一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物转基因技术领域。具体设及一种提高团花遗传转化瞬时表达效率 的方法。
【背景技术】
[0002] 团花（Neolamarckia cadamba)，又称黄梁木，为我国南方乡±阔叶树种，由于生长 迅速，树干通直，因而被誉为"奇迹树"，早在20世纪70年代就受国内外普遍关注。其材性 与杉木相当，速生性与按树、杨树相近，是较好的用材和纸浆原料树种；树皮含有丰富的生 物碱类，其中3 a -二氨卡丹宾和3 0 -二氨卡丹宾为治疗高血压药物"钩藤总碱"的有效 成分，具有强而持久的降压作用，其效价已经接近利血平巧ndo K,化hima Y, Kikuchi H, et al. Hypotensive principles of Uncaria hooks. Planta medica. 1983, 49(3):188-190)， 该2个生物碱类在钩藤中仅为微量成分存在，而在团花树皮中作为仅次于卡丹宾含量的主 要成分存在，是较好药源树种；此外，团花也是优良的园林绿化树种、蜜源树种、饲料树种。 由于团花用途广、潜在经济价值大，有着广阔的开发前景。虽然团花有较好的速生、丰产特 性，但抗寒性弱，在我国可进行人工栽培的区域受到制约；利用传统的常规育种进行抗性选 育，存在周期长、变异不确定等问题；而利用植物基因工程方法对团花进行遗传改良，具有 育种目标明确、费用低、操作简单、重复性好、育种周期较常规育种短的优点。
[0003] 农杆菌介导的遗传转化技术已广泛用于获取新品种或进行种质改良的研究，但获 得转基团植株与再生体系、农杆菌株类型和浸染浓度、共培养方法和时间等诸多因素有关， 该些因素组成一个完整的遗传转化系统，任何一个因素的效率偏低，均会导致遗传转化效 率的下降甚至无法获得转基因植株。
[0004] 目前，采用团花大田枝芽（邓小梅，詹艳玲，张倩，等.黄梁木组培快繁技术研 究.华南农业大学学报.2012, 33 (2): 216-219;林碧珍，张树河，林加耕.团花树组培快繁 技术研究.中国热带农业.2009 (3): 46-47.)、种子无菌苗子叶或下胚轴（黄浩.黄梁木地 理变异和再生系统的建立.华南农业大学学位论文，2014.)作为外植体，通过组织培养获 得再生植株已获成功，由于邓小梅等、林碧珍等人采用大田枝芽作为外植体的方法，是通过 直接器官再生方式获再生植株，该方法并不适合团花进行遗传转化；而黄浩采用种子无菌 苗子叶或下胚轴为外植体，是经过愈伤组织的间接器官再生方式获得再生植株的方法，正 是普遍用于植物遗传转化的再生方法。在前期，我们已利用常规的农杆菌介导遗传转化方 法对团花进行了试验，但瞬时表达效率较低，转化效率很极低。因此，需进一步对团花遗传 转化方法进行了优化，目的是建立一种团花高效遗传转化的技术，为团花遗传改良特别是 抗寒、抗虫的改良提供技术基础。
[0005] 经文献检索，尚无团花遗传转化的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明针对团花在农杆菌介导的遗传转化中瞬时表达率低，转化效率低的问题， 提供一种提高遗传转化瞬时表达率的方法。通过农杆菌介导法将外源基因导入团花受体细 胞，提高外源基因的转化效率，建立由农杆菌介导的团花遗传转化体系。
[0007] 本发明所述的提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，包括如下步骤：
[000引 1.材料选择
[0009] 选择20~25d的无菌团花幼苗，切取胚轴和带柄子叶为外植体；
[0010] 选择带GUS基因的植物表达载体地I 121，通过化CI2法导入农杆菌C58或 LBA4404,获得菌液C或菌液L菌液C为带植物表达载体地I 121的农杆菌C58菌液，菌液 L为带植物表达载体地I 121的农杆菌LBA4404菌液；
[0011] 植物表达载体地I 121、农杆菌C58和LBA4404均由生物公司购买获得。
[001引 2.菌液制备
[0013] 吸取50 y L的菌液C或菌液L，转移到质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素、50mg/ L利福平和25mg/L链霉素的100血YEB液体培养基中，于22°C、13化/min振荡培养至菌液 ODecici值为0. 8,然后于5000r/min离屯、lOmin收集菌体，再用200血DCR液体培养基重悬， 于28°C、130r/min振荡培养，至菌液ODe。。值为0. 8~1. 0,此时带菌液C或菌液L的DCR液 体即为遗传转化浸染液。
[0014] 所述Y邸培养基成分为；5. Og/L牛肉浸膏，1. Og/L酵母粉，5. Og/L蛋白腺，5. Og/L 庶糖，0. 04g/L M拆O4 ? 7&0,抑值为 7. 0 ;
[0015] 所述DCR培养基成分为；P. K. Gupta和D. J. Durzan于1985年公开发表的 DCR 配方(P.K. Gupta, D. J. Durzan. Shoot multiplication from mature trees of Douglas-fir(Pseudotsuga menziesii)and sugar pine (Pinus lambertiana). Plant Cell Imports, 1985, 4:177-179)。
[0016] 3.外植体浸染
[0017] 将切取的外植体浸入到装有步骤2遗传转化浸染液的=角瓶中，轻轻摇动让外植 体完全浸泡在浸染液中，密封好S角瓶口，在0. 05Mpa的真空干燥器内放置5min ;
[001引 4.外植体共培养
[0019] 将步骤3中浸染后的外植体从遗传转化浸染液中取出，吸干外植体表面的农杆 菌，然后转移到含液体分化诱导培养基的湿润滤纸上共培养；在22°C的黑暗条件下共培养 6d ；
[0020] 所述液体分化诱导培养基为DCR+2.0mg/L TDZ+0.05mg/L NAA+20g/L庶糖，抑 5. 2 ~5. 4 ;
[0021] 5.阳性筛选
[0022] 将共培养后的外植体，转移到质量体积浓度比为12mg/L卡那霉素和lOOmg/L头抱 霉素的固体分化诱导培养基中培养，在25±2°C、光周期为lOh/d的条件下培养7d ;
[0023] 所述固体分化诱导培养基为DCR+2. Omg/L TDZ+0. 05mg/L NAA+20g/L庶糖巧.5g/ L琼脂，p册.8~6. 2。
[0024] 6.瞬时表达检测
[0025] 用灭菌的超纯水，将共培养7d后的外植体表面清净干净，浸没于GUS染色液中，于 37°C的恒温箱中温育12h，然后转入体积浓度比为70%的己醇溶液中脱色2~3次，每次 lOmin，最后保存于体积浓度比为70%的己醇溶液中；
[0026] 所述GUS染色液成分为：每1000血溶液含15. 601g化畔04,3. 7224g 化2抓TA，211.2mg K4[Fe(CN)e].3H2〇，164.7mg K3[Fe(CN)e]，lmL lYiton.X-lOO'O.Sg X-Gluc ;染色液的抑7. 0 ;X-Gluc在使用前需用二甲基亚讽值MSO)溶解。
[0027] 在适宜的反应条件下，0 -葡聚糖巧酶佑U巧可将X-Gluc水解成藍色物质，因此， 具有GUS活性的部位或位点呈现藍色或藍色斑点；由于团花组织和细胞不含有0-葡聚糖 巧酶，没经浸染的团花是无法呈现藍色或藍色斑点的，而经过浸染的团花外植体，若经GUS 染色液染色后呈藍色，表明GUS基因已转入到团花的细胞中。
[002引浸染步骤中，先在0. 05Mpa的真空干燥器内放置5min，然后采用湿润滤纸共培养 6d的浸染方法，其瞬时表