专利名称：分泌型碱性磷酸酶示踪ta克隆真核表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种真核表达载体，具体地说是一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆 真核表达载体。
背景技术：
真核基因在细胞内的临时表达对于研究基因在细胞内的功能具有重要意义，在当 今大多数高水平的论著中多用真核表达质粒来实现，然而由于质粒转染真核细胞的效率与 转染试剂、细胞类型、细胞状态等有很大的关系。其转染效率从低到小于到高达90%以 上不等。而转染效率又直接影响到后续的研究结果。一般低于10%的转染效率就很难达到 预期的效果，不仅浪费了材料而且导致研究失败。目前现阶段转染效率很难估计，通常需要转染大量荧光蛋白基因用以分选转染细 胞。同时由于在同一实验中不同的转染效率差异直接影响到结果的可比性，因此构建一个 具有示踪作用的真核转染质粒具有重要意义。分泌型碱性磷酸酶在科研上被广泛用于启动子研究的报告基因，是一个很好的真 核转染示踪蛋白。目前被广泛应用的基因表达示踪蛋白为EGFP，可通过荧光显微镜直接观 测转染效率，但不能进行定量分析。另外还有半乳糖苷酶基因，通过化学显色或ELISA 进行半定量且操作复杂，还有荧光蛋白酶等。但所有上述现有技术都需要基于细胞或细胞 裂解物进行研究。还有通过示踪基因载体和目的基因载体共转染的办法来评估细胞转染效 率，而这种方法很不稳定。
发明内容
本发明目的在于提供一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体。本发明的另一目的在于提供上述示踪载体的构建方法。本发明的发明思路基于下述两方面的考虑。第一，在科学研究中，广泛使用真核表 达载体进行瞬间转染来研究基因的功能，而载体的转染效率直接影响到研究的结果。好多 真实的基因功能因为转染效率低或不一致而被掩盖，因此选择一个能清楚得知转染效率的 示踪物非常重要。分泌型碱性磷酸酶作为示踪物正好能满足这一要求；第二，多数研究的基 因是通过RT-PCR直接从组织细胞获得，而普通Taq酶具有3’末端腺嘌呤转移酶活性，因此 PCR产物往往在其3’末端突出一个Α，结果导致PCR产物不能直接插入平端质粒载体，而需 要插入3’末端有T突出的载体即“Τ载体”。我们把分泌型碱性磷酸酶示踪真核表达载体 构建成一个能把目的基因插入到由CMV启动子调控的TA克隆位点，从而构成一个分泌型碱 性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体。为实现这一目标，我们将含双AhdI酶切位点的寡核 苷酸插入到CMV启动子的下游，从而构建了一个分泌型碱性磷酸酶示踪的T载体。该TA克 隆位点直接位于真核表达启动子(CMV)的下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游，因此 当质粒被转入细胞后，CMV启动子可直接启动插入PCR序列全长的转录而实现目的基因的表达。为了达成本发明上述目的，本发明采用如下具体技术方案本发明提供了一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，所述载体是在 真核表达启动子下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游插入碱性磷酸酶示踪TA克隆位
点ο本发明所述载体的碱基序列如SEQ ID No. 10所示。本发明分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体是利用下述方法构建的，步 骤为1、原核TA克隆载体把TA位点引入pUC19载体构建成pUC19_TA载体；所述步骤具体为1. 1首先合成两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸，退火形成双链DNA ；TA-o ligo-s 5’ P-AATTCACTAGTGGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCGG-3’ ；TA-o Ii go-as 5’ P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3’EcoRI酶切pUC19质粒，与上述DNA双链连接形成前T载体；序列如SEQ IDNo. 1所 示；1.2制备间隔DNA引物aspp2-xhoI-s CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAGaspp2-xhoI-as TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG以本实验室构建的pcDNA4-ASPP2模板扩增，pcDNA4_ASPP2模板序列如SEQ ID No. 11所示，扩增片段中不含常用的限制性酶切位点，扩增序列如SEQ IDNo. 2所示；1. 3XhoI酶切步骤1. 2制备的间隔DNA后，插入到前T载体中；1. 4 设计突变引物 AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT, Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位点 GACTCCCCGTC 突 变为GACTCCCCGTG，形成pUC19_TA前T载体，序列如SEQ ID No. 3所示。1. 5AhdI酶切pUC19-TA前T载体，回收大片段，即为pUC19_TA载体，第89碱基处 为开放性T末端，序列如SEQ ID No. 4所示。2、把pUC19-TA载体的TA序列克隆入pcDNA4 His载体中得到pcDNA5_TA克隆载 体；所述步骤具体为2. 1以PUC19-TA前T载体为模板，扩增片段如SEQ ID No. 5所示，引物为TA-HindIII-S :GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTCTA-XbaI-AS :GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC2. 2HindIII 和 XbaI 双酶切 SEQ ID No. 5，定向连接到 pcDNA4 His vector 上，用 引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT,Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成pcDNA5-TA前T载体，如SEQ ID No. 6所示；2. 3AhdI酶切上述pcDNA5-TA前T载体，回收大片段即为pcDNA5_TA载体，第946 碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No. 7所示。3、把pcDNA5-TA克隆载体上的CMV-TA-poly A序列经PCR得到后克隆到 pSEAP2-C0ntr0l载体中构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶(AP)的TA载体 pcDNA5AP-TA。3. 1以pcDNA5-TA前T载体为模板，扩增片段，如SEQ ID No. 8所示，引物为CMV-NotI GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTTpolyA-Notl :AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT3. 2NotI酶切后，插入到pSEAP2-C0ntr0l载体上，测序验证反向插入的为正确克 降，引物为AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT3. 3 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位点 GACTCCCCGTC 突变为 GACTCCCCGTG， 形成pcDNA5AP-TA前T载体，如SEQ ID No. 9所示；3. 4AhdI酶切回收大片段，即为pcDNA5AP-TA载体，第5245碱基处为开放性T末 端，如SEQ ID No. 10所示。本发明可广泛用于基因功能的研究，使研究易于操作，结果更可靠，同时可潜在用 于药物作用基因筛查的功能。本发明的优点及有益效果(1)本发明提供的是一个分泌型碱性磷酸酶示踪载体，可利用培养基上清进行检 测；(2)可利用化学发光仪器进行检测，不仅灵敏度高而且可以根据标准碱性磷酸酶 的对照进行定量；(3)发明人把目的基因插入位点改造成TA克隆载体位点，因此可以把PCR产物直 接插入到报告基因载体，既节省了时间又节省了科研成本。
图1为将两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸退火形成的双链DNA酶切示意图；图2为pucl9-TA载体结构图；图3为pcDNA5-TA载体结构图；图4为pcDNA5AP-TA载体结构图；图5为EGFP绿色荧光水平与SEAP-表达水平。
具体实施例方式实施例lpcDNA5AP_TA质粒的构建pcDNA5AP-TA载体的构建步骤主要产生一个3，末端突出“T”的线性载体。传统的 方法是在平末端的双链DNA 3，-末端通过DNA末端转移酶加入“T”。为了降低成本和便于 操作，我们利用AhdI切割GACNNN/NNGTC的特点，弓丨入正向重复序列，通过AhdI切割产生3，
6末端突出“T”的线性载体。但是由于在载体的氨苄抗性筛选基因的下游存在一个AhdI切 点，我们首先通过DNA点突变的方法在不改变氨基酸编码的情况下突变掉AhdI切割位点。具体步骤如下1、原核TA克隆载体把TA位点引入pUC19载体构建成pUC19_TA载体；1. 1首先合成两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸，退火形成双链DNA ；TA-oligo-s :5’ -P-AATTCACTAGTGGACATT/ATGTCTCGAGACATA/ATGTCGG-3’TA-o 1 i go-as 5，P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3 ’EcoRI酶切pUC19质粒，与上述DNA双链连接形成前T载体；序列如SEQ IDNo. 1所 示；如图1所示。1.2制备间隔DNA引物aspp2-xhoI-s CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAGaspp2-xhoI-as TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG以本实验室构建的pcDNA4_ASPP2(SEQ ID No. 11所示)为模板扩增，扩增片段中 不含常用的限制性酶切位点(BamHl，EcoRI，HindIII，NotI，XhoI, XbaI, ApaI等)，扩增序 列如SEQ ID No. 2所示；反应条件94°C 15秒，55°C 30秒，72°C 30秒扩增30个循环。1. 3)(h0I酶切步骤1. 2制备的间隔DNA后，插入到前T载体的BioI位点，该位点位 于两个AhdI切点的中间(CTCGAG)；1. 4 设计突变引物 AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT, Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位点 GACTCCCCGTC 突 变为GACTCCCCGTG，形成pUC19_TA前T载体，序列如SEQ ID No. 3所示。1. 5AhdI酶切pUC19-TA前T载体，回收大片段，即为pUC19_TA载体，第89碱基处 为开放性T末端，序列如SEQ ID No. 4所示。如图2所示。2、把pUC19-TA载体的TA序列克隆入pcDNA4 His载体中得到pcDNA5_TA克隆载 体；2. 1以pUC19-TA前T载体(SEQ ID No. 3)为模板，扩增片段如SEQ ID No. 5所示， 引物为TA-HindIII-S :GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTCTA-XbaI-AS :GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC2. 2HindIII 和 XbaI 双酶切 SEQ ID No. 5，定向连接到 pcDNA4 His vector 上，用 引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形 成pcDNA5-TA前T载体，如SEQ ID No. 6所示；2. 3AhdI 酶切上述pcDNA5-TA前T载体(SEQ ID No. 6)，回收大片段即为 pcDNA5_TA 载体，第946碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No. 7所示，结构如图3所示。3、把 pcDNA5-TA 前 T 载体(SEQ ID No. 6)上的 CMV-TA-poly A 序列经PCR(94°C 15 秒，55°C 30秒，72°C 1分30秒扩增30个循环)得到后克隆到pSEAP载体中构建成具有真 核表达功能并外分泌碱性磷酸酶(AP)的TA载体pcDNA5AP-TA，具体步骤
3. 1以pcDNA5-TA前T载体为模板，扩增片段，如SEQ ID No. 8所示，引物为CMV-NotI GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTTpolyA-Notl :AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT3. 2NotI酶切后，插入到pSEAP2_control载体上，测序验证反向插入的为正确克 隆，引物为AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT3. 3 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位点 GACTCCCCGTC 突变为 GACTCCCCGTG， 形成pcDNA5AP-TA前T载体，如SEQ ID No. 9所示；3. 4AhdI酶切回收大片段，即为pcDNA5AP-TA载体，第5245碱基处为开放性T末 端，如SEQ ID No. 10所示，结构如图4所示。实施例2载体应用验证1、所用弓丨物EGFP-s TAGTGGAAGCTTGACCATGGTGAGCAAGGGCGAG,
EGFP-as GCTTGGGATCCAATTCTTACTTGTACAGCTCG2、方法应用rTaq酶，以pCMS-EGFP载体(clontech)为模板扩增EGFP编码片段。 应用实施例1构建的pcDNA5AP-TA载体实现TA克隆连接，测序验证方向。转染细胞 后，荧光倒置显微镜观察绿色荧光，可见光分析仪检测碱性磷酸酶分泌水平，发现两者水平 呈正相关。3、结果如图5所示，图5为EGFP绿色荧光水平与SEAP-表达水平。从结果看出 上清的SEAP化学发光水平与目的基因EGFP (细胞显绿色荧光)呈显著正相关。当DNA转 染浓度为SOOng时，60%的细胞有绿色荧光，同时SEAP的化学发光值较阴性对照升高了近 24 倍(5932288/250395)。
权利要求
1.一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，其特征在于，所述载体是在真核 表达启动子(CMV)下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游插入碱性磷酸酶示踪TA克隆 位点。
2.根据权利要求1所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，其特征在于， 所述载体的碱基序列如SEQ ID No. 10所示。
3.根据权利要求1所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，其特征在于， 所述载体结构如图4所示。
4.一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述方 法包括下述步骤(1)原核TA克隆载体把TA位点引入pUC19载体构建成PUC19-TA载体；(2)把pUC19-TA载体的TA序列克隆入pcDNA4His载体中得到pcDNA5_TA克隆载体；(3)把pcDNA5-TA克隆载体上的CMV_TA-polyA序列经PCR得到后克隆到pSEAP载体中 构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶(AP)的TA载体pcDNA5AP-TA。
5.根据权利要求4所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其 特征在于，所述步骤(1)为1)首先合成两条含AhdI酶切位点的寡核苷酸，退火形成双链DNA；TA-oligo-s 5' P-AATTCACTAGTGGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCGG-3'；TA-oIigo—as 5 ’ P-AATTCCGACATTATGTCTCGAGACATAATGTCCACTAGTG-3’EcoRI酶切pUC19质粒，与上述DNA双链连接形成前T载体；序列如SEQID No. 1所示；2)制备间隔DNA引物aspp2-xhoI-s CCATCTCGAGCCCATCATACCCATCCAAG aspp2-xhoI-as :TTCCTCGAGCGATACGCTCTGAGCCAG以pcDNA-ASPP2质粒为模板扩增，如SEQ ID No. 11所示，扩增片段中不含常用的限制 性酶切位点，扩增序列如SEQ ID No. 2所示；3)BioI酶切步骤2)制备的间隔DNA后，插入到前T载体中；4)设计突变引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT, Ahdl-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT 把 ampicilin 抗性基因中的 AhdI 酶切位点 GACTCCCCGTC 突 变为GACTCCCCGTG，形成pUC19_TA前T载体，序列如SEQ ID No. 3所示。5)AhdI酶切pUC19-TA前T载体，回收大片段，即为pUC19_TA载体，第89碱基处为开放 性T末端，序列如SEQ ID No. 4所示。
6.根据权利要求4所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其 特征在于，所述步骤为1)以pUC19-TA前T载体为模板，扩增片段如SEQID No. 5所示，引 物为:TA-HindIII-S GCCGCGGGAAGCTtATATCACTAGTGAATTCTA-XbaI-AS GGTCGACCTCTAGACGGCCGCGAATTCCGAC2)HindIII和XbaI双酶切SEQID No. 5，定向连接到pcDNA4 His vector上，用引物AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGATAhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成 pcDNA5-TA 前 T 载体，如 SEQ ID No. 6 所示；3) AhdI酶切上述pcDNA5-TA前T载体，回收大片段即为pcDNA5_TA载体，第946碱基处 为开放性T末端，如SEQ ID No. 7所示。
7.根据权利要求4所述的分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体的构建方法，其 特征在于，所述步骤(3)为1)以pcDNA5-TA前T载体为模板，扩增片段，如SEQID No.8所示，引物为 CMV-NotI GCATGAAGCGGCCGCTTAGGGTTAGGCGTTpo IyA-Not I AGCTGGTTGCGGCCGCCTCAGAAGCCAT2)NotI酶切后，插入到pSEAP2-Control载体上，测序验证反向插入的为正确克隆，引物为AhdI-mut-s TGCCTGACTCCCCGTGGTGTAGAT AhdI-mut-as TCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGT3)把ampicilin抗性基因中的AhdI酶切位点GACTCCCCGTC突变为GACTCCCCGTG，形成 pcDNA5AP-TA前T载体，如SEQ ID No. 9所示；4) AhdI酶切回收大片段，即为pcDNA5AP_TA 载体，第5245碱基处为开放性T末端，如SEQ ID No. 10所示。
全文摘要
本发明公开了一种分泌型碱性磷酸酶示踪TA克隆真核表达载体，其是在真核表达启动子(CMV)下游和BGH多聚腺嘌呤转录终止子的上游插入碱性磷酸酶示踪TA克隆位点。本发明所述载体可利用培养基上清进行检测；可利用化学发光仪器进行检测，不仅灵敏度高而且可以根据标准碱性磷酸酶的对照进行定量；发明人把目的基因插入位点改造成TA克隆载体位点，因此可以把PCR产物直接插入到报告基因载体，既节省了时间又节省了科研成本。
文档编号C12N15/79GK102071213SQ201010107709
公开日2011年5月25日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者乔录新, 孙玉, 张洪海, 张玉林, 李宁, 陈德喜, 魏飞力 申请人:首都医科大学附属北京佑安医院