专利名称：一种高产酯酿酒酵母基因工程菌及其构建方法
一种高产酯酿酒酵母基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种高产酯酿酒酵母基因工程菌及其构建方法。
背景技术：
酯香物质是饮料酒中主要的风味物质，较高的酯含量不仅赋予饮料酒重要的酯香，同时能有效地扩张、松驰神经，可减少喝酒引起的副作用。国内普通白酒和黄酒是以纯种培养的酿酒酵母为主进行发酵的，其特点是发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。高档饮料酒，如黄酒、白酒等，酯香物质含量较高的主要原因是采用自然网罗微生物制曲发酵，通过自然制曲网罗的产酯能力较强的汉逊酵母和假丝酵母等生香微生物来提高酒中酯含量，而这些野生酵母的存在严重影响原料出酒率，其酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致我国高档白酒和黄酒耗粮高、 生产周期长、效率低、成本高。如何提高酒中酯香物质的含量，一直是我国普通白酒、黄酒企业和相关科研单位研究的重要课题。目前提高普通白酒酯含量的主要方法有如下三种一是固液结合法，用液态法生产酒基，用固态法的酒糟、酒尾或成品酒来提高质量；二是调香法，用天然香料调制或用纯化学药品按某一名酒的香味成分组成来进行调香；三是全液法，在发酵醪中加入产香微生物，己酸菌发酵液或将己酸发酵液经化学，生物法酯化后，再加到发酵醪中。这些提高酒中酯香物质含量的方法大多是从工艺水平上进行的，虽然酯含量有一定提高，但酒质与高档名酒相差仍很大，特别是化学药品的加入存在安全隐患。研究表明，乙酸酯类，如乙酸乙酯(溶剂类香气)，乙酸异戊酯(香蕉风味)和苯乙基酯(花香、玫瑰香)，是酒中主要的风味活性酯。这些酯类的形成是在酵母代谢时在酵母内合成的，形成的酯一部分通过细胞扩散到发酵液中，一部分被酵母吸附，留在细胞体内。参与乙酸酯合成的酶主要是醇乙酰基转移酶(AATase)，该酶催化乙醇和乙酰辅酶 A形成乙酸酯。该酶是一种巯基酶，有三种不同的类型AATase I、Lg-AATase I和AATase II，分别由ATF1、Lg-ATFl和ATF2编码。而由IAHl编码的酯酶是乙酸异戊酯水解的关键酶，该酶可以催化乙酸异戊酯水解成乙酸和异戊醇。综上所述，黄酒和白酒是我国的特色酒种，普通酒原料出酒率高，但酯香物质含量低，成品酒质量较差；高档酒酯香物质含量高、品质好，但原料出酒低，生产成本高。目前国内提高饮料酒酯香物质含量的方法仍存在很多问题。因此，要从根本上解决酿酒酵母的产酯能力还是需要利用分子生物学育种技术构建高产酯的酿酒酵母工业菌株。
发明内容本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种高产酯酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法。本发明的技术方案
一种高产酯酿酒酵母基因工程菌，所述酯酿酒酵母基因工程菌(Saccharomyces cerevisiae)EY-13,已于2010年11月17日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路甲3号)，保藏号为CGMCC No 4350， 建议命名为酿酒酵母。一种所述高产酯酿酒酵母基因工程菌的构建方法，步骤如下1)将pPGKl质粒上的PGKl启动子和终止子基因酶切下来后再与pUC19质粒连接得到 pUC-PGKl ；2)将用PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码酯水解酶IAHl基因的同源片段IAH 连接到 pUC-PGKl 上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)将用PCR方法获得的来源于酿酒酵母的编码醇乙酰基转移酶ATFl基因插入到 PGKl启动子和终止子之间，得到pUC-PGKl-IAH-ATFl ；4)将来源于pUG6上的kan抗性基因连接到pUC-PGKl-IAH-ATFl上，得到质粒 pUC-PGK1-IAH-ATF1-kan ；5)将构建的载体质粒pUC-PGKl-IAH-ATFl-kan用Bpull02I酶切，用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株，将a型和α型基因工程单倍体融合，得到酿酒酵母基因工程菌。该构建方法的具体操作过程如下l)pUC19_PIAK 质粒的构建Hind III酶切pPGKl质粒，释放出约1.81Λ大小的PGKl片段，用Hind III酶切载体 口肌19，用 T4DNA 连接酶连接 PGKl/Hind III 禾口 pUC19/Hind III，构成质粒 pUC_P，BamH I 分别酶切IAHl同源片段和质粒pUC-P，用T4DNA连接酶连接，构成质pUC-PI，Xho I分别酶切ATFl基因和质粒pUC-PI，用T4DNA连接酶连接，构成质粒pUC-PIA，以pUC-PIA为模板，根据PGKl和ATFl序列设计相应引物验证ATFl方向，KpnI分别酶切Kan基因和质粒pUC-PIA， 用T4DNA连接酶连接，构成质粒pUC-PIAK ；2)重组酿酒酵母单倍体的构建Bpul 1021 (Blp I)酶切质粒pUC_PIAK，用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母a 型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株。根据酿酒重组位点两端的基因序列和插入载体质粒pUC-PIAK的序列，分别设计两组上下游引物，分别以生长较好的a型和α型单倍体转化子基因组为模板，分别进行PCR 扩增，验证重组子，引物序列为一组上游引物 ΙΑΚΓ F TAGTCTGTTTGAGCAGTCCTACCCT一组下游引物 ΙΑΚΓ R GAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCT二组上游引物 ΙΑΚ2，F GGCATTTGGCCAATTTCAAGGATCC二组下游弓丨物 ΙΑΚ2，R TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG一组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 2kb的特异性条带， 其大小与预期相当；二组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 3kb的特异性条带，其大小与预期相当。说明PUC-PIAK片段已成功重组到酿酒酵母单倍体基因组中。3)重组酿酒酵母基因工程菌的构建
将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选重组酿酒酵母基因工程菌(双倍体)。重组酿酒酵母基因工程菌的验证提取重组酿酒酵母基因工程菌的基因组并以其为模板，以ΙΑΚΓ F和ΙΑΚ1’ R， ΙΑΚ2’ F和ΙΑΚ2，R作为引物进行PCR扩增。一组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 2kb的特异性条带， 其大小与预期相当；二组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 3kb的特异性条带，其大小与预期相当，说明PUC-PIAK片段已成功重组到酿酒酵母基因组中，重组酿酒酵母基因工程菌构建成功。一种所述高产酯酿酒酵母基因工程菌，应用于传统黄酒工艺和传统白酒工艺的发酵。本发明的优点和积极效果本发明选用来自于酿酒酵母的PGKl作为启动子，在过表达酿酒酵母编码醇乙酰基转移酶ATFl基因的同时，将酿酒酵母基因组中编码酯水解酶的IAHl基因敲除，获得了高产酯酿酒酵母基因工程菌EY-13(CGMCC No 4350)。本发明所获得的酿酒酵母工程菌 Saccjaromyces cerevisiae EY-13 (保藏号CGMCC No4350)与初始的酿酒酵母菌(受体菌 Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)相比，模拟黄酒发酵后，异戊醇含量降低了约50%，乙酸乙酯含量提高了将近20倍，乙酸异戊酯的含量提高到100mg/L，乙酸异丁酯含量提高到5 7mg/L ；模拟白酒发酵后，总酯提高了 4倍，其中乙酸乙酯提高了近35倍，为酿酒工业生产提供了优良菌株。
图1为pUC-PIAK质粒的构建路线图。图2为pUC-PIAK质粒的验证电泳图。图3为载体pUC-PIAK与酵母基因组的同源重组路线图。图4为重组酿酒酵母单倍体的验证电泳图，其中a)为a型重组单倍体验证结果； b)为α型重组单倍体验证结果。图5为重组酿酒酵母基因工程菌的构建路线图。图6为重组酿酒酵母基因工程菌的验证电泳图。图7为发酵工艺路线图。
具体实施方式本发明所述的重组酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具体为EY-13， 已于2010年11月17日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为中国北京市朝阳区大屯路甲3号)，保藏号为CGMCC No4350，建议命名为酿酒酵母。本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为公知方法。
实施例1 高产酯酿酒酵母基因工程菌的构建l)pUC19_PIAK 质粒的构建Hind III酶切pPGKl质粒，释放出约1.81Λ大小的PGKl片段；用Hind III酶切载体 pUC19 ；用 T4DNA连接酶连接 PGKl/Hind III 和 pUC19/Hind III，构成质粒 pUC_P ；BamH I分别酶切IAHl同源片段和质粒pUC-P ；用T4DNA连接酶连接，构成质pUC_PI ；Xho I分别酶切ATFl基因和质粒pUC-PI ；用T4DNA连接酶连接，构成质粒pUC-PIA。以pUC-PIA为模板，根据PGKl和ATFl序列设计相应引物验证ATFl方向；KpnI分别酶切Kan基因和质粒 pUC-PIA ；用T4DNA连接酶连接，构成质粒pUC-PIAK，构建流程如图1所示。图2为pUC-PIAK 质粒的验证电泳图其中泳道1为5000bp DNALadder Marker ；泳道2为受体菌基因组PCR 扩增同源片断IAH ；泳道3为pUC-PIAK质粒PCR扩增同源片断IAH ；泳道4为受体菌基因组PCR扩增ATFl ；泳道5为pUC-PIAK质粒PCR扩增ATFl ；泳道6为pUC-PIAK质粒，PGK上游引物+ATFl下游引物PCR扩增结果；泳道7为pUC-PIAK质粒，PGK上游引物+ATFl上游引物PCR扩增结果；泳道8为pUC-PIAK质粒，PGK上游引物+下游引物PCR扩增结果；泳道 9为pUG6质粒PCR扩增Kan ；泳道10为pUC-PIAK质粒PCR扩增Kan ；泳道11为1Kb DNA Ladder Marker ；泳道12为载体pUC19单酶切线性结果；泳道13为pUC-PIAK质粒单酶切线性结果。2)重组酿酒酵母单倍体的构建Bpu 11021 (Blp I)酶切质粒pUC-PIAK ；用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株。同源重组过程如图3所示。根据酿酒重组位点两端的基因序列和插入载体质粒pUC-PIAK的序列，分别设计两组上下游引物，分别以生长较好的a型和α型单倍体转化子基因组为模板，分别进行PCR 扩增，验证重组子，引物序列为 一组上游引物 IAKl，F TAGTCTGTTTGAGCAGTCCTACCCT一组下游引物 ΙΑΚΓ R GAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCT二组上游引物 ΙΑΚ2，F GGCATTTGGCCAATTTCAAGGATCC二组下游弓丨物 ΙΑΚ2，R TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG一组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 2kb的特异性条带， 其大小与预期相当；二组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 3kb的特异性条带，其大小与预期相当。说明PUC-PIAK片段已成功重组到酿酒酵母单倍体基因组中。电泳结果如图4所示，其中(a)为a型重组单倍体验证结果；(b)为α型重组单倍体验证结果。图4为重组酿酒酵母单倍体的验证电泳图，其中a)为a型重组单倍体验证结果； b)为α型重组单倍体验证结果。图4中M为5000bp DNALadder Marker，泳道1为受体菌 a/ α型单倍体一组PCR阴性对照；泳道2为a/ α型重组单倍体一组PCR产物；泳道3为受体菌a/ α型单倍体二组PCR阴性对照；泳道4为a/ α型重组单倍体二组PCR产物。3)重组酿酒酵母基因工程菌的构建将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选重组酿酒酵母基因工程菌(双倍体)。图5为重组酿酒酵母基因工程菌的构建过程路线图。重组酿酒酵母基因工程菌的验证提取重组酿酒酵母基因工程菌的基因组并以其为模板，以ΙΑΚΓ F和IAK1，R， IAK2’ F和IAK2，R作为引物进行PCR扩增。一组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 2kb的特异性条带， 其大小与预期相当；二组的PCR产物经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约1. 3kb的特异性条带，其大小与预期相当，说明PUC-PIAK片段已成功重组到酿酒酵母基因组中，重组酿酒酵母基因工程菌构建成功。电泳结果如图6所示。图6为重组酿酒酵母基因工程菌的验证电泳图，图6中M为5000bp DNALadder Marker,泳道1为受体菌一组PCR阴性对照；泳道2为工程菌一组PCR产物；泳道3为受体菌二组PCR阴性对照；泳道4为工程菌二组PCR产物。实施例2 模拟黄酒发酵实验1)发酵工艺路线见图7。2)工艺条件浸米条件25 30°C，浸渍72h ；蒸煮条件常压蒸30min左右，颗粒均勻、内心无白；前酵条件J8°C，5天。3)配料粳米=IOOg ；熟麦曲=IOg ；水:105ml，所述水包括清水60ml、浆水45ml，不包括浸米吸水和蒸饭吸水；接种量10% (20mL)。按上述模拟工艺对酿酒酵母工程菌EY-13及其单倍体(a型和α型)和出发菌株 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)及其单倍体(a型和α型)分别进行半固态发酵实验；发酵期间每隔1 振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精体积分数以及主要香气成分含量，以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表1。表1酿酒酵母受体菌和酿酒酵母工程菌的黄酒发酵性能
权利要求
1.一种高产酯酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述酯酿酒酵母基因工程菌 (.Saccharomyces cerevisiae)YX~l ,,已于2010年11月17日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No 4350，建议命名为酿酒酵母。
2.一种如权利要求1所述高产酯酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤如下1)将pPGKl质粒上的PGKl启动子和终止子基因酶切下来后再与pUC19质粒连接得到 pUC-PGKl ；2)将用PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码酯水解酶IAIR基因的同源片段以//连接到 pUC-PGKl 上，得到 pUC-PGKl-/A7 ；3)将用PCR方法获得的来源于酿酒酵母的编码醇乙酰基转移酶JTFl基因插入到PGKl 启动子和终止子之间，得到pUC-PGK 1-IAH-A TFl ；4)将来源于pUG6上的kan抗性基因连接到pUC-PGKI-JAYjTFl上，得到质粒 pUC-PGK 1-IAH-A TFl ~kan ；5)将构建的载体质粒pUC-PGKl-JAYjTFl-h/ 用φ 1102Ι酶切，用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株， 将a型和α型基因工程单倍体融合，得到酿酒酵母基因工程菌。
3.—种如权利要求1所述高产酯酿酒酵母基因工程菌，其特征在于应用于传统黄酒工艺和传统白酒工艺的发酵。
全文摘要
一种高产酯酿酒酵母基因工程菌，所述酯酿酒酵母基因工程菌EY-13，已于2010年11月17日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo4350，建议命名为酿酒酵母；其构建方法是通过选用来自于酿酒酵母的PGK1作为启动子，在过表达酿酒酵母编码醇乙酰基转移酶ATF1基因的同时，将酿酒酵母基因组中编码酯水解酶的IAH1基因敲除来实现。本发明所获得的酿酒酵母工程菌与初始的受体菌相比，模拟黄酒发酵后，异戊醇含量近一半，乙酸乙酯含量提高20倍，乙酸异戊酯的含量为100mg/L，乙酸异丁酯含量为5~7mg/L；模拟白酒发酵后，总酯提高了4倍，乙酸乙酯提高了35倍，为酿酒工业生产提供了优良菌株。
文档编号C12N15/54GK102199556SQ20111009487
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者孙溪, 张建炜, 张翠英, 王文阳, 肖冬光, 葛枭雄, 郭学武 申请人:天津科技大学 被以下专利引用 (1),