶酸代谢能力可以根 据2个基因的风险等级进行综合评估，在本发明的一个实施例中，在受检者是准备怀孕或 是怀孕中的人时，表4示意根据一个具体评估方法划分的风险等级后可采用的叶酸补充量 建议。
[0022] 利用本发明这一方面的方法检测叶酸代谢能力基因，具有以下效果：1)低成本， 能够实现将多个SNP位点在同一个反应体系中进行检测，检测成本大大降低；2)高通量，本 方法在微量反应体系中进行，检测通量高，检测过程自动化程度高，每日通量可达2000例； 3)实验操作简单，检测结果自动判读、准确性高；4)与测序相比，具有低成本、高通量、快 速、操作简单等优势；5)检测结果全面，能够对叶酸代谢主要通路中的2个主要相关基因的 多个位点进行检测、综合评估。
[0023] 依据本发明的另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括引物对，所述引物对包含 第一引物和第二引物，所述引物对能够用以确定以下3个SNP位点中的至少2个的碱基类 型：MTRR基因 c. 66A>G、MTHFR基因 c. 677C>T和MTHFR基因 c. 1298A>C。在本发明的一个实 施例中，该试剂盒包含的引物对能够用以确定全部3个SNP位点的碱基类型。上述对本发 明一方面的或者任一【具体实施方式】中的方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这 一方面的试剂盒，在此不再赘述。
[0024] 在本发明的一个实施例中，所述第一引物包括多条第一序列，用于分别扩增包含 不同目标SNP位点的DNA片段，所有第一序列的5'端都包含相同的标签，利于识别扩增产 物，在本发明的一个实施例中，所带的标签为acgttggatg。
[0025] 在本发明的一个实施例中，所述第二引物包括多条第二序列，用于分别对包含不 同目标SNP位点的扩增片段进行单碱基延伸，任两条所述第二序列的分子量差异不小于 30Da，以使能够一起使用同时检测出各自延伸的碱基。在本发明的一个实施例中，所述第二 序列的长度为17~28nt，有利于多条第二序列在同一反应体系各自进行单碱基延伸，使获 得的延伸产物的3'端碱基为相应SNP位点，以使该试剂盒能够准确检测出位点的碱基类 型。
[0026] 在本发明的一个实施例中，所述第二序列的5'端包含不多于5个不能结合上所述 扩增产物的核苷酸。这里，所说的5'端包括从一条序列的5'末端的首个碱基到该序列的 中心碱基的部分，剩下部分可相应的称为3'端。所说的不能结合上指不能互补配对。
[0027] 在本发明的一个实施例中，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸序 列的分子量差异不小于30Da，利于该试剂盒检测出各延伸序列上所带的延伸单碱基的类 型。
[0028] 在本发明的一个实施例中，提供一组包含至少4条能够能够在同一反应体系中 一起使用的具体序列，例如，当所述SNP位点包含MTRR基因 c. 66A>G，第一引物包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2,第二引物包含SEQ ID N0:3;当所述SNP位点包含MTHFR基因 c. 677C>T，第一引物包含 SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5,第二引物包含 SEQ ID N0:6;当所 述SNP位点包含MTHFR基因 c. 1298A>C，第一引物包含SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8,第二 引物包含SEQ ID NO :9。上述各第一引物或第二引物包含的序列能够用以扩增或延伸包含 各SNP位点的DNA片段，而且上述任两组或者全部三组第一引物都能够在同一反应体系中 扩增各自的目标DNA片段，上述任两个或者全部三个第二引物都能够在同一反应体系中单 碱基延伸各自的目标扩增产物。
【附图说明】
[0029] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将 变得明显和容易理解，其中：
[0030] 图1是本发明的一个实施例中的对待测样本中的MTRR, c. 66A>G位点的检测结果， 其中，图1A是位点的检测结果为AA基因型的示意图，图1B是位点的检测结果为AG基因型 的不意图；
[0031] 图2是本发明的一个实施例中的对待测样本中的MTHFR, c. 677C>T位点的检测结 果，其中，图2A是位点的检测结果为CC基因型的示意图，图2B是位点的检测结果为CT基 因型的示意图，图2C是位点的检测结果为TT基因型的示意图；
[0032] 图3是本发明的一个实施例中的对待测样本中的MTHFR, c. 1298A>C位点的检测结 果，其中，图3A是位点的检测结果为AA基因型的示意图，图3B是位点的检测结果为AC基 因型的示意图。
【具体实施方式】
[0033] 以下结合具体实施例对本发明检测方法和/或试剂盒进行详细的描述。下面示 例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明， "多个"的含义是两个或两个以上。
[0034] 除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列（接头、标签和引物）、 软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的，比如购自Sequenom公司的飞行时间质谱试剂 盒来进行质谱检测等。
[0035] 实施例一
[0036] 收集选择MTRR基因的66A>G位点以及MTHFR基因的6770T位点和1298A>C位点 共3个与叶酸代谢能力相关的位点。以下第一引物也称为扩增引物，第二引物也称为延伸 引物，未强调第一或第二引物的引物可以为包含第一引物和/或第二引物。
[0037] 针对所述7个位点进行扩增引物和延伸引物设计和优化，可在确定目标位点的 上下游序列后进行引物设计，使扩增引物或者延伸引物之间无严重的dimer、mismatch和 hairpin，使扩增引物长度在30个碱基左右，扩增引物在5'端具有10个碱基acgttggatg 的标签序列，延伸引物的长度在17-28个碱基左右，允许延伸引物5'端1-5个碱基与模板 (扩增产物）不完全匹配，延伸引物的3'末端碱基与目的检测位点紧相邻的碱基匹配。7 个位点的所有延伸引物和/或所延伸产物的分子量差异不小于30道尔顿。
[0038] 所述每个基因位点各自对应1条F向扩增引物、1条R向扩增和1条延伸引物。所 述3个位点、引物、产物之间的对应关系详见表1和表2。
[0039] 实施例二
[0040] 1)DNA 提取
[0041] 收集了 18份人全血样本，使用chelex-100(树脂法）提取DNA。
[0042] 2) PCR 扩增
[0043] 通过本步PCR扩增，获得包含目的位点的DNA片段。PCR扩增反应体系参见表 5。其中，所有试剂购买自美国Sequenom公司，PCR仪为GeneAmp?: PCR System 9700Dual 384-Well Sample Block Module。
[0044] 表 5
[0045]
[0046] PCR反应条件为94°C，2分钟；94°C变性20秒，56退火30秒，72延伸1分钟，共扩 增45个循环；最后72 °C延伸5分钟。
[0047] 在PCR时，使用的阳性对照为已知序列的正常的人类基因组DNA，阴性对照为无菌 双蒸水。
[0048] 3) SAP 处理
[0049] 上步扩增产物使用SAP酶（虾碱性磷酸酶）处理，去除产物中的dNTP，防止残余 的dNTP参与下一步的单碱基延伸PCR反应。SAP酶反应体系见表6。所有试剂购买自美 国 Sequenom 公司，PCR 仪为 GeneAmpK:PCR System 9700Dual 394-Well Sample Block Module。
[0050] 表 6
[0051]

[0052] SAP酶反应条件为37°C温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP ;85°C温 育5分钟，使SAP酶失活。
[0053] 4)单碱基延伸PCR反应
[0054] 在虾碱性磷酸酶处理后的扩增产物中加入延伸引物、ddNTP以及PCR其他反应成 分，进行单碱基延伸PCR反应。PCR扩增反应体系参见表7。所有试剂购买自美国Sequenom 公司，PCR 仪为GcncAmp? PCR System 9700Dual 394-Well Sample Block Module。
[0055] 表 7
[0056]
[0057] 延伸反应条件为94°C，30秒；94°C变性5秒，52 °C退火5秒，80 °C延伸5秒，共扩增 40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72°C延伸3分钟。
[0058] 5)树脂纯化
[0059] 在延伸产物中加入6mg树脂，18. 00 μ 1水，垂直摇匀40min。经过本步纯化后，反 应体系中的阳离子与树脂充分结合，离心后树脂沉降在反应孔底部，从而实现产物脱盐。上 清可用于质谱检测。树脂型号08040,购买自美国Sequenom公司。
[0060] 6)质谱检测
[0061] 通过点样仪（型号 MassARRAY Nanodispenser RS 1000,购买自美国 Sequenom 公 司），将树脂纯化后的延伸产物转移到芯片基质上，基质和产物形成共结晶薄膜，芯片转移 至 Sequenom MALDI-T0F 质谱仪（型号 MassARRAYAnalyzer Compact，购买自美国 Sequenom 公司）上进行检测，确定检测位点基因型。
[0062] 7)质谱检测结果
[0063] 质谱检测结果如图1-3所示。以下所称的"结果与实际一致"是指质谱检测结果 与sanger验证结果一致。
[0064] 图1显示了使用MTRR，c. 66A > G位点的延伸引物对待测样本MTRR，c. 66A > G位 点的检测结果。从图1A可知，MALDI-T0F质谱检测在分子量5426. 4检测到峰，所述峰经分析 确认为A，结果与实际一致。从图1B可知，MALDI-T0F质谱检测在分子量5346. 5和5426. 4 检测到峰，所述峰经分析确认为杂合AG，结果与实际一致。
[0065] 图2显示了使用MTHFR，c. 677C > T位点的延伸引物对待测样本MTHFR，c. 677C > T位点的检测结果。从图2A可知，MALDI-T0F质谱检测在分子量5891. 9检测到峰，所述峰 经分析确认为C，结果与实际一致。从图2B可知，MALDI-T0F质谱检测在分子量5891. 9和 5971. 8检测到峰，所述峰经分析确认为杂合CT，结果与实际一致。从图2C可知，MALDI-T0F 质谱检测在分子量5971. 8检测到峰，所述峰经分析确认为T，结果与实际一致。
[0066] 图3显示了使用MTHFR, c. 1298A>C位点的延伸引物对待测样本MTHFR, c. 1298A>C 位点的检测结果。从图3A可知，MALDI-T0F质谱检测在分子量6091. 9检测到峰，所述峰经分 析确认为A，结果与实际一致。从图3B可知，MALDI-T0F质谱检测在分子量6052和6091. 9 检测到峰，所述峰经分析确认为杂合AC，结果与实际一致。
[0067] 8)所测样本来源个体的叶酸代谢能力综合评估结果见表8。
[0068] 9)以上所有检测结果都经sanger验证，结果和质谱检测结果完全一致。
[0069] 表 8
[0070]

【主权项】
1. 一种检测叶酸代谢能力基因的方法，其特征在于，包括， 获取受检者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或 游离DNA ; 检测以下叶酸代谢能力基因的SNP位点中的至少两个的基因型， MTRR 基因 c. 66A>G、MTHFR 基因 c. 6770T 和 MTHFR 基因 c. 1298A>C， 其中包括， 利用第一引物扩增包含所述SNP位点的DNA片段，获得扩增产物， 将第二引物与所述扩增产物结合，延伸一个碱基，获得延伸产物， 依据所述延伸产物与所述第二引物的分子量差异，确定所述SNP位点的碱基类型。2. 权利要求1的方法，其特征在于，所述第一引物包括多条第一序列，所述第一序列的 5'端包含相同的标签； 任选的，所述标签为acgttggatg。3. 权利要求1的方法，其特征在于，所述第二引物包括多条第二序列，任两条所述第二 序列的分子量差异不小于30Da。4. 权利要求3的方法，其特征在于，所述第二序列的长度为17~28nt。5. 权利要求3的方法，其特征在于，所述第二序列的5'端包含不多于5个不能结合上 所述扩增产物的核苷酸。6. 权利要求1的方法，其特征在于，所述延伸产物的3'端碱基为所述SNP位点。7. 权利要求1的方法，其特征在于，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸 序列的分子量差异不小于30Da。8. 权利要求1-7任一方法，其特征在于，当所述SNP位点包含MTRR基因 c. 66A>G，所述 第一引物包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2,所述第二引物包含SEQ ID NO :3 ; 当所述SNP位点包含MTHFR基因 c. 677C>T，所述第一引物包含SEQ ID N0:4和SEQ ID NO :5,所述第二引物包含SEQ ID NO :6 ; 当所述SNP位点包含MTHFR基因 c. 1298A>C，所述第一引物包含SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8,所述第二引物包含SEQ ID NO :9。9. 权利要求1-8任一方法，其特征在于，利用质谱确定所述SNP位点的碱基类型。10. 权利要求1-9任一方法，其特征在于，还包括， 当所述SNP位点的基因型包含（i)，判定所述受检者为叶酸代谢能力高度障碍， 当所述SNP位点的基因型包含（ii)，判定所述受检者为叶酸代谢能力中度障碍， 当所述SNP位点的基因型包含（iii)，判定所述受检者为叶酸代谢能力低度障碍， 当所述SNP位点的基因型不包含任一（i)-(iii)中的任一基因型，判定所述受检者为 叶酸代谢能力正常， (i) MTRR基因 c. 66A>G的基因型为GG，或者MTHFR基因 c. 677C>T的基因型为TT，或者 MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型为CC， (ii) MTRR基因 c. 66A>G的基因型为AG， (iii) MTHFR基因 c. 677C>T的基因型为CT，并且MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型为AC。11. 一种试剂盒，其包括引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述引物对能 够用以确定以下3个SNP位点中的至少2个的碱基类型：MTRR基因 c. 66A>G、MTHFR基因 c. 677C>T 和 MTHFR 基因 c. 1298A>C ; 任选的，所述引物对能够用以确定所述3个SNP位点的碱基类型； 任选的，所述第一引物包括多条第一序列，所有所述第一序列的5'端都包含相同的标 签； 任选的，所述标签为acgttggatg ; 任选的，所述第二引物包括多条第二序列，任两条所述第二序列的分子量差异不小于 30Da ; 任选的，所述第二序列的长度为17~28nt ; 任选的，所述第二序列的5'端包含不多于5个不能结合上所述扩增产物的核苷酸； 任选的，所述延伸产物的3'端碱基为所述SNP位点； 任选的，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸序列的分子量差异不小于 30Da ; 任选的，当所述SNP位点包含MTRR基因 c. 66A>G，所述第一引物包含SEQ ID N0:1和 SEQ ID N0:2,所述第二引物包含SEQ ID N0:3， 当所述SNP位点包含MTHFR基因 c.677C>T，所述第一引物包含SEQIDN0:4和SEQID NO :5,所述第二引物包含SEQ ID NO :6 ; 当所述SNP位点包含MTHFR基因 c. 1298A>C，所述第一引物包含SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8,所述第二引物包含SEQ ID NO :9。
【文档编号】C12Q1/68GK105986010SQ201510047570
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】王晓楠, 张俊青, 李智丽, 杨玲
【申请人】天津华大基因科技有限公司, 深圳华大基因科技有限公司