带myc标签的lamp1真核表达载体及其在溶酶体分离中的应用
【专利说明】带MYC标签的LAMP1真核表达载体及其在溶酶体分离中的 应用 【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种带Myc标签的LAMP1 (溶酶体膜蛋 白1)真核表达载体及其在溶酶体分离中的应用。 【【背景技术】】
[0002] 溶酶体（lysosome)是真核细胞中由单层脂蛋白膜包绕的含一系列酸性水解酶的 小体，是细胞内吞和细胞自瞻两条代谢途径的共同终点。溶酶体既能通过与吞瞻体融合，酸 化水解通过内吞途径进入细胞的生物大分子物质，调节细胞水平的信号传递，又能通过与 自瞻体融合，降解通过自瞻途径包裹到自瞻体中的细胞器和内源性生物大分子，为细胞提 供生物合成的新原料。通过分子生化手段分离溶酶体对于研究细胞内吞和细胞自瞻两条代 谢途径意义重大。传统应用于分离溶酶体的方法主要是密度梯度离也。密度梯度离也法是 指用一定的介质在离也管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混息液或匀浆液置于 介质的顶部，通过重力或离也力场的作用使细胞裂解液分层、分离。该方法通过利用细胞中 不同细胞器的沉降系数不同，在一定离也力作用下，细胞器会分布到密度梯度的不同区域 中，最后再通过免疫印迹法鉴定出溶酶体所分布的区域，并将该一区域都作为溶酶体分离 出来。
[0003] 密度梯度离也法分离溶酶体耗时长，分离效率低，而且无法得到纯度较高的溶酶 体。LAMP1是溶酶体表面特异性定位的膜蛋白，被广泛的用作溶酶体的标识物。LAMP1蛋白 分子的大部分区域定位于溶酶体的内腔中，仅有C端一小部分跨过溶酶体膜，暴露在溶酶 体表面与胞浆接触。依据LAMP1的特性，我们W LAMP1蛋白作为溶酶体的标识物，用免疫沉 淀的方法分离溶酶体，会简化了纯化步骤，提高了分离得到的溶酶体的纯度。而现有的祀向 细胞内源性LAMP1的抗体特异性和效价都不高，不离于高效的分离溶酶体。用传统的密度 浓度梯度法分离溶酶体具有耗时长，样品需求量大，而且无法得到纯度较高的溶酶体。 【
【发明内容】
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[0004] 本发明的首要目的在于提供一种带Myc标签的LAMP1真核表达载体。
[0005] 本发明的另一目的在于提供所述带Myc标签的LAMP1真核表达载体的构建方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述的带Myc标签的LAMP1真核表达载体的应用。
[0007] 本发明的目的通过W下技术方案实现；一种带Myc标签的LAMP1真核表达载体，其 中所含的带Myc标签的LAMP1的核巧酸序列为（如SEQ ID NO. 1所示）；ATGGCGGCCCCCGGCA GCGCCCGGCGACCCCTGCTGCTGCTACTGCTGTTGCTGCTGCTCGGCCTCATGCATTGTGCGTCAGCAGCAATGTTT ATGGTGAAAAATGGCAACGGGACCGCGTGCATAATGGCCAACTTCTCTGCTGCCTTCTCAGTGAACTACGACACCAA GAGTGGCCCTAAGAACATGACCTTTGACCTGCCATCAGATGCCACAGTGGTGCTCAACCGCAGCTCCTGTGGAAAAG AGAACACTTCTGACCCCAGTCTCGTGATTGCTTTTGGAAGAGGACATACACTCACTCTCAATTTCACGAGAAATGCA ACACGTTACAGCGTCCAGCTCATGAGTTTTGTTTATAACTTGTCAGACACACACCTTTTCCCCAATGCGAGCTCCAA
【主权项】
1. 一种带Myc标签的LAMP 1真核表达载体，其特征在于其中所含的带Myc标签的LAMP I 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的带Myc标签的LAMPl真核表达载体，其特征在于：所述带Myc 标签的LAMPl真核表达载体所用真核表达载体为pcDNA3. 1 ( + )载体。
3. 权利要求1或2所述的带Myc标签的LAMPl真核表达载体的构建方法，其特征在于 包括如下步骤： 以Hela细胞的cDNA为模板，用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3序列所示的特异性引 物扩增得到含BamH I酶切位点及Xho I酶切位点的LAMPl-Myc片段；分别对PCR扩增的 LAMPl-Myc基因与pcDNA3. 1 ( + )载体使用限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Xho I进 行双酶切，纯化酶切产物；将载体和LAMPl-Myc基因片段按照质量比为2. 5:1-5:1的比例在 DNA连接酶的作用下进行连接并转化，挑取单克隆扩大培养并提取重组质粒，通过检测，获 得重组表达载体 pcDNA3. I ( + )-LAMPl-Myc。
4. 权利要求1或2所述的带Myc标签的LAMPl真核表达载体应用于研究溶酶体代谢机 制的分子细胞生物学技术领域。
5. 权利要求1或2所述的带Myc标签的LAMPl真核表达载体在溶酶体分离中的应用。
【专利摘要】本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种带Myc标签的LAMP1真核表达载体及其应用。本发明所述带Myc标签的LAMP1真核表达载体中带Myc标签的LAMP1的核苷酸序列如SEQNO.1所示，通过将LAMP1基因与Myc标签蛋白基因构成融合基因，利用载体上的启动子和信号序列来控制融合基因的表达，然后采用免疫沉淀的方式分离溶酶体，操作简便，富集效率高，结果易于检测，成本低，可应用于高效的分离溶酶体。
【IPC分类】C12N15-66, C12N5-07, C12N15-85
【公开号】CN104630266
【申请号】CN201310561630
【发明人】张磊, 李红昌, 杨诗涵
【申请人】中国科学院深圳先进技术研究院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月12日