一种用于莱茵衣藻多基因共表达的载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种能在莱茵衣藻中同时表达多个基因的表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]莱茵衣藻{Chlamydomonas reinhardii )是一种单细胞真核藻，个体直径为5_17微米，有两根鞭毛，一个占细胞总体积近40%的大型杯状叶绿体。莱茵衣藻培养条件简单，能进行光合作用而自养生长，也能同化外来碳源进行异养生长，还可以自养、异养同时进行；其生长速度快，细胞倍增周期为5-6小时，可以在短时间内大量繁殖，因上述特性，使得莱茵衣藻作为藻类研究的模式生物，被广泛地应用于各种研究中。
[0003]目前，莱茵衣藻的全基因组序列测序已经完成，其核基因组大小约为100Mb，线状的线粒体基因组大小为15.7kb，环状的叶绿体基因组大小为203.8kb，更重要的是，针对核基因、叶绿体基因和线粒体基因的遗传转化体系已经比较成熟，使莱茵衣藻成为理想的转基因植物受体和生物反应器。已有数种蛋白在莱茵衣藻中成功表达，例如:张中林等将丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3-C后在莱茵衣藻叶绿体中成功表达(张中林，山松，陈曦等.丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究，遗传HEREDITAS(Beijing).1999; 21: 1_6);胡章立等将增强型绿色荧光蛋白基因转入莱茵衣藻核基因中，成功实现了该蛋白的稳定表达(胡章立，王潮岗，吴锦霞.增强型绿色荧光蛋白在莱茵衣藻中的高效表达.深圳特区科技.2005，O: 217-222);李明泽等实现了细胞色素cytb5基因在莱茵衣藻中的活性表达(李明泽，程奇.含铁蛋白cyb5融合基因莱茵衣藻核转化表达载体的构建及转化.中国农学通报，2013，30: 4515-4522)，因此，开展莱茵衣藻外源基因表达的研究具有重要的应用价值。
[0004]但是，莱茵衣藻外源基因表达仍存在问题:一方面外源基因的表达效率不够高，与其它成熟表达宿主(如大肠杆菌、毕赤酵母)相比，其外源基因表达能力远远落后；另一方面，现阶段的表达载体只能完成单个外源基因的表达，对多个基因同时表达的情况无法应对，并且国内外市场上也没有成熟的载体和表达系统能完成上述工作，由此可见，开发新的表达载体和体系十分必要。
[0005]
【发明内容】
[0006]为克服上述提到的缺点，本发明的目的是提供一种能同时表达多个外源基因的莱茵衣藻表达载体，本发明提供可同时表达多基因的莱茵衣藻表达载体是Dh5 a/PJD124，保藏号CCTCC NO: M 2014394，保藏日期为2014.8.30，分类命名和拉丁文学名为大肠杆菌DH5a/pJD124 (Escherichia coll DH5 a/pJD124)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址是中国.武汉.武汉大学，邮编是430072，传真(027)68754833，email是cctcciwhu.edu.cn,该培养的存活性于2014.9.5检测完毕，结果为存活。
[0007]本发明的另外一个任务是提供这种能同时表达多个外源基因的莱茵衣藻表达载体的构建方法，为实现这个目的，本发明采用的技术方案如下:实现本发明的技术方案是:
1.以初始载体质粒pH124为模板，DNA序列表中BleF(SEQ ID NO:1)和BleR (SEQID NO: 2)所示DNA为引物，进行PCR扩增，得到含有博莱霉素抗性基因的DNA片段的博莱霉素抗性基因Ble resistant，博莱霉素抗性基因Ble resistant的序列表SEQ ID NO:7所示；所述的质粒PH124在申请号为201310234919.2，申请人为深圳大学，发明名称为“一种表达石斑鱼抗菌肽Piscidin的转基因莱茵衣藻的构建和应用”的说明书中有公布；
2.以初始载体质粒pH124为模板，RBCSTF(SEQ ID NO:3所示)和RBCSTR (SEQ IDNO:4所示)为引物，进行PCR扩增，获得终止子Ter，终止子Ter序列如序列表SEQ ID NO:8所示；
3.以人工合成的启动子Ph5_,b(DNA序列如SEQ ID NO:9所示)为模板，ProF (SEQ IDNO:5所示)和ProR (SEQ ID NO:6所示)为引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物经纯化后连入Takara公司的pMD18_T simple载体中，得到中间重组载体,记作pJDl。
[0008]4.用EcoRI和BamHI酶切载体pJDl，回收载体大片段A ;用EcoRI和BamHI酶切终止子Ter，回收302bp片段；将所述载体大片段A与所述302bp片段连接，得到重组载体，记作PJD12 ；
5.用BamHI和NotI酶切载体pJD12，回收载体大片段B ;同样用BamHI和NotI酶切博莱霉素抗性基因Ble resistant,回收1170bp片段；将该片段与所述的载体大片段B连接、转化，得到重组载体，记作PJD124，即为目的表达载体Dh5 a /pJD124 ；
通过本发明构建的载体进行多个外源基因的共表达具有以下几个方面的优势:
1.基因表达效率高，与普通表达载体不同，PJD124能够保证每个外源基因都有独立的启动子和终止子，避免了多个基因在同时转录、翻译过程中的相互干扰，有效提高每个基因的表达效果。
[0009]2.简便、快捷，仅通过两次酶切反应和一次酶连反应便可构建出外源基因的共表达质粒。
[0010]3.经济，仅需要一对同尾酶(BamHI/Bglll或者StuI/SacI)和T4 DNA连接酶就能完成多基因表达载体的构建，简单经济。
[0011]
【附图说明】
[0012]图1为载体PJD124的构建流程图；
图2为载体pJD124的示意图,示载体多克隆位点及关键信息；其中启动子Ph5-rt，Ter代表终止子，Ble resistant代表博莱霉素抗性基因，pMD backbone代表pMD18_T simple载体骨架，Tin554F和Tin554R代表载体测序引物区域，图中标注的酶切位点在pJD124中均为唯一。
[0013]图3为载体pJD124单独表达GFP基因的构建流程图；
图4为载体pJD124单独表达RED基因的构建流程图；
图5为载体pJD124同时表达RED基因和GFP基因的构建流程图；
图6为载体pJD124-GFP、pJD124_RED的酶切鉴定；其中M为DNA marker, I为pJD 124-RED酶切后图谱，2为pJD124_RED酶切前图谱，8为pJD124_GFP酶切前图谱，9为PJD124-GFP酶切后图谱。
[0014]图7为载体pJD124-GFP-RED的酶切鉴定；其中M为DNA marker，l和2均为为PJD124-GFP-RED酶切前图谱。
[0015]图8为转基因工程藻基因组PCR验证结果.
【具体实施方式】
[0016]下述实施实例中所采用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]下述实施实例中所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0018]实例一本发明载体PJD124的构建
载体pMD18_T simple购自Takara公司，内切酶、T4 DNA连接酶购自Thermo Science公司，引物、人工基因均合成于上海生工生物工程公司。
[0019]BleF (SEQ ID NO:1)和 BleR (SEQ ID NO:2)为 PCR 扩增引物序列，用于扩增博莱霉素抗性基因。
[0020]RBCSTF (SEQ ID NO:3)和 RBCSTR (SEQ ID NO:4 )为 PCR 扩增引物序列，用于扩增终止子。
[0021]ProF (SEQ ID NO:5)和 ProR (SEQ ID NO:6)为 PCR 扩增引物序列，用于扩增启动子fWrb。
[0022]SEQ ID NO:7为人工合成的博莱霉素抗性基因DNA序列。
[0023]SEQ ID NO:8为人工合成的终止子Ter的DNA序列。
[0024]SEQ ID NO:9为人工合成的启动子Ph5_rt的D NA序列。
[0025]1.载体PJD124关键元件的克隆
载体pJD124关键元件为抗性基因Ble、终止子Ter、启动子Ph5_,b。其中抗性基因Ble是以BleF/BleR (SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2)为引物，质粒pH124为模板扩增而获得；终止子 Ter 以 RBCSTF/RBCSTR (SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)为引物，质粒 pH124 为模板扩增而获得；以ProF/ProR (SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)为引物，人工合成基因启动子Ph5_rt (DNA序列如SEQ ID NO:9所示)为模板扩增获得扩增产物(上述引物中已经加入了相应的内切酶识别位点)。
[0026]2.将启动子Ph5_A的扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后，再克隆入PMD18-Tsimple载体中，获得中间载体pJDl.3.用EcoRI和BamHI酶切载体pJDl，回收载体大片段A ;用EcoRI和BamHI酶切DNA片段Ter，回收302bp ;将所述载体pJDl的回收载体大片段A与所述302bp片段连接，得到中间载体，记作PJD12。
[0027]4.用BamHI和NotI酶切载体pJD12，回收载体大片段B ;同样用BamHI和NotI酶切DNA片段Ble，回收1170bp片段；将该片段与pJD12载体大片段连接、转化