一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要将油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2基因和二酰甘油酰基转移酶vfDGAT2构建融合表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘红酵母体内获得高效表达。与未转基因粘红酵母相比，本发明的转基因粘红酵母转化子油脂含量提高2.76倍，亚油酸含量提高25.86%。
【专利说明】一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域。具体的说，本发明涉及一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法。
【背景技术】
[0002]粘红酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres.) Harrison)是一种重要的工业菌株，可以生产微生物油脂和其他活性物质，包括类胡萝卜素、L-苯丙氨酸、过氧化物歧化酶，近年来日益受到营养学家和药理学家的重视。
[0003]目前对于产油粘红酵母基因工程改良的报道不多，特别是以提高亚油酸含量为目的，并且同时提高含油量的基因工程改良还未有报道，而亚油酸是人体的必需氨基酸，因此提高粘红酵母油脂含量特别是亚油酸的含量有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法，以提高粘红酵母油脂及亚油酸的含量。
[0005]本发明的技术方案还在于采用了一种粘红酵母油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法，将油桐油酸脱氢酶基因 vfFAD2基因和二酰甘油酰基转移酶vfDGAT2构建融合表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下:
[0006](I)采用同源序列克隆方法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆，并测序，获得目的基因 vfFAD2，vfDGAT2 ；
[0007](2)利用耦联小肽将目的基因vfFAD2与vfDGAT2耦联；
[0008](3)将vfFAD2-vfDGAT2与表达载体pCAMBIA1301重组，获得重组载体pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2, PCR验证、酶切、测序验证重组载体；
[0009](4)利用农杆菌介导法，重组表达载体pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μ g.mL-1链霉素,200 μ g.mL_l头孢霉素和100 μ g.mL_l卡那霉素的SM I筛选培养基中，培养3-5d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μ g.mL-1头孢霉素，150 μ g.mL-1卡那霉素的SM II平板上划线，培养3_5d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子；
[0010](5)提取基因组DNA、PCR验证获得阳性转化子。
[0011]本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母转化子的筛选方法，首先用60 μ g.mL-1链霉素，200 μ g.mL-1头孢霉素和100 μ g.mL-1卡那霉素的SM I筛选培养基培养3-5d后，再将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μ g.mL-1头孢霉素，150 μ g.mL-1卡那霉素的SM II平板上划线筛选，最后提取基因组DNA，进行PCR验证。[0012]本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母的培养方法，具体步骤如下:将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28°C培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28°C振荡培养24h，然后按1:10的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28°C振荡发酵72h，发酵结束经离心收集菌体；种子培养基:15g.L-1葡萄糖，Ig.L—1 酵母粉,2g.L—1 (NH4)2SO4, 7g.L-1KH2PO4, 2g.L-1Na2HPO4,1.5g.L^1MgSO4,PH5.5 ;发酵培养基:50g.L—1 葡萄糖，Ig.L—1 酵母粉，2.5g.T1(NH4)2SO4Jg.L^1KH2PO4,2g.L-1Na2HPO4, 2g.L-1MgSO4,0.1g.L^1CaCl2j0.07g.L-1FeCl3, PH5.5。[0013]本发明的目的还在于提供了一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生产微生物油脂方面的应用。
[0014]本发明的目的还在于提供了一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生产功能性油脂方面的应用。
[0015]本发明的目的还在于提供了一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在食品方面的应用。
[0016]说明书附图:
[0017]图1.vfFAD2, vfDGAT2 基因的获得；
[0018]图2.重组质粒 pCAMBIA1301-FAD2-2A-DGAT2 的 PCR 验证，I:FAD2 ；2:DGAT2 ；3:FAD2+2A+DGAT2 ；4:空载对照；5:DNA Marker ；
[0019]图3.FAD2/DGAT2转化子的抗生素筛选及PCR验证。a:SM I平板筛选；b:SM II平板筛选；c:使用 FAD2-F/R 引物；d:使用 DGAT2-F/R 引物；M:DNA marker2000 ;1_3:FAD2/DGAT2酵母转化子；4:野生型酵母；
[0020]图4.共表达酵母中FAD2与DGAT2基因的表达分析。a:FAD2基因的表达；d:DGAT2基因的表达；
[0021]图5.FAD2/DGAT2共表达酵母的脂肪酸组成分析。
【具体实施方式】
[0022]实施例1、FAD2-DGAT2重组表达载体的构建
[0023](I)基因的获得
[0024]根据NCBI上已提交的油桐vfFAD2序列(Genbank登录号:AF525534)，利用分子生物学分析软件01igo6.0设计引物:
[0025]VF2a:5’ TATCTTCAGGTTGGGCAACGA3’ ；
[0026]VF2b:5’ CGATTGAACGGCCTACATTAT3’。
[0027]DGAT2-F:5’ -CTTTCGTTCTGATCGTGCTT-3’
[0028]DGAT2-R:5’ -TAGGCTGTGGATTTTGCTTCG-3’
[0029]PCR 反应程序:94°C预变性 3min，94°C变性 45s，60°C退火 45s，72°C延伸 lmin，共35个循环，最后72°C延伸IOmin。1%琼脂糖电泳结果如图1。
[0030]目的片段回收及与pMD18_T simple vector连接:
[0031]将PCR扩增得到的vfFAD2目的片段进行凝胶回收，回收产物与pMD18_T simplevector 连接:
【权利要求】
1.一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，将油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2基因和二酰甘油酰基转移酶vfDGAT2构建融合表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下: (1)粘红酵母进行活化和培养； (2)利用同源克隆法，根据GenBank上已知序列，以油桐基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆，并测序，获得目的基因vfFAD2，vfDGAT2 ； (3)利用耦联小肽，将vfFAD2与vfDGAT2耦联，再与表达载体pCAMBIA1301重组，获得重组载体pCAMBIA1301-vfFAD2- vfDGAT2，酶切、测序验证重组载体； (4)利用农杆菌介导法，重组载体pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL-l头孢霉素和100 μ g*mL-l卡那霉素的SM I筛选培养基中，培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300μ g*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线，培养3_5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子；提取基因组DNA、PCR验证获得阳性转化子； (5)气相色谱法检测结果表明，与未转基因粘红酵母相比，转基因粘红酵母转化子油脂含量提高2.76倍，亚油酸含量提高25.86%。
2.根据权利要求1所述的粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中扩增引物为:
FAD2-Y:5’ -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’ ；`
FAD2-R:5， -GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3，
DGA T2-V: 5，-CTTTCGTTCTGATCGTGCTT-3，
DGA T2-R: 5，-TAGGCTGTGGATTTTGCTTCG-3， PCR反应程序为:94 °C预变性5 min ；94 °C变性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35个循环；72 °C延伸10 min ;PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求1所述的粘红酵母生产高亚油酸含量的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(4) 60 μ g*mL-l链霉素，200 μ g*mL_l头孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I筛选培养基中培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300μ g*mL-l头孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上划线筛选初步获得阳性转化子，提取基因组DNA，进行PCR验证进一步鉴定阳性转化子。
4.一种粘红酵母的培养方法，其特征在于，将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28°C培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28°C振荡培养24h，然后按1:10的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28°C振荡发酵72 h，发酵结束经离心收集菌体；种子培养基:15 g.!/1葡萄糖，I g.!/1酵母粉，2g*L^ (NH4)2SO4, 7 g.171 KH2PO4, 2 g*L^1Na2HPO4,1.5 g.171 MgSO4, PH 5.5 ;发酵培养基:50g.L—1 葡萄糖，1 8吨_1酵母粉,2.5 g.L—1 (NH4)2SO4, 7 g.L—1 KH2PO4, 2 g.L—1 Na2HPO4, 2 g.L—1MgSO4,0.1 g.1^CaCly0.07 g.L-1FeCl3，PH 5.5。
5.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产微生物油脂方面的应用。
6.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生产功能性油脂方面的应用。
7.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的 应用。
【文档编号】C12N15/81GK103509817SQ201310421519
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】汪阳东, 陈益存 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所