专利名称：蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、 类似物及其制备方法，确切地说就是构建一系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽镇痛活性得到提高 以及分子内半胱氨酸进行改造的突变体蛋白的表达载体。具体地说，本发明涉及蝎镇痛抗 肿瘤缬精甘肽镇痛活性保守性半胱氨酸以及镇痛活性得到提高的突变体蛋白的制备方法 及其作为镇痛药物在治疗领域中的应用。
背景技术：
蝎作为传统中药已有2000多年的药用历史，又称全虫，全蝎，在“诗经”、“本草纲 目”等医学著作中对其药用性即进行了系统描述，是我国的传统名贵中药，具有祛风镇惊， 通络止痛等功能。用于偏、正头痛，神经痛，躯身锐痛等，具有较大的开发价值。近年来人们 已经发现了多种具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗癫痫等药理作用的蝎毒单组分多肽。天然蝎毒 产量极低，因此，采用基因工程方法，用简单的原核或真核生物表达宿主生产具有药用价值 的活性蝎毒多肽的方法显得尤为重要。东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽(BmKAGAP)是刘岩峰等自东亚钳蝎中首次分离纯 化得到并用基因工程的方法获得其编码基因序列，实现了在大肠杆菌中的高效可溶性表 达。在体内小鼠醋酸扭体模型实验中，该多肽体现出较对照药吗啡强的镇痛效果(Liu YF， Ma RL,Wang SL，Duan ZY,Zhang JH，Wu LJ，Wu CF. Expression of an antitumor—analgesic peptide from the venom of Chinese scorpionButhus martensii Karsch in Escherichia coli.Protein Expression and Purification. 2003。疼痛是人类共有而又有较大个体差异性的一种不愉快的主观感觉，它在躯体受到 威胁时提供警报信号，是生命不可缺少的一种保护机制。而在现有研究基础上，使BmKAGAP 镇痛活性得到提高以及对半胱氨酸进行改造的突变体蛋白的重组表达载体的构建及寻找 高效可溶性表达产物的获得方法还有待于进一步研究。
发明内容
本发明的一个目的是构建BmKAGAP突变体表达载体，突变体蛋白的表达与纯化及 初步体内生物活性研究。本发明即致力于BmKAGAP镇痛活性得到提高以及对半胱氨酸进行改造的突变体 蛋白的重组表达载体的构建及高效可溶性表达产物的获得方法，本发明所述的BmKAGAP系 列突变体或相应的类似物的获得方法常规、简单、产量高，对研究开发蝎镇痛肽类药物具有 重要的指导意义和实用价值，为工业化生产奠定了基础。经过初步体内活性实验验证后为 该系列蛋白广泛应用于临床疼痛相关疾病的治疗提供基础，将会大大提高患者的生存质 量，因此其应用前景将是非常广阔的。本发明的另一个目的是提供生产如上限定的突变体蛋白质的方法，该方法包括(1)提供 BmKAGAP 的 D8K，D8R，C 端-(K 或 R)，C 端-(K 或 R) - (K 或 R)，C 端-(K 或R) - (K或R) - (K或R)，C末端减少一个或二个Gly，D8 (K或R)和C末端增加一个或二个或 三个碱性氨基酸，D8 (K或R)和C末端减少一个或二个Gly及其四对二硫键的突变体所编 码DNA的重组表达载体；(2)用步骤(1)的重组载体转化适当的宿主细胞；(3)在适合于表达 BmKAGAP 的 D8K，D8R，C 端-(K 或 R)，C 端-(K 或 R) - (K 或 R)，C 端-(K或R) - (K或R) - (K或R)，C末端减少一个或二个Gly，D8 (K或R)和C末端增加一个 或二个或三个碱性氨基酸，D8(K或R)和C末端减少一个或二个Gly及其四对二硫键的突 变体的条件下培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的蛋白质。
本发明的再一个目的是提供含有如上限定的蛋白质及一种或多种医药上可接受 的载体或赋形剂的药物组合物。本发明的再一个目的是提供如上限定的蛋白质在生产镇痛药物中的应用。本发明提供了一种上述载体转化的宿主细胞。本发明提供的突变体蛋白均是从大肠杆菌宿主细胞中分离纯化得到的。可使用 盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细胞的溶胞产物及培养 液中分离并纯化所需的蛋白质表达产物。在产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法 (WESTERN)检测产物的存在及相应分子大小。本发明还提供了上述突变体蛋白在生物制药领域的应用，具体地说包括镇痛生物 活性。本发明首次构建相应突变体蛋白质的原核细胞表达载体，转化大肠杆菌宿主细胞 后实现蛋白的高效可溶性表达。本发明首次进行该系列突变体蛋白的小鼠体内镇痛生物学活性实验。本发明进一步涉及含有上述蛋白和至少一种医药上可接受的惰性载体或赋形剂 的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药 的药物组合物(如参见 Remington’ s Pharmaceutical Science, 15th. ，Mack Publishing Company，1980)。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、 皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。可使用本发明的蛋白或含有该蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类 型人体的各种疼痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性 质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原 则来确定。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞等。应用本发明所得到的蝎毒镇痛活性肽表达量高，易于纯化获得目标蛋白，部分突 变体体内镇痛活性得到较好的改善。
以蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8K突变体(简写为D8K)为例进行说明图1 显示用于表达D8K的原核细胞重组表达质粒pSYPU/BmKAGAP (D8K)的示意 图。图2 显示菌落PCR方法鉴定含重组质粒的细菌菌落。1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，鉴定含重组质粒的细菌菌落。其中泳道 1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为含有插入目的片段的重组质粒的细菌菌落，泳道 M为核酸分子量标志物DL2000。图3 显示D8K突变体的金属离子螯合层析色谱图。图中箭头所指位置为目标蛋 白所在洗脱峰。图4 显示D8K突变体的15% SDS-PAGE图谱。其中泳道1为纯化后D8K蛋白条 带，泳道M为低分子量蛋白质标志物。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限 制本发明特批权利要求的范围。表1.用于构建BmKAGAP部分突变体引物a a斜体GGATCC代表3 ‘末端BamHI限制性酶切位点。表2.用于构建改造BmKAGAP 二硫键部分突变体引物a a斜体GGATCC代表3 ‘末端BamHI限制性酶切位点。实施例1 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8K突变体及其衍生物、类似物的获得1.质粒 pSYPU/BmKAGAP_D8K 的构建本实施例列举描述用于表达本发明D8K蛋白的重组质粒pSYPU/BmKAGAP-D8K的构 建策略和基本方法。根据BmKAGAP氨基酸序列中Asp8设计相应寡核苷酸引物P1和引物P2，以构建好 的pSYPU/BmKAGAP质粒为模板，分别以P1和P7，P2和P6为引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶 电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收，再以所得回收产物为模板，以P6和P7为引物进 行第三轮PCR扩增，回收相应产物。经过限制性核酸内切酶Ncol和BamHI双酶切后与同样 进行双酶切的质粒pSYPU在T4 DNA ligase的作用下进行连接，热转化大肠杆菌感受态细 胞DH5 a，经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技 术服务公司进行DNA序列测定。结果表明，通过基因工程的方法成功构建重组质粒pSYPU/ BmKAGAP-D8K。2.突变体蛋白的分离纯化经测序确认后按常规方法发酵表达并分离大肠杆菌宿主细胞的表达产物。首先将 阳性重组质粒热转化大肠杆菌BL21 ( X DE3)，然后从该LB固体平板上挑取单菌落后接种至 3ml LB (含卡那抗生素，50 u g/ml)，于37°C，200r/min振荡过夜培养。按照1 %接种量将过 夜培养物接种至400ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37°C，200r/min振荡 培养至0D600为0. 6-0. 8，加入终浓度为0. 166mmol/L的诱导物异丙基0 D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，培养4h。结束发酵，3000g、4°C离心20min,收集菌体。用40ml裂解缓冲液(0. 1M PBS，0. 15M NaCl，50mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12，000g、4°C离心 20min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，直接上样于0. 1M PBS(pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的pH缓冲液分别充分 洗涤5个柱床体积后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)进行洗脱并收获该洗脱液。所得产物经过15% SDS-PAGE验证其纯度。由柱层析色谱图和SDS-PAGE图谱说明，重组蛋白质获得高效 表达，达到电泳纯度。蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8K突变体及其及其衍生物、类似物的模式包括 BmKAGAP-D8K, M-BmKAGAP_D8K，MHHHHHHM-BmKAGAP-D8K, MHHHHHH-BmKAGAP_D8K。实施例2 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8R突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8R突变体及其衍生物、类似物的策略和基 本方法，类同实施例1的策略和基本方法。蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8R突变体及其衍生物、类似物的模式包括 BmKAGAP-D8R, M-BmKAGAP_D8R，MHHHHHHM-BmKAGAP-D8R, MHHHHHH-BmKAGAP_D8R。实施例3 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-K-K突变体BmKAGAP-K-K及其衍生物、 类似物的获得本实施例列举描述用于表达本发明rBmKAGAP-K-K蛋白的重组质粒pSYPU/ BmKAGAP-K-K的构建策略和基本方法。其中根据AGAP成熟肽C末端的氨基酸序列设计相应 寡核苷酸引物P3，以构建好的pSYPU/BmKAGAP质粒为模板进行PCR扩增，相应的引物为P3 和P6。基本过程同实施例1。蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-K-K突变体BmKAGAP-K-K及其衍生物、类似物的模 式包括BmKAGAP-K-K，M-BrnKAGAP-K-K。实施例4 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端_(K或R)突变体及其衍生物、类似物的获 得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(K或R)突变体及其衍生物、类似物的 策略和基本方法，类同实施例3的策略和基本方法。此模式包括BmKAGAP-K，M-BmKAGAP-K， BmKAGAP-R, M-BmKAGAP-R。实施例5 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端_(K或R)_(K或R)突变体及其衍生物、类 似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(K或R) - (K或R)突变体及其衍生物、 类似物的策略和基本方法，类同实施例3的策略和基本方法。此模式的突变体及其衍生 物、类似物包括BmKAGAP-K-K，BmKAGAP-K-R, BmKAGAP-R-K, BmKAGAP-R-R, M-BmKAGAP-K-K， M-BmKAGAP-K-R, M-BmKAGAP-R-K 和 M-BmKAGAP-R-R。实施例6 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)突变体及其衍 生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)突变体及 其衍生物、类似物的策略和基本方法，类同实施例3的策略和基本方法。此模式的突变体及 其衍生物、类似物包括BmKAGAP-K-K-K，BmKAGAP-K-K-R，BmKAGAP-K-R-K, BmKAGAP-K-R-R, BmKAGAP-R-K-K, BmKAGAP-R-K-R, BmKAGAP-R-R-R, BmKAGAP-R-R-K, M-BmKAGAP-K-K-K， M-BmKAGAP-K-K-R, M-BmKAGAP-K-R-K, M-BmKAGAP-K-R-R, M-BmKAGAP-R-K-K, M-BmKAGAP-R-K-R, M-BmKAGAP-R-R-R 和 M-BmKAGAP-R-R-K。实施例7 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端(-G)突变体BmKAGAP- (_G)及其衍生物、 类似物的获得本实施例列举描述用于表达本发明rBmKAGAP (_G)蛋白的重组质粒pSYPU/BmKAGAP (-G)的构建策略和基本方法。其中根据AGAP成熟肽C末端的氨基酸序列设计寡核 苷酸引物P4，以构建好的pSYPU/BmKAGAP质粒为模板，相应的引物为P4和P6。基本过程同 实施例1。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括=BmKAGAP- (-G)和M-BmKAGAP- (-G)。实施例8 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端(-2G)突变体BmKAGAP- (-2G)及其衍生 物、类似物的获得本实施例列举描述 用于表达本发明rBmKAGAP (-2G)蛋白的重组质粒pSYPU/ BmKAGAP (-2G)的构建策略和基本方法。其中根据AGAP成熟肽C末端的氨基酸序列设计寡 核苷酸引物P5，相应的引物为P5和P6。基本过程同实施例1。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括=BmKAGAP- (-2G)和M-BmKAGAP- (-2G)。实施例9 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R)-C末端加一个碱性氨基酸残基(K或 R)突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) -C末端加一个碱性氨基酸残基 (K或R)突变体及其衍生物、类似物是结合实施例1、2以及实施例4的策略和基本方法。也 就是在蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R)突变体的基础上，在其C末端加一个碱性氨基酸 残基(K或R)。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括BmKAGAP(D8R)-K，M-BmKAGAP(D8R)-K， BmKAGAP(D8R)-R， M-BmKAGAP(D8R)-R, BmKAGAP(D8K)-R, M-BmKAGAP(D8K)-R, BmKAGAP(D8K)-K, M-BmKAGAP(D8K)-K。实施例10 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) -C末端加二个碱性氨基酸残基(K 或R) - (K或R)突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) -C末端加二个碱性氨基酸残基 (K或R)-(K或R)突变体及其衍生物、类似物是结合实施例9和4的策略和基本方法。也就 是在蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) -C末端加一个碱性氨基酸残基(K或R)突变体的 基础上，在其C末端再加一个碱性氨基酸残基(K或R)。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括=BmKAGAP (D8R) -K- (K或R)， M-BmKAGAP (D8R)-K-(K 或 R)，BmKAGAP (D8R)-R-(K 或 R)，M-BmKAGAP(D8R)-R-(K 或 R)， BmKAGAP(D8K)-R-(K 或 R)，M-BmKAGAP(D8K)-R-(K 或 R)，BmKAGAP(D8K)-K-(K 或 R)， M-BmKAGAP(D8K)-K-(K 或 R)。实施例11 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R)-C末端加三个碱性氨基酸残基(K 或R) - (K或R) - (K或R)突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) -C末端加三个碱性氨基酸残基 (K或R)-(K或R)突变体及其衍生物、类似物是结合实施例10和4的策略和基本方法。也 就是在蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) -C末端加二个碱性氨基酸残基(K或R) - (K或R) 突变体的基础上，在其C末端再加一个碱性氨基酸残基(K或R)。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括=BmKAGAP (D8R) -K- (K或R) - (K 或 R)，M-BmKAGAP (D8R)-K-(K 或 R) - (K 或 R)，BmKAGAP (D8R)-R-(K 或 R) - (K 或 R) , M-BmKAGAP (D8R)-R-(K 或 R) - (K 或 R)，BmKAGAP (D8K) -R- (K 或 R) - (K 或 R)， M-BmKAGAP(D8K)-R-(K 或 R)- (K 或 R)，BmKAGAP(D8K)-K-(K 或 R)- (K 或 R)，M-BmKAGAP (D8K) -K_ (K 或 R) - (K 或 R)。实施例12 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) _C端(_G)突变体及其衍生物、类 似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽_D8(K或R)_C端(-G)突变体及其衍生物、 类似物是结合实施例1、2和7的策略和基本方法。也就是在蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K 或R)突变体及其衍生物、类似物的基础上，在其C末端去掉一个G残基。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括BmKAGAP(D8R)-(-G)， M-BmKAGAP(D8R)-(-G)，BmKAGAP(D8K)-(-G)，M-BmKAGAP(D8K)-(_G)。实施例13 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) _C端(-2G)突变体及其衍生物、类 似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K或R) _C端(-2G)突变体及其衍生物、 类似物是结合实施例1、2和8的策略和基本方法。也就是在蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-D8 (K 或R)-C端(-G)突变体及其衍生物、类似物的基础上，在其C末端再去掉一个G残基。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括BmKAGAP(D8R)-(-2G)， M-BmKAGAP(D8R)-(-2G)，BmKAGAP(D8K)-(-2G)，M-BmKAGAP(D8K)-(-2G)。实施例14 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加一个碱性氨基酸残 基突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加一个碱性氨基酸 残基突变体及其衍生物、类似物是结合实施例8和9的策略和基本方法。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括BmKAGAP-(-2G)_R， M-BmKAGAP-(-2G) -R, BmKAGAP-(-2G) -K, M-BmKAGAP-(-2G)_K。实施例15 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加二个碱性氨基酸残 基突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加二个碱性氨基酸 残基突变体及其衍生物、类似物是结合实施例8、9和14的策略和基本方法。 此模式的突变体及其衍生物、类似物包括BmKAGAP- (_2G) -R- (R或K)， M-BmKAGAP- (-2G) -R- (R 或 K)，BmKAGAP- (-2G) -K_ (R 或 K)，M-BmKAGAP- (-2G) -K_ (R 或 K)。实施例16 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加三个碱性氨基酸残 基突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加二个碱性氨基酸 残基突变体及其衍生物、类似物是结合实施例8、9、14和15的策略和基本方法。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括BmKAGAP- (_2G) -R- (R或K) - (R 或 K)，M-BmKAGAP-(_2G)-R-(R 或 K)-(R 或 K)，BmKAGAP-(_2G)_K_(R 或 K)-(R 或 K)， M-BmKAGAP-(-2G)-K_(R 或 K)-(R 或 K)。实施例17 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8 (K或R)和C末端增加一个或二个或三个碱 性氨基酸残基突变体及其衍生物、类似物的获得本实施例获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加二个碱性氨基酸 残基突变体及其衍生物、类似物是结合实施例13、14、15和16的策略和基本方法。此模式的突变体及其衍生物、类似物包括BmKAGAP-D8 (K或R)-(_2G)-(R或K)，
12M-BmKAGAP-D8 (K 或 R) - (_2G) - (R 或 K)，BmKAGAP_D8 (K 或 R) - (_2G) - (R 或 K) - (R 或 K)， M-BmKAGAP-D8 (K 或 R) - (-2G) - (R 或 K) - (R 或 K)，BmKAGAP_D8 (K 或 R) - (-2G) - (R 或 K) - (R 或 K) - (R 或 K)，M-BmKAGAP-D8 (K 或 R) - (_2G) - (R 或 K) - (R 或 K) - (R 或 K)。实施例18 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽_ (C12S)突变体BmKAGAP- (C12S)的获得本实施例列举描述用于表达本发明BmKAGAP_(C12S)突变体蛋白的重组质粒 pSYPU/BmKAGAP-(C12S)的构建策略和基本方法。根据BmKAGAP氨基酸序列中Cys12设计相应寡核苷酸引物P8和引物P9，以构建好 的pSYPU/BmKAGAP质粒为模板，分别以P7和P8，P6和P9为引物进行PCR扩增。基本过程 同实施例1。实施例 19 :BmKAGAP- (C16S) .BmKAGAP- (C22S) .BmKAGAP- (C26S) .BmKAGAP- (C36S)、 BmKAGAP- (C46S)和 BmKAGAP-(C48S)突变体的获得本实施例列举描述用于表达本发明BmKAGAP- (C16S)、BmKAGAP- (C22S)、 BmKAGAP- (C26S)、BmKAGAP-(C36S)、BmKAGAP-(C46S)和 BmKAGAP-(C48S)突变体蛋白的重组 质粒的构建策略和基本方法。根据BmKAGAP 氨基酸序列中 Cys16，Cys22, Cys26, Cys36, Cys46, Cys48 设计相应寡核苷 酸引物 P10, Pll, P12, P13, P14, P15, P16, P17, P18, P19, P20, P21。基本过程同实施例 18。实施例20 :BmKAGAP-(C63S)突变体的获得本实施例列举描述用于表达本发明BmKAGAP- (C63S)突变体蛋白的重组质粒 pSYPU/BmKAGAP (C63S)的构建策略和基本方法。根据BmKAGAP氨基酸序列中Cys63设计相应寡核苷酸引物P22，以构建好的pSYPU/ BmKAGAP质粒为模板，以P6和P22为引物进行PCR扩增。基本过程同实施例18。实施例21 :BmKAGAP-(C12S，C63S)、BmKAGAP-(C16S，C36S)、BmKAGAP-(C22S， C46S)、BmKAGAP-(C26S，C48S)突变体的获得本实施例列举描述用于表达本发明BmKAGAP-(C12S, C63S)、BmKAGAP-(C16S, C36S)、BmKAGAP-(C22S，C46S)、BmKAGAP-(C26S，C48S)突变体蛋白的重组质粒的构建策略和
基本方法。分别以构建好的pSYPU/BmKAGAP-(C12S)、pSYPU/BmKAGAP-(C16S)、pSYPU/ BmKAGAP-(C22S)、pSYPU/BmKAGAP-(C26S)质粒为模板，以相应的另一部分欲引入突变点系 列弓I物进行PCR扩增。基本过程同实施例1。实施例22 突变体蛋白体内镇痛活性一小鼠醋酸扭体法本实施例通过小鼠体内镇痛模型旨在验证特定位点氨基酸改造后蝎镇痛抗肿瘤 缬精甘肽突变体的镇痛活性。蛋白浓度采用Lowry方法进行测定。小鼠醋酸扭体法镇痛模型将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继 而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应(腹部内凹、躯干与 后腿伸张、臀部高起)。18-22g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组8只，腹腔注射突变体蛋白样品， 20min后按0. 2ml/20g腹腔注射0.6% (v/v)醋酸引起内脏痛，5min后记录小鼠lOmin内的 扭体次数。以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体 反应抑制率。
触I奁空白组扭体次数-给药组扭体次数inno/ 抑制率--^ ,-x 100%
空白组扭体次数镇痛生物活性实验结果表明生理盐水空白组实验动物扭体次数(Mean士SEM) 为43. 70士2.99 ；阳性对照组(吗啡，3. 51iimol/kg)实验动物扭体次数(Mean士SEM)为 29. 37士 1.85，扭体抑制率为32. 79% ；蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽组(0. 14umol/kg)的实验 动物扭体抑制率为54. 81 % ；蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8K、D8R、C端-(K或R)、C端-(K或 R) - (K或R)、C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)、C末端减少一个或二个G的突变体及其衍生 物、类似物(0. 14umol/kg)实验动物扭体抑制率在67. 0% -81. 7% ；蝎镇痛抗肿瘤缬精甘 肽D8 (K或R)和C末端增加一个或二个或三个碱性氨基酸、D8 (K或R)和C末端减少一个 或二个G、C末端去除二个G加一个或二个或三个碱性氨基酸、D8 (K或R)和C末端去除二 个G加一个或二个或三个碱性氨基酸的突变体及其衍生物、类似物(0. 14umol/kg)实验动 物扭体抑制率92. 3% -100%;蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽第12位、第16位、第22位、第26位、 第36位、第46位、第48位和第63位Cys的突变体实验动物扭体抑制率见表3。表3.蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽半胱氨酸突变后小鼠醋酸扭体镇痛实验结果
权利要求
蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征在于蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽第8位D和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端至少一个被改变。
2.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽第8位D改变指第8位D被K或R取代，获得蝎镇痛抗 肿瘤缬精甘肽D8K突变体及其衍生物、类似物或蝎镇痛抗肿瘤缬精甘D8R突变体及其衍生 物、类似物VRDGYIAKDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG VRDGYIARDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG MVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG MHHHHHHMVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRV PGKCNGGMHHHHHHVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVP GKCNGG。
3.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端改变包括蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端增加碱 性氨基酸残基或减少G或减少两个G后加碱性氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于所述增加的碱性氨基酸残基为一个或二个或三个，所述减少的G为一个或二个，所述 减少两个G后加的碱性氨基酸残为一个或二个或三个。
5.根据权利要求3所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于所述蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端增加碱性氨基酸残基，获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘 肽C端-(K或R)突变体及其衍生物、类似物或蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(K或R) - (K或 R)突变体及其衍生物、类似物或蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(K或R) - (K或R) - (K或R)突 变体及其衍生物、类似物VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R)VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNA CffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) MHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQW AGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R)MHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG (K 或 R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNG G(K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNG G(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
6.根据权利要求3所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于所述蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端减少G，获得蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(-G) 突变体及其衍生物、类似物或蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C端-(-2G)突变体及其衍生物、类似 物VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNMHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGMHHHHHHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNMHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGMHHHHHHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNo
7.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽C末端的两个G被去除后加一个或二个或三个碱性氨基酸残 基突变体及其衍生物、类似物VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K或R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R)VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或R) (K或R)MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
8.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8 (K或R)和C末端增加一个或二个或三个碱性氨基酸残基 突变体及其衍生物、类似物VRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG( K或R)MVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPI RVPGKCNGG(K 或 R)VRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG ( K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R)VRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG ( K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIA (K 或 R) DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG (K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
9.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8 (K或R)和C末端减少一个或二个G突变体及其衍生物、类 似物VRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNG MVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNMVRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN
10.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽D8 (K或R)和C末端的两个G被去除后加一个或二个或三个 碱性氨基酸残基突变体及其衍生物、类似物VRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K或R)MVRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或R)VRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或R) (K或R)MVRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或R) (K或R)VRDGYIA(K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)MVRDGYIA (K 或 R)DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQffAGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCN(K 或 R) (K 或 R) (K 或 R)。
11.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽及其衍生物、类似物中其特征在于 所述蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的第12位、第16位、第22位、第26位、第36位、第46位、第48 位和第63位Cys形成二硫键，或蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽衍生物、类似物的8个Cys形成二 硫键。
12.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物，其特征 在于所述蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物的8个Cys形成二硫键。
13.根据权利要求1-12中任何一项所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、 类似物，其特征在于可利用基因工程技术和化学合成技术制备获得。
14.一种药物组合物，其特征在于含有如权利要求1-12中的任何一项限定的蛋白质 及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。
15.权利要求1-12中的任何一项所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类 似物及其所限定的突变体蛋白质在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其衍生物、类似物及其制备方法，具体涉及通过基因工程的方法对蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽进行定向改造。本发明利用DNA重组技术构建了一系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体蛋白的载体，实现高效可溶性表达并经纯化收获突变体蛋白后验证其体内生物活性，实验结果表明突变体蛋白的体内镇痛活性得到提高。
文档编号C12N15/12GK101875691SQ20101010745
公开日2010年11月3日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者刘岩峰, 吴春福, 崔勇, 张景海, 郭桂丽, 马瑞 申请人:沈阳药科大学