一种酿酒酵母基因表达系统及其构建与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其是设及一种整合型酿酒酵母基因表达系统及 其构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 随着基因组学日新月异地发展，人们迫切寻求合适的表达系统用于新型基因的挖 掘和新型工程细胞的构建，为此，各种不同的表达体系应运而生，如细菌、昆虫细胞、酵母、 哺乳动物细胞表达系统等。近年来W酿酒酵母为代表的酵母表达系统W其独特生物学特 性，已成为代谢工程改造生产生物基产品、有效表达新型外源基因，服务于基础研究、工业 和医药应用的重要工具。酿酒酵母是迄今为止伴随人类生产、生活最长，和人类关系最密切 的一种酵母。不仅可用于酿酒、面包和慢头制作等，是最具生物安全性的微生物，还可用于 酒精、酶、氨基酸等工业生产，是现代分子和细胞生物学中重要的真核模式菌株。
[0003] 由于酿酒酵母在工业生产中具有良好的发酵性能，在发酵过程中能够快速繁殖、 对杂菌污染具有较强抗性，使其在基因工程技术中常被用于代谢工程改造的出发菌株。通 过基因表达和基因敲除等手段的运用，所构建的酿酒酵母代谢工程菌常被用于大宗化学产 品的生产，如燃料己醇、了醇、大宗化学品乳酸、高附加值产品木糖醇、有机酸类W及微生物 菌体蛋白等多种生物基产品，同时由于其较好的生物安全性，使其在医药、食品行业也具有 广泛的应用。
[0004] 然而，良好的模式菌株，除自身具有的优良特色外，还需要可适用的载体工具 的有效支持，用W充分挖掘相关菌株优良信息，因此，目前发展了多种类型的表达载 体。其中，附加型质粒是应用于酿酒酵母的常规质粒，W酿酒酵母自身2y复制子序列 作为能够在细胞内自主复制的调控序列。附加型质粒具有较高的转化效率和拷贝数， 但是在非选择压力条件下不稳定，传代易丢失（Malissard M，Zeng S，Berger E.化e yeast expression system for recombinant glycosyltransferases. Glycocon Jugate Journal, 1999, 16 (2) : 125-139)，因此附加型质粒难臥有效进行外源基因的稳定表达，无法 适应大规模生产的要求。
[0005] 因此，为了提高质粒系统在酿酒酵母中稳定传代与表达，需采用整合的方式将质 粒有效整合于酿酒酵母的基因组中，在细胞繁殖过程中使其复制能够同基因组的复制同时 进行。同时，也需要兼顾基因的拷贝数情况来选择合适的整合位点。早期的整合型质粒的 整合位点多为营养标记基因，在基因组中的拷贝数较少，导致整合的质粒拷贝数也较少，使 得蛋白表达量低，无法满足大规模生产的需求。
[0006] rDNA序列在酵母基因组中有100-200个拷贝单元，是整合型质粒在酿酒酵母基因 组中优良的整合位点。因此可选择W该序列为基础构建在酿酒酵母中适用的整合型表达载 体，从而实现所构建的质粒在酵母细胞中W-定拷贝数稳定存在并表达。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种应用于酿酒酵母的表达系 统。本发明的表达载体可实现在酿酒酵母中的整合型稳定表达，对酿酒酵母的基础理论研 究及产品开发具有重要的意义。
[000引本发明的技术方案如下；
[0009] 本发明一方面设及一种酿酒酵母的基因表达系统，包括一种新型表达载体，其为 环状，从5' -3'依次可操作性地连接有W下元件：
[0010] pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因 表达盒；
[0011] 所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点W及 转录终止子；
[0012] 所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
[0013] 所述酵母为酿酒酵母。
[0014] 所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子和转录终止子的DNA序列来自 Spathaspora passalidarum，该酵母全基因组序列在 NCBI (ht1:p://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中的编号为NZ_AEIK00000000,其中所述酵母可为来自美国农业研究菌种保藏中屯、 的细胞株NRRL Y-27907。
[00巧]优选的，所述的rDNA同源重组序列为18s rDNA,序列如SEQ ID NO: 1所示。另一个 选择是，所述的rDNA序列与SEQ ID N0:1的相似性不低于90%，优选为95%，更优为98%。
[0016] 所述rDNA同源重组序列为18s rDNA序列。
[0017] 所述外源基因表达盒中的启动子包括SpADHp、SpXYLp;转录终止子包括SpCYCl T、 SpX化T。
[0018] 所述筛选标记基因表达盒中的启动子包括SpTEFlp;抗生素抗性基因可W是表达 载体中常用的，包括潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、G418 ;转录终止子包括SpCYCIt、 ScCYCIt。
[0019] 所述的18s rDNA序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0020] 所述的SpADHp启动子为Spathaspora passalidarum来源的己醇脱氨酶基因ADHl 启动子，该启动子的DM序列如SEQ ID NO: 2所示；
[0021] 所述的SpXYLp启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL 启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
[0022] 所述的SpTEFlp启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因 TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID N0:4所示；
[002引 所述的SpCYCli终止子为Spathaspora passal idarum来源的细胞色素C基因CYC1 终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO: 5所示；
[0024] 所述的SpXYLi终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL 终止子，该终止子的DM序列如SEQ ID NO:6所示。
[0025] 所述的ScCYCIt终止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素C基因CYCl 终止子，该终止子的DM序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0026] 所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和筛选标记基因，所述外源基因插 入所述外源基因表达盒中启动子和转录终止子之间。在本发明的一个实施例中，所述外源 基因为奸P基因，该基因的DM序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0027] 所述的筛选标记基因表达盒中可包括一个W上的标记基因，所述标记基因可为潮 霉素B抗性基因、博来霉素抗性基因和/或G418;在本发明的一个实施方案中，所述标记基 因是潮霉素B抗性基因。
[002引所述的潮霉素B抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
[0029] 所述的博来霉素抗性基因的DM序列如SEQ ID NO:9所示。
[0030] 所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0031] 本发明所使用的宿主酵母为酿酒酵母。具体的，该酿酒酵母为a型单倍体菌株 Saccharomyces cerevisiae ANGA1。所述 Saccharomyces cerevisiae ANGA1 的制备方法 为；郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能巧]:[博±学位论文].无锡：江南大学 生物工程学院，2011，第二章内容所述。
[0032] 具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型表达载体：
[0033] W Spathaspora passalidarum 基因组 DNA 为模板，W引物 P1 和 P2 进行 PCR 扩增 获得18s rDNA同源重组序列；W引物P5和P6进行PCR扩增获得SpTEFlp启动子；W引物 P7和P8进行PCR扩增获得SpA畑Ip启动子；W引物P9和P10进行PCR扩增获得SpXYL P启 动子；W引物P11和P12进行PCR扩增获得SpCYCli终止子；W引物P13和P14进行PCR扩 增获得SpXYLt终止子。W PRS303H质粒DNA为模板，W引物P3和P4进行PCR扩增获得片 段hph-ScCYClT。所述引物P1-P2的核巧酸序列如SEQ ID NO. 13-14所示，所述P5-P14的 核巧酸序列如SEQ ID N017-26所示。
[0034] W PMD19-Tsimple为骨架，将上述各片段连接，所述连接是在适当的限制酶酶切 位点上进行的。具体连接方式为；在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位点连接18s rDNA后，沿 着18s rDNA的方向依次连接外源基因表达盒启动子、外源基因表达盒转录终止子、SpTEFlp 启动子、h地-ScCYCIt。
[0035] 酵母基因表达调控是一个非常复杂的过程，选择合适的启动子和转录终止子对外 源蛋白的表达至关重要。本发明提供了可供外源蛋白表达的启动子和转录终止子组合， 包括 SpADHp-SpCYCli、SpXYLp-SpCYClT、SpADHp-SpXYLi、SpXYLp-SpXYLi、SpTEFl广SpCYClj、、 SpX 化广 SpXYLj。
[0036] 所述启动子根据W下方法预测获得：
[0037] (1)根据Spathaspora passalidarum基因组序列，选择酵母表达系统中常用的启 动子所属基因与上一个基因的开放阅读框之间的所有核巧酸片段；
[003引 （2)采用启动子在线测评软件，对可能的启动子序列进行在线预测；
[0039] (3)根据高评分值的潜在启动子序列，设计引物扩增获得待测启动子序列。
[0040] 所述终止子根据W下方法获得：
[004U (1