匹马霉素a菌株的代谢工程优化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术，特别设及一株匹马霉素A菌株的代谢工程优化方法。 技术背景
[0002] 匹马霉素的结构简单，化学性质稳定，是一种常用的多締类抗生素，被广泛用作食 品（如奶酪等非灭菌食物）防腐添加剂、抗真菌兽药W及用于角膜炎治疗。在目前最常用 的四种多締类抗生素（匹马霉素、两性霉素B、制霉菌素及杀念菌素等）中，匹马霉素的溶血 毒性最低，但其抗真菌活性同样也相对较低。相对偏低的药理性质，严重限制了匹马霉素在 临床中的应用价值。为获得抗真菌活性更高，溶血毒性更低的匹马霉素衍生物，我们通过基 因工程改造的方法，在匹马霉素高产菌株L10的基础上，构建了 P450单加氧酶基因pimG失 活菌株胞〇1 (专利申请号为201410592642. 5)。
[0003] 经发酵验证，菌株胞01可W产生两种具有抗真菌活性的匹马霉素衍生物，分别为 匹马霉素AQ2-脱駿-12甲基-匹马霉素）与匹马霉素B(4, 5-脱环氧-12-脱駿-12甲 基-匹马霉素）。其中，匹马霉素A的活性是匹马霉素的2倍，而其毒性不足匹马霉素的 1/4,是一种高效低毒的匹马霉素衍生物，具有良好的应用前景；匹马霉素B的毒性非常低， 但是其活性仅为匹马霉素的1/2左右，较低的活性使其临床应用受到限制。因此，通过基因 工程改造的方法，消除菌株胞〇1中低活性匹马霉素B的产生，并进一步提高高效低毒匹马 霉素A的产量，将极大的推动匹马霉素A的工业化生产，具有重要的经济价值。此外，通过 生化实验验证，我们发现，匹马霉素B是匹马霉素A未发生C4-巧位环氧化的前体，因此，我 们在胞01菌株中尝试通过超量表达负责编码环氧化酶的基因pi血，使匹马霉素B完全转化 为匹马霉素A，从而，完全消除匹马霉素B的产生，并提高匹马霉素A的产量，进而达到优化 产生菌株的目的。。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的，在于通过高表达匹马霉素AQ2-脱駿-12甲基-匹马霉素）生物 合成基因簇后修饰基因pi血，优化其产生菌株，提高高效低毒匹马霉素A的产量。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明采用了 W下技术方案；一种匹马霉素A优产菌株 的代谢工程优化方法，通过在菌株Streptomyces chattanoogensisQZOl中过表达后修饰基 因pi血，使匹马霉素B完全转化为匹马霉素A，使匹马霉素A的产量得W提高，并完全消除 菌株QZ01中低效组份匹马霉素B的产生。
[0006] 所述pi血是P450单加氧酶基因，负责编码催化匹马霉素A中C4-巧位环氧键的 形成，pi血的基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述基因pi血的过表达构建步骤如下：
[000引第一步；设计并构建用于基因pi血过表达的整合型质粒I ;
[0009] 第二步：将第一步构建得到的质粒I结合转移导入受体菌株胞01中；
[0010] 第S步：通过对突变株的PCR验证及阿伯拉霉素抗性验证筛选得到过表达菌株 QZ03〇
[0011] 所述质粒I是在质粒pIB139的Ndel/EcoRI位点插入1. 2化测序确认的基因pi血 的PCR片段构建而成。
[0012] 本发明可W使后修饰基因pi血的转录水平提高约7倍左右，进而大幅度提高 C4-巧位环氧化效率，使低效匹马霉素B完全转化为高效低毒匹马霉素A，并使匹马霉素A 的产量提高了 20 %，极大推动了匹马霉素A的工业化生产。
【附图说明】
[001引图1为过表达菌株胞03的后修饰基因pi血转录变化示意图。
[0014] 具体实施方法
[001引步骤一：整合型质粒I的构建
[0016] W菌株 Streptomyces chattanoogensis QZ01 的基因组 DNA 为模板，使用引物 pi血-F/R，通过PCR扩增得到完整的基因pi血，通过基因测序确认PCR片段的正确性；在质 粒PIB139的Ndel/EcoRI位点插入测序正确的pi血基因片段（Ndel/EcoRI酶切位点）；通 过上述方法得到用于基因pi血过表达的质粒I。在37°C水浴条件下，采用Ndel、EcoRI两 种限制性内切酶进行酶切处理可W观察到1.化b的目标DM条带，表明质粒构建正确。
[0017] 步骤二；将整合型质粒I通过结合转移的策略导入菌株胞01，并筛选得到基因 pi血过表达的菌株胞03。
[001引将已构建完成用于基因过表达的质粒I转化进入大肠杆菌宿主E.coli ET12567(含有PUZ8002质粒）中。取该转化子于含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素S种 抗生素的LB中于37°C过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10%的比例转接一次并 培养化，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体W除去培养物中的抗生素。于此同时制备菌株胞01 的新鲜抱子约109个，用TES溶液漂洗2~3次之后再用2mLTES溶液悬浮抱子，于50°C热激 lOmin后，冷却至室温，等体积加入2X抱子预萌发培养液后于37°C培养2.化，并用新鲜的 LB溶液漂洗抱子2~3次。将预萌发的抱子与之前制备的大肠杆菌宿主菌E. coli ET12567 混合（抱子和宿主菌的比例约为10 ;1)均匀后涂布于YMG平板，待平板吹干后转移至30°C 培养箱正置培养1化后取出平板，分别取阿伯拉霉素和蒙晚酬酸两种抗生素混匀于ImL无 菌水中，覆盖于YMG平板上，将平板惊干后转移至30°C培养箱中培养。一般3~5天后可见 平板上有单菌落结合子长出，采用pi血1-F/R为引物，通过菌丝体PCR验证和抗性验证的方 法验证结合子正确，即得到过表达菌株胞03。
[0019] 上述步骤二中所用到的引物序列如表1所示：
[0020] 表 1
[0021]
【主权项】
1. 匹马霉素 A菌株的代谢工程优化方法，其特征在于：通过在菌株Streptomyces chattanoogensisQZOl中过表达后修饰基因 pimD，使匹马霉素 B完全转化为匹马霉素 A，使 匹马霉素 A的产量得以提高，并完全消除菌株QZOl中低效组份匹马霉素 B的产生。
2. 如权利要求1所述的匹马霉素 A菌株的代谢工程优化方法，其特征在于：所述pimD 是P450单加氧酶基因，负责编码催化匹马霉素 A中C4-C5位环氧键的形成，pimD的基因序 列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根据权利要求1所述的匹马霉素 A菌株的代谢工程优化方法，其特征在于：所述基 因 pimD的过表达构建步骤如下： 第一步：设计并构建用于基因 pimD过表达的整合型质粒I ; 第二步：将第一步构建得到的质粒I结合转移导入受体菌株QZOl中； 第三步：通过对突变株的PCR验证及阿伯拉霉素抗性验证筛选得到过表达菌株QZ03。
4. 根据权利要求1所述的匹马霉素 A菌株的代谢工程优化方法，其特征在于：所述质 粒I是在质粒PIB139的Ndel/EcoRI位点插入I. 2kb测序确认的基因 pimD的PCR片段构 建而成。
【专利摘要】本发明提供了一种匹马霉素A菌株的代谢工程优化方法，是通过在菌株Streptomyces chattanoogensisQZ01中过表达后修饰基因pimD，使匹马霉素B完全转化为匹马霉素A，使匹马霉素A的产量得以提高，并完全消除菌株QZ01中低效组份匹马霉素B的产生。本发明利用代谢工程方法构建了一株高效低毒的12-脱羧-12-甲基匹马霉素优产菌株，该菌株在实现高效低毒匹马霉素A产量提高20％的基础上，消除了副产物匹马霉素B的产生，为匹马霉素A的工业化生产奠定了基础。
【IPC分类】C12R1-465, C12N15-53, C12N15-76
【公开号】CN104630254
【申请号】CN201510075420
【发明人】白林泉, 齐震, 康前进, 姜春艳
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月12日