专利名称：用基因变异的酵母Yarrowia Lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法
技术领域：
本发明涉及用基因变异的酵母Yarrowia Lipolytica(欧蓍草脂解酶下称Y.Lipolytica)制造柠檬酸(CS)的生物技术方法。
目前，99％的柠檬酸是采用生物技术途径选择的子囊菌种墨曲霉进行大规模工业生产的，特别是以糖蜜和其它含糖的农业废料用作碳-源(c-源)，按这种方法也含生成大量液体和固体的副产物。以结晶形态销售的柠檬酸广泛地用于各工业部门，主要是在食品工业和医药工业中作为味觉载体、防腐剂、酸味剂和抗氧剂使用(Roehr et al.1996，citric acid，Biotechnology vol.6，Rehm and Reed，eds)。
有意义的是另一可选择的方法，它系用Y.Lipolytica酵母生产柠檬酸，该方法基于此酵母的性能，能利用一系列疏水性的作用物如植物性和动物性的油和油脂或正烷烃作为c-源。从60年代中期以来已知Y.Lipolytica在特定条件下具有分泌柠檬酸(cs)和异柠檬酸以及媒解代谢作用的其它代谢产物，如丙酮酸酯和α-酮戊二酸酯的能力。自那时起广泛地研究了相应的培养条件，对这类代谢物过量生产和析出最重要的先决条件是同时存在可利用c-源的生产培养物的生长限制(stottmeister et al.1982，Z Allg Mileroliol.22399-424)。此处培养物生长限制是通过限定必要的营养培养基成分，例如矿物质、维生素和氨基酸来达到的。所生产代谢产物的种类取决于起限制作用的营养物组分和其它培养条件，如采用的c-源或生产培养基的pH-值。
氮-、磷-、硫-或镁-缺乏可导致柠檬酸和异柠檬酸的过量生产[stottmeister et al.1982，Z Allg.Mikrobiol 22399-424]。因而对营养缺陷型菌种通过氨基酸缺乏能诱发cs/ics的生成(Barth imd Krebs 1984，DD 227 448 A1)；与此相反，通过硫胺素缺乏的生长限制引起生成α-酮戊二酸和丙酮酸酯，而硫胺素不只是由Y.Lipolytica本身生成的(Weissbrodt et al.1988，DD 267999 A1，Chernyavskaya et al.2000，ApplMicro-biol Biotechnol 53152-158)。
在一柠檬酸生产的工业过程中，不希望同时产生10％以上的异柠檬酸(以cs+1cs)总酸含量计，因为这会增加产品加工，尤其是增加CS结晶的困难。
Cs/1cs产物的比例和产品收率对Y.Lipolytica的野生型菌种与所用的c-源有关，对葡萄糖和甘油而言，Y.Lipolytica生成约90％的CS和10％1CS(Treton et al.1978，Appl Microbiol Biotechnol 667-77)，在应用乙醇作为C-源时得到相似的产物比例(Arzumanvv et al.2000，ApplMicrobiol Biotechnol 53525-529)。在用对工业应用有意义的疏水性作用物，如植物油或n-烷烃时，产物比例移向1CS一部分从40至50％。(概况一览参见Stotlmeister et al.1982，z Allg Mikrobiol 22399-424，和Finogenova 1991，inAlkane metabolism and oversynlhesis ofmetabolites by microorganismus，Finogenova TV and sharyshev AA，eds，Center for Biological Research，udssR Academy of Science，Pushchino，Russia，pp96-114)，降低这种高含量的1CS-组分对用Y.Lipolytica进行工业规模生产柠檬酸成为决定性的成本要素。
在此基础上对自发产生的或通达化学的或UV致突变制成的Y.Lipolytica突变体进行选择，使其改变CS/1CS产物比方面做了大量工作。在这类突变化的其它试验研究中发现柠檬酸一和乙醛酸-循环酶的表达和调节有不同的变异，研究主要集中在顺头酸酶(ACO)、异柠檬酸列介酶(1CL)和异柠檬酸脱氢酶(NAD(P)-1DH)上。
Akiyama等人(1972，Agric Biol chem 36339-341)表明，通过化学致突变制得的突变体与较高ACO-活性的野生型菌种相比，能使CS/1CS产物比有利于向1CS方向移动，在Finogenova等人的工作中(Finogenva 1991.InAlkane metalolism and oversynthesis of metaloliteby microorganismus，Finogenova TV and sharyshev AA，eds，center forBiological Research，uSSR Academy of science，pushchino，Russia，pp96-114)制成的突变体与提高和减少1CS聚积的野生型相比，在柠檬酸和乙醛酸循环酶的比活性方面显示有一系列的变异。另外获得的知识是源自于通过确定的培养条件有目的地改变比酶活性，这样Hattori等人(1974，Hakko kogatku zasshi 52542-550)证明，通过用氨调节pH值对石蜡培养降低了顺序头酸酶和与NADP相关联的异柠檬酸脱氢酶的比活性，使产物比有利于向CS的方向移动。
尽管有许多论据认为柠檬酸和乙醛酸循环酶影响产物分布，但是生物化学和分子生物的关联迄今仍然不是很清楚。按目前已知的方法仍然不能有目的地制取对CS-生产形成较少1CS聚积的高效生产菌种。
近20年来基于在Y.Lipolytica酵母方面所进行的分子生物学深入研究，使得对基因型的菌种优化所有必要的方法都可利用(Barth andGaillardin 1997，FEMS Microliol BW 19219-237)，大量能参予疏水的作用物利用的基因都已进行了表征和克隆。迄今由上述的乙醛酸循环酶描述和克隆了异柠檬酸裂介酶(ICL-1)结构基因的序列(Barth andscheuler 1993，Mol Gen Genet 241422-430)。该基因的很强的和有良好调控性的启动子多次用于在Y.Lipolytica的蛋白质源性的表达(Juretzeket al.1995，DE 195 25 282，Juretzek et al.1998，DE 19932811，WO0003008)。
本发明的任务是开发一种用Y.Lipolytica酵母制取柠檬酸的方法，其中产生的异柠檬酸明显减少，而且可能成为有经济效益的柠檬酸生产方法。
按本发明该项任务通过一种Y.Lipolytica酵母细胞以生物技术制造柠檬酸的方法得以解决，包括的步骤为
a)在一个对生长有重要作用的基因中存在缺陷的酵母细胞进行转化，它有一个对多次基因组整合适宜的载体，该载体含有作为选择标记物起作用的且能补偿上述缺陷的基因；b)酵母是在一碳源和营养缺乏条件下培养的；c)柠檬酸的净化，此处，载体含有对异柠檬酸列介酶(1CL)活性编码基因序列的表达盒带和克隆是选择在一适宜的营养培养基中进行的，它稳定地在其基因组中整合了对1CL活性编码基因序列和选择标记物的多个拷贝。
1CL活性编码基因在酵母基因组中通过用特异多重拷贝的质粒载体的转化作用和选择印制达到多次整合，为此将一个对1CL活性编码的基因序列克隆在一个含有多重拷贝选择标记物的载体上，并且该载体转化到与选择标记的相匹配的Y.Lipolytica菌种中。
为此优选是将一个基因序列克隆在一载体上，该载体是按SEQID NO.1编码的蛋白质。按SEQ ID NO.1的本发明的1CL-蛋白质在它的序列中与由Barth和Schenben在1933，Mol Gen Genet 241422-430中所述已知的序列有显著的区别。
在一优选的实施模式中，将一按SEQ ID NO.2的表达盒带克隆在载体中，此时按SEQ ID NO.2表达盒带含有一按SEQ ID NO.1编码的本发明蛋白质的基因序列。
适宜的载体和Y.Lipolytica菌种对专业人员是已知且可得到的，该载体除了选择标记物，例如URA3-基因的等位基因变异体之外，还含有一同源的转化平台，如核糖体DNA(rDNA)或称为zeta的由Y.Lipolytica构成的反转座子Ylti的LTR-序列(长末端重复)，这样一个转化平台有可能对在酵母基因组中经常存在的序列通过同源性再组合进行整合(Juretzek et al.2001，Yeast 1897-113)。
集成转化是以线性化的载体应用醋酸锂方法实现的(改良的Barthand Gaillardin 1996，Yarrowia lipolytica.LnNonconventional yeasts inBiotechnology，woll k，ed，Springer-verlag，Berlin Heicleelerg New York，p313-388)。
转化为与标记基因相匹配的Y.Lipolytica菌种，在URA3-等位基因作为选择标记物的情况下它例如是Y.Lipolytica是菌种，而在其中URA3-基因是有缺陷的。带有URA3-基因缺陷的Y.Lipolytica菌种和它的制造方法在文献中已有描述(Barth und Gaillardin 1996，Yarrowialipolytica.InNoncon-ventional Yeasts in Biotechnology，woll k，ed，springer-Verlag，Berlin Heidellerg New York，pp313-388).
本发明方法的优点主要在于能够简单和有针对性地制备用于柠檬酸生产有效的Y.Lipolytica菌种，而其异柠檬酸的生成则减少。
优选采用的载体是含有按SEQ ID NO.2的表达盒带。
在实施实例1中描述了载体p641CL1和P671CL1转化为在URA3-基因中有缺陷的Y.Lipolytica菌种H222-S4(URA3-302)。质粒p641CL1和p671CL1含有一个在启动子区的URA3-基因缩短了的等位基因URA 3d4作为选择标记物。通过ura3d4-等位基因中启动子区的缩短，使ura3d4的多次整合进入酵母基因组中成为必要，以便补偿在uRA3-基因中的缺陷。带有其它多重拷贝选择标记物的质粒，例如LEU2-基因相应的等位基因变异体质粒和相应的Y.Lipolytica菌种也可以应用。
异柠檬酸裂介酶基因产物的表达度在Y.Lipolytica菌种中得到明显提高，该菌种将1CL-1-基因多次整合在其基因组中，同时比1CL尖性达到稳定的增加。令人惊异地发现，通过转录的、转译后的和代谢的反调节机制既不能相抵提高的1CL1-表达度，也不能抵消1CL活性(参见实施例2)。
为了制造柠檬酸，多次将1CL-1-基因整合于其基因组中的按本发明的Y.Lipolytica菌种在导致CS和1CS过量生产的营养缺乏条件下进行培养，例如在氮-、磷-、硫-、镁-缺失条件或应用缺乏氨基酸的营养缺陷型菌种。
优选通过1CL-1-基因稳定地整合在本发明的生产柠檬酸菌种的酵母基因组中，不再有用高成本化学品选择压力，因而本发明制备的生产柠檬酸的菌种在用于大容积的生物反应器(发酵罐)中不会有问题。
按本发明方法的一个重要经济的优势是用于生产柠檬酸的Y.Lipolytica菌种可以利用多种不同的C-1源，例如葡萄糖、甘油乙醇、正-烷烃、植物性或动物性油类或油脂。按本发明方法所用上述的作用物不希望得到的异柠檬酸的聚积与野生型菌种相比都明显减少。这样在用将1CL1-基因多次整合到其基因组中的Y.Lipolytica菌种制造柠檬酸时，令人惊异地出现CS/1CS产物比明显地移向柠檬酸的方向(见由于异柠檬酸成分大量减少，使随后的柠檬酸净化过程大为简化，可以用已知的方法例如通过沉淀或色谱方法实现。
本发明的另一对象是在实施例1中应用的按SEQ ID NO.2的表达盒带。
本发明的对象还有含有按SEQ ID NO.2的表达盒带的载体，优选是载体p641CL1ak p671CL1，它们的序列与SEQ ID NO.3或SEQID NO.4的序列相符。
本发明其它对象是Y.Lipolytica菌种，它将一个1CL活性编码的基因序列多个拷贝稳定地整合到它的基因组中，优选是按SEQ ID NO.2的序列。
优选还有是用p641CL1或p671CL1载体之一转化的Y.Lipolytica菌种。
另外优选是根据布达佩斯协定在Braunschweig市的德国微生物和细胞培养收藏公司(DSMZ)寄存的Y.Lipolytica Hzz-S4(p641CL1)T1菌种，寄存号为15105。
本发明的对象还有应用一种按本发明的Y.Lipolytica菌种生产柠檬酸。
通过下述实施例对本发明作进一步阐述。
在这些实例中应用了下面的酵母菌种和载体用于Y.Lipolytica转化的野生型一和实验室菌种·H222(MATA)野生型菌种(Mcucerlerger et al.2001，J Bacteriol1835102-5109)。
·H222-S4(MATA ura3-302)由于酒酵母的SUC2-基因插入，通过来自质粒p1NA302的具有4.3kb Sa/1的集成转化破坏URA-3基因制成H222。(auerlerger et al.2001，J Bacteriol 1835102-5109)。该菌种含有如同222，无自由的Zeta要素或无完整的Ylt 1(Juretzek et al.2001，Yeast 1897-113)。
·E129L1(MATAlys 11-23ura 3-302xpr 2-322)由实验室菌种E129(MATA 1ys 1r23 leu2-270ura3-302xpr 2-322)与质粒PINAbz的亮氨酸的营养缺陷型的互补作用制备的。(Barth and Gaillarohin 1996，Yarrowia lipolytica.1wi Nowconventional Yeasts in Biotech nology，wollk，ed，springer-verlag，Berlin Heidellerg New York，pp313-388).
在实施例中所用的菌种来自于Dresden技术大学的微生物系(研究所)的菌种收集室。
实施例11CL1-基因多重整合于Yarrowia lipolytica中Y.Lipolytica多重拷贝转化的集成的载体为了将1CL1-基因多重整合在酵母基因组中，设计了在质粒p641p和p671p的基础上的多重拷贝载体p641CL1和p671CL1(
图1SEQID NO.3和4)在Y.Lipolytica中的1CL1-启动子的监控条件下蛋白质进行异源性表达(Juretzek et al.2001，Yeast 1897-113)。所用的原料载体p641CL1和p671CL1包含来自Y.Lipolytica的1CL1-启动子片段，作为多重拷贝的选择标记物系用Y.Lipolytica的URA3-基因的ura 3d4-等位基因。该标记物序列使得在URA3-基因(ura)中带有缺陷的Y.Lipolytica菌种有机会多重拷贝转化，作为同源性转化平台载体拥有来自Y.Lipolytica(p671p)被称为zeta的反转座子Ylt1的长末端重复(LTR)序列或rDNA序列(p641p)与rDNA相反zeta不是在所有的Y.Lipolytica菌种中出现。这样，载体p671p或p671CL1对zeta自由菌种的转化，其转化效率要小得多。
往载体p641p或p671p中添加1CL1-结构基因的2，3Kb BamH1片段，这样获得的载体p641CL1和p671CL1(图1)含有完全的1CL1-基因作为表达盒带(按seq ID NO.2)。
1CL1-基因多重整合于Yarrowia lipolytica中为了扩展整合载体，采用DH5αC的大肠杆菌菌种，为此将该大肠杆菌细胞在37℃时于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB-培养基中进行培养。载体DNA的分离是按Samlrook等人的质粒制备方法实现的(1989，Molecular cloningA Laloratory Manual.Cold spring lfartorlaloratory Press，New York).
载体(图1)是应用按Barth和Gaillardin改进的醋酸锂方法(Barthand Gaillardin 1996，Yarrowia lipolytica inNoncon-ventioral Yeasts inBiotechnology，wollk，ed，Spninger-verlag，Berlin Heidoellerg New York，pp313-388)用Sacll(p641CL1)或Notl(p671CL1)线型化后集成转化为受体菌种H222S4和E129L1，为转化须各加2-5μg质粒-DNA，由于载体的多重拷贝整合带有URACIL-缺陷裣的转化株是在葡萄糖作为C-源的最小培养基M的琼脂板上经过28℃3天至10天的培养选择的(按Reader改良的Mauerslerger et al.1996，candida waltosa.Innonconventional Yeasts in Biotechnology，woll k，ed，Springer-Verlag，Berlin Heidellerg New York，pp411-580)。
含有rDNA载体p641CL1的转化株(TF)是用两种原料菌种H222-S4和E129L1以30至70TF/μgDNA的频率获得的，zeta自由菌种H222-S4可以用zeta载体p671CL1只能以约0.5-1TF/μgDNA的较低效率转化，相反拥有许多zeta拷贝的菌种E129L1可用载体p671CL1以30TF/μgDNA的效率进行转化，与此相对照含有单一拷贝质粒p651CL1和p661CL1的集成转化(含有ura 3d1一等位基因代替ura 3d4作为选择标记物，而在其它构成方面如同p64或p67型的质粒；参见Juertzek et al.2001，Yeast 1897-113)效率明显要高，可达到1600至2400TF/μgDNA，但即便在这种情况下含有zeta质粒p671CL1的H-222-S4菌种的转化效率仍明显降到30TF/μgDNA。
H222-S4难分离p671CL1转化株的制取是有意义的，因为以往的结果表明，含有p67型质粒的转化株通过在不同位置的连续整合和/或多重整合比p64型质粒的转化株往往具有较大的稳定性，因为后者是通过整合到具有较大柔性为特征的核糖体DNA(rDNA)区而形成的(Juretzek et al.2001，Yeast 1897-113)，因此含有p671CL1的H222-S4的多重拷贝转化株与H222-S4(p641CL1)型的转化株是可以比拟的。
实施例21CL1-多重拷贝转化株的表征Southern-印迹法1CL1-基因多重整合在挑选的转化株中的验证可借助Southern-杂交法完成，为此采用的受体菌种和挑选出的转化株的基因组的DNA是应用Hoffmann和winston方法(1987，Gene 57267-272)经机械细胞粉碎之后制备的。这种特殊的制备和检测是借助美国生命科学公司的“Gene lmages random prime lalelling and detectlin system”完成的。
为确定1CL1-基因的拷贝数(图2)将基因组的DNA全部用限制酶NC01裂解，制备物经二以胶电泳拆分和继而经膜印迹之后，应用1CL1-结构基因的2.3kb Bam H1片段作为杂交检测探头，在两个分析的原料菌种中检出1CL1-基因的基因组拷贝的3个特殊带(在图2的a、d、e带)即约在4.500、约1.300和1.233bp。在试验的H222-S5(p641CL1)型的转化株T1还出现了2.9kb和1.9kb的带(在图2的b和c带)，它们是由多重整合的载体产生的，在1.233bp处的带(图2中e带，1CL1的NC01片段)通过经整合载体的等效片段进一步加强。经Southern-杂交化得到的X-光片，扫描出拷贝数的估值，并且用Phosphoimager STORM的图像量子软件(Amersham PharmaciaBiotech)进行加工，该程序与图片中不同强度的带对比和将它们换算成比例关系，从原料菌种H222-S4和转化株的带强度的对比数值可以作出附加于1CL1拷贝的H2220-S4(p641CL1)T1拷贝数估计为15至25。
在另一分析(图3)中整合载体的拷贝数也可通过查证在转化载体中作为标记物采用的ura3d4-等位基因确定，将带有Sa/1基因组的DNA完全限制后由Y.Lipolytica URA-基因的1.7kb片段作为用于southern印迹的检测探头，原料菌种H-222S4在该条件下显示出4.3kb的特殊带(在图3的a带)，该带是由URA3-基因大为缺失的保留基因组片段产生的(在H-222的URA3-基因的基因破坏是由于通过由Pina302质粒中的-4.3kg sa/l片段的集成转化作用，而使URA3-ORF缺失和插入酒酵母的Suc2-基因引起的)。试验的H-222-S4(p641CL1)转化株T1，T9和T11还在2.8kb处出现了一很强的特异带(图3中的b带)，它是由多重整合载体的URA3d4-等位基因产生的，通过转化株H-222-S4(p641CL1)中特异的URA3d4b带(图3)与原料菌种(1个拷贝)的URA3-302的等位基因(a带)带相比，其强度增强；这说明了拷贝数的增多。从带的强度比较(图3的a带与b带)可估计试验的p641CL1的转化株在酵母基因组中集成质粒的拷贝数约为10至24，这与对1CL1-拷贝描述的结果相当符合。
原料菌种和转化株的异柠檬酸裂解酶活性的比较原料菌种H-222-S4和挑选的1CL1-多重拷贝转化株的异柠檬酸裂解酶的比活性是通过不同碳源的培养确定的。
为此先将菌种在-100ml的振荡并中，加入25ml含有2％葡萄糖作为C-源的酵母一最小培养基M以及必需的添加物(0.3μg/ml硫胺素盐酸盐对所有的培养物，40mg/l尿嘧啶对H222-S4)在水平振荡器上于28℃以230rpm(转/分)的速度培养(第1步预培养)，用2.5mol/lNaOH调节pH值到5.5至6之后，将20ml的第1步预培养物转加到含有100ml同样营养培养基的500ml的锥形烧瓶中(第2步预培养)。第2步预培养在上述的条件下经15至24小时培育和为使之培养物接种在调节pH后，加到含有100ml酵母最小培养基M和必需的添加物(硫胺素、尿嘧啶)以及不同C-源(2％葡萄糖，1％乙醇，5％向日葵籽油或5％十六碳烷烃)500ml的锥形瓶中，接种是以达到2至3*107细胞/ml的接种浓度结束，培养过程如同预培养所述进行。
在经过所选定的培育时间之后获得了5至10ml酵母悬浮液和在4℃以3000rpm速度离心分离5分钟粒状物用冰冷却的溶解缓冲剂(100mM Tris-Hle，5mM Mgcl2pH7.0)洗涤，尔后，在1ml的该缓冲剂中再成为悬浮液，经悬浮的细胞随后通过在有玻璃珠(0.45-0.5mm)的试管中强有力地涡旋(1分钟3次，其间至少在冰中培养2分钟)，使其分解，在4℃至3000rpm的离心分离，5分钟后得到不含细胞的萃取液，用于测定异柠檬酸裂解酶活性及蛋白质浓度。异柠檬酸裂解酶活性的测定是按Dixon和Kornlerg(1959，Biochem.J 723)用光度分析法实施的，其原理是在30℃时经3-5分钟的时间在324nm处由苯肼和乙醛酸生成苯腙，为计算出比异柠檬酸裂解酶活性可根据Lowry等人(1951.J Biol.Chem.193265-275)的方法测定该无细胞萃取液的蛋白质浓度。
在采用葡萄糖和乙醇作为C-源(图4)培养H222-S4和转化株H222-S4(p641CL1)T1时，经过9小时对两作用物进行培育，转化菌种的比1CL活性与原料菌种相比提高了15至14倍。在优选的试验条件下经过约9小时后，所有经试验的菌种都出现最大的比1CL活性，在此，最大活性之前和之后测定证明转化株与原料菌种相比，其比1CL活性相对增大很多，对两个以乙醇为C1源的其它多重拷贝H222-S4(p641CL1)型转化株的试验证明上述的发现，经12小时培养得出原料菌种H222-S4的比1CL活性为221m11/mg蛋白质；反之，转化株H222-S4(p641CL1)T9和T18则具有约20倍的较高比1CL活性，达到4264或4790m11/mg蛋白质。
转化株H222-S4(p641CL1)T1与原料菌种相比，其1CL活性的提高也在生产柠檬酸时添加疏水作用物葵花籽油和十六碳烷烃情况下得到证实(图5)，为此，加入酵母最小培养基M采用降低铵氮含量1g/l(NH4)2SO4，这样经过约3天的培养，由于在缺失氮的条件下，实现了培育物的生长限制和旅发柠檬酸和异柠檬酸的生产。在生长和生产周期中，由比1CL活性的测定表明，发现在整个培养过程中转化株H222-S4(p641CL1)T1的比1CL-1活性与原料菌种相比较增大了约20倍。
通过测定比发酵活性验证的1CL过表达度，这是由于1CL-基因多次整合在酵母基因组中所致，在无细胞萃取液按Laemmil(1970Neture 227680-685)的方法的聚丙烯酰胺二以胶电泳(SDS-PAGE)中显得更为清楚(图6)，该萃取液来自原料菌种H222-S4和转化株H222-S4(p641CL1)T1由乙醇培养的细胞。在约60kDa区域(1CL分子量)转化株与原料菌种比较，用Coomassie-染色法可观察到在SDS-PAGE中的蛋白质带有明显增大。
实施例3用原料菌种H222，H222-S4和挑选的1CL1-多重拷贝转化株的林檬酸生产。
培养用于柠檬酸生产的预培养物培养物在一有100ml YPD的500ml振荡瓶中经24h在28℃用230rpm的水平振荡器进行培育，尔后，在消毒条件下以500rpm的速度离心分离5分钟，而粒状物在无氮添加的酵母最小培养基M中2次洗涤，细胞粒随后加到5ml无氮添加的最小培养基M中，用于主体培养物的接种。
生产柠檬酸的主体培养物用于柠檬酸生产的培养是在含有各100ml酵母-最小培养基M的-500ml的锥形瓶中实施的，M的硫酸铵含量降低到1g.l，根据试验的目的各加入3～10％的葡萄糖、葵花籽油、陈化脂肪(植物性脂肪混合物)或十六碳烷烃，葵花籽油无需先前的作用物准备阶段，相反，陈化脂肪是以水乳液(20％陈化脂肪用1％的非离子活性剂Tween 80在水中借助超声波乳化)形式加入，此外，所有培养物都加0.3μg/ml的硫胺素盐酸盐和在H222-S4时再加40mg/l的尿嘧啶，培养经接种后(接种子滴定率0.5至20D-光密度为60mm)是在一水平振荡器上于28℃以230rpm经5至12天的时间，在这过程中借助2.5mol/l，5mol/l或10mol/l的NaOH将pH均衡地调到6.0。
在培养基中铵氮含量的分析是用Dr.Lange GmbH公司(“Dusseldorf”)生产的酶试仪Teskit实施的。柠檬酸和异柠檬酸浓度分析是利用R-Biopharm公司(Darmstaolt)的酶试仪(kitNr.0139076或04144331或借助Dionex公司(美国的Sunnyvale)离子色谱系统DX-320进行的(分离柱lon pac As 15，2mm直径，导电探测器CD25a自动采样AS40)。
柠檬酸和异柠檬酸的生成在选择的培养条件下经过3-4天时间后，由于在C-源过量的同时氮的缺乏，使酵母培养物生长达到极限，从而诱发生产柠檬酸和异柠檬酸，在图7中以野生型H222在加入葵花籽油作为C-源的情况下，用图形描述了在振荡瓶中产生氮限制的所有生产CS/1CS试验所用的培养周期。在葵花籽油H222的振荡培养物的选择条件下得到的产物生成率在生物质量浓度(酵母干物料)为13至14g/l时，柠檬酸在190至250mg/l*h之间(全酸CS+1CS为340-390mg/l*h)。从图7中可看出，通过长培养周期(直至20天)和作用物为8～10％葵花籽油时，CS/1CS产物生成可提高到100-150g/l(总酸含量)。
应用这些培养条件试验了在不同C-源中原料菌种H222和H222-S4以及挑选的1CL1-多重拷贝的H222-S4(p641CL1)和H222-S4(p671CL1)型的转化株的CS/1CS产物比(图8表1)。用葵花籽油的H222-S4经15至18天的培养用8-10％的葵花籽油作C-源获得的总酸含量CS+1CS约为80-85g/l；CS/1CS比平均为60∶40，在相同条件下试验转化株H222-S4(p641CL1)T8，T9，T11，T12，T16，T17和T18，其总酸量为80至100g/l时具有明显有利的产品分布(图8)CS/1CS为94∶6至96∶4。用挑选的H222-S4(p671CL1)型的转化株达的相类似的结果。1CL1-多重拷贝转化株对产物比明显移向有利于柠檬酸的结论，在用葡萄糖、陈化脂肪(植物性脂肪混合物)和十六碳烷烃培养时得到了证实(表1)。
表1Y.Lipolytica H222，H222-S4(ura3-302)以及1CL1-多重拷贝的转化株H222-S4(p641CL1)和H222-S4(p671CL1)在不同的C-源中生产CS/1CS的产物比
在用葵花籽油试验时将酵母细胞加到含有100或200ml的有1g/l(NH4)2SO4和5-6％C-源的最小培养基M的500ml振荡并中经5至12天或直至18天培养，在较长时间培养过程中当作用物虚弱时要计量补加C-源(总共8-10％作用物)，经5-7天短时间的培养期后即获得的用1)标记的数据借助下述的图示对实施例作进一步阐述图1多重拷贝转化作用载体p641CL1和p671CL1的构成。
描绘了所加入的多重拷贝带有rDNA序列(p641CL1)的载体，它通过集成转化的1CL1-基因提高了拷贝数，还描绘了作为同源性转化作用序列的zeta序列(p671CL1)，这些载体包含来自带启动子(p1CL1)，内含子(1CL1)、1CL1(1CL1DRF)空匠读码和终端子(1CLT)的Y.Lipolytica的1CL1-基因作为功能性的表达盒带，以及包含Y.Lipolytica URA3-基因的ura3d4等位基因作为多重拷贝选择标记物，载体在用Sac11(P641CL1)或Not(p671CL1)线型化之后集成转化到Y.Lipolytica的基因组中。
图2 1CL1-基因拷贝数增大的证明借助来自Y.Lipolytica 1CL1-基因的2.3kb BamH1片段，通过限制酶Ncol和特异带的检测，描绘了基因组的DNA在完全消化后的Southern-印迹。
绘制1原料菌种H222-S4；2原料菌种E129L1；3多重拷贝转化株H2222-S4(p641CL1)T1；MW分子量标准，检测带a，d在约4500和1300bp处的基因组1CL1-片段；e来自在1233bp的载体或基因组的1CL1-片段；b，c来自在1.9kb和2.9kb处的载体p641CL1的含1CL1的片段。
图3ura 3d4等位基因的拷贝数增大的证明借助来自Y.Lipolytica ura 3d4-等位基因的1.7kb sal1片段，通过限制酶Sal1和特异带的检测描绘了基因组DNA完全消化后的Southern-印迹。
绘制
1.原料菌种H222-S4；2-4；多重拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T1，T9和T11；MW分子量标准。
检测带a具有在4.3kb的ura3-302的基因组片段b来自在2.8kb的载体p641CL1的含ura3d4的片段图4以葡萄糖和乙醇为C-源时，由于培养的1CL-基因的多重拷贝整合，增大比1CL-活性的证明绘图表示了原料H222-S4和多重拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T1的培养，以葡萄糖或乙醇为C-源时，经过27小时的培养时间比1CL活性的变化，基于通过葡萄糖对1CL的阻遇可见到在该作用物上1CL-活性显著低于乙醇时的活性，它与该转录调节作用和其它代谢调节机制无关，始终可以验证在相似的培养条件下，从6小时起转化株H222-S4(p641CL1)T1的比1CL-活性比原料菌种至少高出10至20倍。
图5以葵花籽油和十六碳烷烃为C-源时，由于培养的1CL1-基因的多重拷贝增大比1CL-活性的证明绘图表明了原料菌种H222-S4和多重拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T，在葵花籽油或十六碳烷烃中经16-、40-和162小时的培养后的比1CL-活性，在选择的培养条件下经过40至50小时后诱发了柠檬酸和异柠檬酸的生产(生产阶段)，验证了在整个培养基(生长和生产阶段)转化株H222-S4(p641CL1)T1的1CL-活性比原料菌种高20倍。
图6借助SDS-PAGE证明在1CL1-多重拷贝转化株中的异柠檬酸裂解酶的过表达度描绘了在以乙醇为C-源时经过3、6、9和12小时培养在SDS-PAGE中的无细胞蛋白质萃取液的电泳拆分(比较图4)，蛋白质的拆分(每个样品为20μg蛋白质的图示)是在8％的聚丙烯酰胺二以胶中在20至50mA时实施的。与原料菌种H222-S4比较，证明试验的1CL1-多拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T1经过整个培养期在约60kDa(1CL的分子量)有明显的强蛋白质带。
图7以H222在葵花籽油中为实例，在氮限制条件下用Y.Lipolytica生产柠檬酸的培养变化过程绘图表明在振荡瓶试验中，在含有减少硫酸铵含量到1g/l(生产培养基)和5％葵花籽油作为C-源的改性酵母-最少培养基M中生产柠檬酸时Y.Lipolytica培养的变化过程，在氮源虚弱和培养物生长限制开始后经约60至70小时培养，开始生产柠檬酸和异柠檬酸，在该条件下用葵花籽油的H222达到产物生成速率在生物质量浓度(酵母干物料)为13至14g/时柠檬酸为190至250mg/l*h(CS和1CS总酸为340至390mg/l*h)。
图8由于用葵花籽油培养时1CL1-基因多重拷贝整合移动CS/1CS产物比的证明绘图表明用8至10％的葵花籽油为C-源，经18天培养，原料菌种H222-S4和转化株H222-S4(p641CL1)T8、T9、T11、T12、T16、T17和T18的CS/1CS产物比，原料菌种在全部酸含量(CS和1CS)为80g/l至85g/l小时的CS/1CS之比为60∶40(57∶43至65∶35)。在同样条件下试验的转化株在总酸含量为80至100g/l时，显示出非常有利的产物分布为94∶6至96∶4。
在说明书和图中应用了下述的缩写bp碱基对C-Quelle 碳源CS柠檬酸DNA 脱氧核糖核酸
DSMZ 德国微生物和细胞培养物收藏公司E.coli大肠杆菌ICL 异柠檬酸裂解酶ICS 异柠檬酸kb千克-碱基对KDa 千克-道尔顿(质量单位)MW分子量标准OD光密度PAGE 聚丙烯酰胺二以胶电泳LTR 长末端重复rDNA 核糖体DNArpm 每分钟转数SDS 十二烷基硫酸钠TF转化株URA-3 对尿嘧啶-生物合成有催化作用的乳清酸核苷-5’-磷酸盐-脱羧酸酶的第3步Y.lipolytica 欧蓍草脂解酶Zeta 来自Y.Lipolytica的反转座子的LTR
酵母菌种Y.Lipolytica H222-S4(p641CL1)T1已于2002.7.16依照布达佩斯协定寄存在DSMZ，德国微生物和细胞培养物收藏公司Mascheroder Weg 1bD-38124 Brauschweig其寄存号为DSM15105经律师担保，与申请附在一起的软盘中的4顺序(序列)与申请的顺序相一致。
Dresden，den 2003.7.16H.Uhlemann专利律师序列表序列记录序列记录1-顺序排列表1-SEQ ID No 1<110>Dresden技术大学<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法<130>017P22PCT<150>DE 102 33 600.8<151>2002-07-16<160>4<170>专利在3.1分类<210>1<211>540<212>PRT<213>欧蓍苯脂解酶<220>
<221>蛋白质<222>(1)..(540)<223>
<400>1Met Ser Glu Gln Gln Arg Phe Asn Asn Glu Val Glu Glu Ile Lys Lys1 5 10 15Trp Trp Ser Ser Pro Arg Trp Lys His Thr Lys Arg Val Tyr Ser Pro20 25 30Glu Asp Ile Ala Ser Arg Arg Gly Thr Ile Lys Val Pro Gln Ala Ser35 40 45Ser Gln Gln Ala Asp Lys Leu Phe Lys Leu Leu Gln Glu His Glu Lys50 55 60Asn His Thr Ala Ser Phe Thr Tyr Gly Ala Leu Asp Pro Val Gln Val65 70 75 80Thr Gln Met Ala Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln85 90 95Ser Ser Ser Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Ser Pro Asp Leu Ala100 105 110
Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Trp Phe115 120 125Ala Gln Leu Phe His Asp Arg Lys Gln Asn Glu Glu Arg Leu Ser Leu130 135 140Pro Glu Ser Glu Arg Ser Lys Leu Pro Ala Pro Val Asp Tyr Leu Arg145 150 155 160Pro Ile Ile Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Leu Thr Ala Val165 170 175Val Lys Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile His180 185 190Ile Glu Asp Gln Ala Pro Gly Thr Lys Lys Cys Gly His Met Ala Gly195 200 205Lys Val Leu Val Pro Ile Gln Glu His Ile Asn Arg Leu Ile Ala Ile210 215 220Arg Ala Ser Ala Asp Ile Phe Gly Ser Asp Leu Leu Ala Ile Ala Arg225 230 235 240Thr Asp Ser Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr Ser Ser Ile Asp Tyr Arg245 250 255Asp His Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Thr Asn Lys Asp Ala Gly His Leu260 265 270Val Asp Val Met Val Ala Ala Glu Leu Glu Gly Lys Gln Gly Ala Ala275 280 285Leu Gln Ala Val Glu Asp Glu Trp Asn Arg Lys Ala Gly Val Lys Leu290 295 300Phe His Glu Ala Phe Ala Asp Glu Val Asn Ala Gly Ser Tyr Ser Asn305 310 315 320Lys Ala Glu Leu Ile Ala Glu Phe Asn Lys Lys Val Thr Pro Leu Ser325 330 335
Asn Thr Pro Ala Leu Glu Ala Arg Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Gly340 345 350Lys Asp Ile Tyr Phe Asn Trp Glu Ala Ala Arg Val Arg Glu Gly Tyr355 360 365Tyr Arg Tyr Gln Gly Gly Thr Gln Cys Ala Val Asn Arg Gly Ile Ala370 375 380Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Ile Trp Met Glu Ser Lys Leu Pro Asp385 390 395 400Tyr Ala Gln Ala Lys Glu Phe Ala Glu Gly Val Lys Asn Ala Val Pro405 410 415His Gln Trp Leu Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn Trp Thr Thr420 425 430Ala Met Ser Pro Glu Asp Gln Glu Thr Tyr Ile Ser Arg Leu Ala Lys435 440 445Leu Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu His Thr Asn450 455 460Ala Leu Ile Ser Asp Lys Phe Ala Lys Ala Tyr Ser Glu Arg Gly Met465 470 475 480Lys Ala Tyr Gly Gly Glu Ile Gln Gln Pro Glu Ile Asp Gln Gly Cys485 490 495Glu Val Val Lys His Gln Lys Trp Ser Gly Ala Glu Tyr Ile Asp Gly500 505 510Ile Leu Arg Met Val Thr Gly Gly Ile Thr Ser Thr Ala Ala Met Gly515 520 525Ala Gly Val Thr Glu Asp Gln Phe Lys Ser Lys Leu530 535 540
序列记录2-顺序排列表2-SEQ ID No2<110>Dresden技术大学<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法<130>017P22PCT<150>DE 102 33 600.8<151>2002-07-16<160>4<170>专利在3.1分类<210>2<211>4447<212>DNA<213>Yarrowia lipolytica<220>
<221>启动子<222>(1)..(2178)<223>pICL1D-ICL1的启动子<220>
<221>exon<222>(2179)..(2179)<223>ICL1 exon 1-仅有1核苷酸A<220>
<221>intron<222>(2180)..(2537)<223>ICL1i-在启动ATG中ICLi-的内含子-在恰当剪接之后AUG形成aftercorrect splicing<220>
<221>外显子<222>(2538)..(4159)<223>ICL1外显子2-除在剪接之后形成启动AUG外包括全部ORF<220>
<221>终端子<222>(4160)..(4447)<223>ICL1t-ICL1终端子在4425位对BamHI定点起动用4425<400>2ctcgagatgg acatacttgt atcgtcgccc tatgtactcg taatgcaagg gattccacca60gacattcctg ccacaatggc agggtccgtg aaaacgccga ccactgacaa gatgccttgt120
tcgtcttgac cacggactaa ctggcacaag cgagattaac gtcgtcggag actattcggc180acacaaggcc agactgtgtg gcacttctca tctctcgtac cgacctctgt caacagtcta240accgattttt aatgctcgat attaccaatg tttctttgtg tcttttaacc agaacaaccg300agcagacccg aacaggtgcc gaacatgtga atagcagtgc tggagctcca tcagtaagca360taataacaca gctgcccagc gacctccgcc cagcgacctc tacccagcga cctcgggcac420gtgactatct gctccgttcc tcgcggtcgc tggcacgctg gcaaatctgg ggtctccaca480ttttcccccg gatgtcttgt tccgtagcgt gactcatgcg gaatgacgtg aatgtaggag540gggctgagaa tggggtccgc agttgataac cggggattat tggccggcgg cattgtcaac600caggtgtttt cactggcgtt cctagaataa aaagaaatag gcgaccccct tgagcgagtt660cagcggcggc aaaatgcctg ttgaaacacc tactttgttc ccagcacccc catcggataa720atggagacgc atacatcggc tatgtttgga tacgatcttg ggccggtgtg cgtggtgtgc780gcggtcattt tgttctcctt ttggacccac gcaaggttca accgaacccc ggattcgact840gtgaaaacga acaacggttt agtgcggttt aaaaagtatc aagttcaggg agggaagcga900tccaggccaa cagctatgac caagaaacca agcgaccaag acatctgaag accaacaaaa960ccaataatcg ctcaccagat gctccccaaa cactaacggc agactctact ccagatttgc1020acttgtagga ccccgatatc gggttgcaga tcatggtgtc ataatctctg aacgtgaagg1080ttaggtggag gggatgtttt ggccagaaat gagcggtttt gtgagcttgg agacggtaaa1140tcggatacgc ccagcgtgag gattccatag accccctcct tttgccagta tatccaccgc1200aacacccacc atgagcgaca tctgataccg tgccgcgacc actaccccaa ataagctcca1260
actaatatgc cgaggcaggt gggaaactat gcactccagt cgacgctgta gaagcacatg1320gaaggtgcgg aggcggtggc aacgaggggc atgagccatc aacgagtaac cacagacaag1380gcaagggggg aaacgcgacc ggaatctctc gcggtcacgt gacccgcccg ggttccactc1440gtccatgttg tgtctctggt gtcttcggcc gactcgcatt ggttaaactt ccaccaccgc1500aatcacgtcc cactggccaa actttttctg ctttctctga ctttttctgg ccaaaaggca1560acgtcggaaa gggtcgggag gattcggaac cgacgaaaat cggccggctc cagcgggggt1620agttcggcag tcctggtggg agctctaggg gagctgtggt ctgtgtaggg cgcgggtccg1680ggtttgttgg gtgtcaaatc acgtgttttt gcccccccgc tgagccggac tccgacaacc1740gtgtctccaa cggcctgact aagctgctcc cagcactctg ccgtagcgtt ggtctgtcct1800gtcgcactct gttcaaagac agaagaaaga aaaagctaac ctccacgtca gagacaatgg1860tagaaggctt gttccttgca accgaggaga gtgagtgttc tcggcacgag catcatgggc1920gatctggagg gtatttttga ggggaaaaaa cgggatcagg acaaacagag gccacagacc1980gggaatctgg gccccaaaac ggccttttcc cgtcgcaaaa ccggtctaca tacacccctt2040cggcccgcca caggccggtg tgaaaaaccc taaagcttgc ttcaaaccag acggacgcac2100agcaagacac atcatgaaga gtcacctgca gtatatatag atctggggat ccccagtaga2160ctgaccaagc atacaaaa a gtgagtatcc aacagcgaca cgtgagatgg cagagacaca2219gagacgtgtc tacatggttg gacaagtctc cacattcgcc agagacgtat ccacatacaa2279acacaatctc acagctgatc tgctcctgtg acagcacagt acatgttagt ggatgaggtg2339ttgtgtagtg ggttaaatgg gtggactgat tcagtggcat cggtggcgac accctctact2399cttcatgtcg tcacctaccg ttcggaatcc caattatctg atgaactaaa cgatttctgg2459
ccaaaacaca attttgccaa agaagtcggt ctcaccaatg caagtgtcac atcaaacatc2519tgtcccgtac taacccag tg tcc gaa cag cag cga ttc aac aac gaa gtc2569Met Ser Glu Gln Gln Arg Phe Asn Asn Glu Val5 10gag gag atc aag aag tgg tgg tct tcc ccc cga tgg aag cac acc aag2617Glu Glu Ile Lys Lys Trp Trp Ser Ser Pro Arg Trp Lys His Thr Lys15 20 25cgt gtc tac tct ccc gag gac att gcc tcc cga cga gga acc atc aag2665Arg Val Tyr Ser Pro Glu Asp Ile Ala Ser Arg Arg Gly Thr Ile Lys30 35 40gtc ccc cag gcc tct tct cag cag gct gac aag ctc ttc aag ctg ctc2713Val Pro Gln Ala Ser Ser Gln Gln Ala Asp Lys Leu Phe Lys Leu Leu45 50 55cag gag cac gag aag aac cac acc gcc tcc ttc acc tac ggt gcc ctc2761Gln Glu His Glu Lys Asn His Thr Ala Ser Phe Thr Tyr Gly Ala Leu60 65 70 75gac ccc gtc cag gtg acc cag atg gcc aag tac ctc gac tcc atc tac2809Asp Pro Val Gln Val Thr Gln Met Ala Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Tyr80 85 90gtt tcc gga tgg cag tct tct tct acc gcc tcc acc tcc aac gag ccc2857Val Ser Gly Trp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro95 100 105tct ccc gat ctg gct gac tac ccc atg gac acc gtc ccc aac aag gtc2905Ser Pro Asp Leu Ala Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val110 115 120gag cac ctg tgg ttt gcc cag ctc ttc cac gac cga aag cag aac gag2953Glu His Leu Trp Phe Ala Gln Leu Phe His Asp Arg Lys Gln Asn Glu125 130 135gag cga ctg tct ctg ccc gag tcc gag cga tcc aag ctc ccc gcc ccc3001Glu Arg Leu Ser Leu Pro Glu Ser Glu Arg Ser Lys Leu Pro Ala Pro140 145 150 155gtc gac tac ctg cga ccc atc att gcc gat gcc gac acc ggt cac gga3049Val Asp Tyr Leu Arg Pro Ile Ile Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly160 165 170
ggt ctc act gcc gtc gtc aag ctc acc aag atg ttc atc gag cga ggt3097Gly Leu Thr Ala Val Val Lys Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly175 180 185gcc gcc ggt atc cac att gag gac cag gct ccc ggt acc aag aag tgc3145Ala Ala Gly Ile His Ile Glu Asp Gln Ala Pro Gly Thr Lys Lys Cys190 195 200ggt cac atg gcc ggt aag gtt ctt gtc cct atc cag gag cac atc aac3193Gly His Met Ala Gly Lys Val Leu Val Pro Ile Gln Glu His Ile Asn205 210 215cga ctg att gcc atc cga gct tct gcc gat atc ttc ggc tct gac ctc3241Arg Leu Ile Ala Ile Arg Ala Ser Ala Asp Ile Phe Gly Ser Asp Leu220 225 230 235ctg gcc att gcc cga acc gat tcc gag gct gct act ctt atc acc tct3289Leu Ala Ile Ala Arg Thr Asp Ser Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr Ser240 245 250tcc atc gac tac cga gac cat tac ttc att gct ggt gcc acc aac aag3337Ser Ile Asp Tyr Arg Asp His Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Thr Asn Lys255 260 265gat gct ggc cac ctc gtc gac gtc atg gtc gcc gcc gag ctc gag ggc3385Asp Ala Gly His Leu Val Asp Val Met Val Ala Ala Glu Leu Glu Gly270 275 280aag cag ggc gcc gcc ctc cag gcc gtt gag gac gag tgg aac cga aag3433Lys Gln Gly Ala Ala Leu Gln Ala Val Glu Asp Glu Trp Asn Arg Lys285 290 295gcc ggt gtc aag ctc ttc cac gag gct ttc gcc gat gag gtc aac gcc3481Ala Gly Val Lys Leu Phe His Glu Ala Phe Ala Asp Glu Val Asn Ala300 305 310 315ggc tct tac tcc aac aag gct gag ctc atc gcc gag ttc aac aag aag3529Gly Ser Tyr Ser Asn Lys Ala Glu Leu Ile Ala Glu Phe Asn Lys Lys320 325 330gtc acc cct ctg tct aac acc ccc gct ctt gag gcc cga gct ctg gct3577Val Thr Pro Leu Ser Asn Thr Pro Ala Leu Glu Ala Arg Ala Leu Ala335 340 345gct cga ctc ctc ggc aag gac atc tac ttc aac tgg gag gct gcc cga3625Ala Arg Leu Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Phe Asn Trp Glu Ala Ala Arg350 355 360
gtc cga gag ggc tac tac cga tac cag gga gga acc cag tgt gcc gtc3673Val Arg Glu Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gln Gly Gly Thr Gln Cys Ala Val365 370 375aac cga ggt att gct tac gct ccc tac gct gac ctc atc tgg atg gag3721Asn Arg Gly Ile Ala Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Ile Trp Met Glu380 385 390 395tcc aag ctg ccc gac tac gct cag gcc aag gag ttc gcc gag ggt gtc3769Ser Lys Leu Pro Asp Tyr Ala Gln Ala Lys Glu Phe Ala Glu Gly Val400 405 410aag aac gcc gtc ccc cac cag tgg ctg gct tac aac ctg tct ccc tct3817Lys Asn Ala Val Pro His Gln Trp Leu Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser415 420 425ttc aac tgg acc acc gcc atg tcg ccc gag gac cag gag acc tac atc3865Phe Asn Trp Thr Thr Ala Met Ser Pro Glu Asp Gln Glu Thr Tyr Ile430 435 440agc cga ctg gcc aag ctc ggc tac gtg tgg cag ttc atc act ctg gcc3913Ser Arg Leu Ala Lys Leu Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala445 450 455ggt ctg cac acc aac gct ctc atc tcc gac aag ttc gcc aag gct tac3961Gly Leu His Thr Asn Ala Leu Ile Ser Asp Lys Phe Ala Lys Ala Tyr460 465 470 475tct gag cga ggc atg aag gct tac ggt ggt gag atc cag cag ccc gag4009Ser Glu Arg Gly Met Lys Ala Tyr Gly Gly Glu Ile Gln Gln Pro Glu480 485 490att gac cag ggt tgt gag gtt gtc aag cac cag aag tgg tcc ggt gct4057Ile Asp Gln Gly Cys Glu Val Val Lys His Gln Lys Trp Ser Gly Ala495 500 505gag tac att gac ggt atc ctg cga atg gtt acc gga ggt atc acc tct4105Glu Tyr Ile Asp Gly Ile Leu Arg Met Val Thr Gly Gly Ile Thr Ser510 515 520acc gcc gcc atg ggt gcc ggt gtc act gag gac cag ttc aag tcc aag4153Thr Ala Ala Met Gly Ala Gly Val Thr Glu Asp Gln Phe Lys Ser Lys525 530 535
ctt taa gcagtttgtt tagcaaaata tatttaacga gtttgataga ggcgctggac4209Leu540tacatcatta ctgaatcacg cgtacatgtc tcagctcaaa ttgtatcacg gtttctttgt4269agcaatggag ggggagagtt gacaaggcat tagagaagag agcgagagga gaagacaagt4329ggatagacga ctgcaatcat atgatctgca caaactgcga tgttttcctg tcagatcatg4389ttcttttgct catagttaag ctatcgtgac tttacggatc cgccgagact cttagtag4447
序列记录3-顺序排列表3-SEQ ID No3<110>Dresden技术大学<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法<130>017P22PCT<150>DE 102 33 600.8<151>2002-07-16<160>4<170>专利在3.1分类<210>3<211>10056<212>DNA<213>Yarrowia lipolytica<220>
<221>p64ICL1<222>(1)..(10056)<223>质粒p64ICL1<220>
<221>ura3d4<222>(10)..(1331)<223>ura3d4多重拷贝选择标靶物，启动子直到6bp缺失URA3 fragment up to SalI site at 1331 bp<220>
<221>URA3-ORF<222>(16)..(870)<223>完整的 URA3 ORF<220>
<221>rDNA<222>(1332)..(2790)<223>rDNA，整合于Y.lipolytica基因组中的目标定点<220>
<221>ampR<222>(3190)..(4050)<223>大肠杆菌中的Amp抵抗基因<220>
<221>ICL1-gene<222>(5288)..(9716)<223>完整的 IcL1 gene<220>
<221>pICL1D<222>(5288)..(7464)<223>ICL1启动子D
<220>
<221>ICL1-外显子<222>(7465)..(7465)<223>ICL1外显子1，仅有1核苷酸(A)<220>
<221>ICL1i<222>(7466)..(7823)<223>在启动ATG中ICL1的内含子-在剪切之后形成AUG<220>
<221>ICL1-外显子2<222>(7824)..(9445)<223>ICL1外显子2<220>
<221>ICL1t<222>(9446)..(9716)<223>在BamHI定点的ICL1终端子<400>3aagcttgata ccaaaatgcc ctcctacgaa gctcgagcta acgtccacaa gtccgcctct60gccgctcgag tgctcaagct cgtggcagcc aagaaaacca acctgtgtgc ttctctggat120gttaccacca ccaaggagct cattgagctt gccgataagg tcggacctta tgtgtgcatg180atcaagaccc atatcgacat cattgacgac ttcacctacg ccggcactgt gctccccctc240aaggaacttg ctcttaagca cggtttcttc ctgttcgagg acagaaagtt cgcagatatt300ggcaacactg tcaagcacca gtaccggtgt caccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc360aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa420actgtctctg aacagaagaa ggaggacgtc tctgactacg agaactccca gtacaaggag480ttcctagtcc cctctcccaa cgagaagctg gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg540tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag tactccaagc agaccattga gcttgcccga600tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag660gactggctta ttctgacccc cggggtgggt cttgacgaca agggagacgc tctcggacag720
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序列记录4-顺序排列表4-SEQ ID No4<110>Dresden技术大学<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法<130>017P22PCT<150>DE 102 33 600.8<151>2002-07-16<160>4<170>专利在3.1分类<210>4<211>9300<212>DNA<213>Yarrowia lipolytica<220>
<221>p67ICL1<222>(1)..(9300)<223>质粒p67ICL1<220>
<221>ura3d4<222>(10)..(1331)<223>多重拷贝选择标记物，启动子<223>ura3d4多重拷贝选择标记物，启动子缺失直到6bp；在1331bp达到Sa1I定点的URA3片段<220>
<221>URA3-ORF<222>(16)..(870)<223>complete URA3 ORF<220>
<221>zeta<222>(1342)..(2038)<223>用HotI定点修改的Ylt1的LTR zeta整合于Y.lipolytica基因组中的目标定点<220>
<221>ampR<222>(2434)..(3294)<223>在大肠杆菌中的Amp抵抗基因<220>
<221>ICL1-gene<222>(4532)..(8955)<223>完整的ICL1 gene<220>
<221>pICL1D<222>(4532)..(6708)<223>ICL1启动子D
<220>
<221>ICL1-外显子<222>(6709)..(6709)<223>ICL1外显子，仅有1核苷酸(A)<220>
<221>ICL1i<222>(6710)..(7067)<223>在启动ATG中的ICL1的内含子-在恰当剪接后形成AUG<220>
<221>ICL1-外显子2<222>(7068)..(8689)<223>ICL1外显子2<220>
<221>ICL1t<222>(8690)..(8960)<223>在8960bp达到BamHI定点的ICL1终端子<400>4aagcttgata ccaaaatgcc ctcctacgaa gctcgagcta acgtccacaa gtccgcctct60gccgctcgag tgctcaagct cgtggcagcc aagaaaacca acctgtgtgc ttctctggat120gttaccacca ccaaggagct cattgagctt gccgataagg tcggacctta tgtgtgcatg180atcaagaccc atatcgacat cattgacgac ttcacctacg ccggcactgt gctccccctc240aaggaacttg ctcttaagca cggtttcttc ctgttcgagg acagaaagtt cgcagatatt300ggcaacactg tcaagcacca gtaccggtgt caccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc360aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa420actgtctctg aacagaagaa ggaggacgtc tctgactacg agaactccca gtacaaggag480ttcctagtcc cctctcccaa cgagaagctg gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg540tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag tactccaagc agaccattga gcttgcccga600tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag660gactggctta ttctgacccc cggggtgggt cttgacgaca agggagacgc tctcggacag720
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权利要求
1.在Y.Lipolytica的酵母细胞中制造柠檬酸的生物技术方法，其步骤为a)酵母细胞的转化，它有一个对多重基因整合的适宜载体，该载体包含一个作为选择标记物作用的基因；b)酵母是在一个碳源和营养缺乏条件下培养的；c)柠檬酸的净化，其特征在于，该载体含有对1CL活性编码基因序列的表达盒带，克隆是在一适当的营养培养基中选择的，它稳定地在其基因组中整合了对1CL活性编码基因顺序的和选择标记物的多个拷贝。
2.按权利要求1的方法，其特征在于，该载体包含有一基因序列的表达盒带，该序列对按SEQ ID NO.1带有1CL活性的蛋白质进行了编码。
3.按权利要求2的方法，其特征在于，该载体含有按SEQ ID NO.2的表达盒带。
4.对1CL活性编码的基因序列进行基因组整合的载体至少有一基因序列，该序列对按SEQ ID NO.1具有1CL活性的蛋白南进行了编码。
5.按权利要求4的载体，其特征在于，它含有一个按SEQ ID NO.2的基因序列。
6.按权利要求5的载体，其特征在于，它含有一个按SEQ ID NO.3的相适应的管段。
7.按权利要求5的载体，其特征在于，它含有一个按SEQ ID NO.4的相适应的管段。
8.Y.Lipolytica经基因变异的菌种将对1CL活性编码的基因序列稳定定地多重拷贝整合在其基因组中。
9.按权利要求8的Y.Lipolitica经基因变异的菌种，将对蛋白质按SEQ ID NO.1编码的基因序列稳定地多重拷贝整合在其基因组中。
10.按权利要求9的Y.Lipolytica经基因变异的菌种将SEQID NO.2的多重拷贝稳定地整合在其基因组中。
11.Y.Lipolytica经基因变异的菌种采用按权利要求4至7之一的载体进行转化。
12.按权利要求11的Y.Lipolitica经基因变异菌种Y.LipolyticaH222-s4(p641CL1)T1寄存在德国Braunschweig市的德国微生物和细胞培养物收藏公司(DSMZ)中，其寄存号为DSM15105。
13.带有一个对1CL活性编码的基因序列的表达盒带如同在权利要求12的菌种中有多重拷贝。
14.带有一个对具有1CL活性的蛋白质编码基因序列的表达盒带，其特征在于，它按SEQ ID NO.1对一蛋白质进行编码。
15.按权利要求14的表达盒带，其特征在于，它含有按SEQID NO.2的基因序列。
16.按SEQ ID NO.1的有1CL活性的蛋白质。
17.按权利要求8至12之一的菌种应用于生物技术柠檬酸生产中。
全文摘要
本发明涉及用一基因变异的酵母YarrowiaLipolytica以生物技术制造柠檬酸的方法，此处将一个对异柠檬酸裂解酶活性编码的基因序列稳定地多重整合在酵母基因组中，本发明的优点在于使不希望生成的副产物异柠檬酸明显减少。
文档编号C12N9/88GK1723286SQ03817060
公开日2006年1月18日 申请日期2003年7月16日 优先权日2002年7月16日
发明者科尔杜拉·克鲁泽, 安德烈·福斯特, 托马斯·尤雷策克, 斯特凡·毛厄斯贝格尔, 格罗尔德·巴尔特 申请人:德累斯顿工业技术大学