转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学技术和生物工程
技术领域：
，具体地说，是一种转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用。
背景技术：
：自80年代起我国开始牙鲆的商品养殖以来，因其市场价-值高、经济效益好，其在水产养殖中比重越来越大。到2006年我国牙鲜的养殖产量已超过82560吨，产值突破60亿元，其中，牙鲆和大菱鲆是目前我国鲽科水产养殖中最重要的种类，近年来又引进了大西洋夏鲆、漠斑牙鲆、塞内加尔鳎等，牙鲆的人工养殖规3莫日益扩大。j旦是在牙鲆4交长的养殖过程中，由于温度、水质等原因的影响，容易导致其生病死亡，造成经济损失。因此通过现代化生物技术手段改善鲆鲽鱼的生长速度，降低养殖成本及风险，成为业内人士共同关注的焦点。鱼类生长激素(GH)是由鱼的脑垂体前叶细胞合成分泌的一种单链多肽类激素。在硬骨鱼中，生长激素的促生长作用主要是作为新陈代谢的调控元件，促进脂肪更多地分解作为能源，使吸收的氨基酸更多地用于生长；提高饵料中蛋白质的转化效率，促进蛋白质的合成；对糖类代谢的影响表现为可促进肝糖原的消耗，增强对碳水化合物的利用能力。生长激素在鱼体内的多层次上的调节功能，可以有效地促进鱼体的生长、发育。正常鱼体内生长激素含量甚微，每升鱼血仅含20iug，从鱼体中提取是不可能的。为满足海水鱼养殖业的需要，运用基因工程4支术，利用微生物发酵生产成为大量获得廉价鱼生长激素的一条有效途径。许多研究证实，基因工程方法获得的生长激素具有代偿内源生长激素的功能，肌肉注射外源生长激素，可促进鱼体生长；辨料中添加的生长激素可通过鱼体消化道后肠上皮细胞的胞饮作用吸收，提高鱼体的生长速度，而且在鱼体内半衰期一般在6h以内，在12—24h之后，基本检测不到。而且由于大多凄t海水鱼类的生长激素所以其应用范围4交广。现有技术中，有两类方法推动着鱼类生长激素基因体外表达向应用发展其一是表达效率的提高，根据大肠杆菌偏爱密码子和已知鱼的生长激素氨基酸序列，人工合成生长激素cDNA，转化大肠杆菌，获得大量的生长激素；或者构建新型表达载体，在大肠杆菌中高效表达，获得更高表达量的外源蛋白。然而大肠杆菌的表达产物往往形成包涵体，对其处理耗时、繁瑣，同时表ii4且提物中含有内毒素，必须对目的产物进行严格的分离纯化才可应用。因此人们又转而尝试可作为饰泮十的表达系统。酿酒酵母基因工程菌不仅具有原核系统的优点，而且具有典型真核系统的特性，被认为是表达外源蛋白的合适寄主。其优越性表现在l、具有类似原核生物生长快，容易培养，繁殖速度快，能高密度培养，易于遗传操作的特点；2、具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程；3、采用高表达的启动子，高效表达目的基因，可诱导调控；4、完成基因组测序，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力；5、酿酒酵母安全无毒。加之酿酒酵母细胞内有着较其他生物更为高效的同源重组修复机制，研究表明30-50bp的同源区段就可以介导有效的重组，这使得酿酒酵母比其它生物更合适应用同源重组技术进行各种DNA操作，从而实现外源基因在酿酒酵母中的长期稳定表达，已经有多种药物一如纤维二糖酶、人a干扰素、乙肝表面抗原等在酿酒酵母中得到了表达。目前已发展和建立的酿酒酵母表达载体既有整合型载体又有附加体型酵母。应用于酿酒酵母的附加体型表达载体多为大肠杆菌一酿酒酵母穿梭表达质粒，此载体可在细菌宿主中进4亍选择和增殖，常使用pUC质粒的复制起点和氨苄青霉素抗性选择标记。酵母部分通常包括酵母的2MIT1质粒的复制区，用于酵母转化的选捧元件主要是营养缺陷型相关的基因。这类载体能独立于酵母染色体之夕卜复制，常以30或更多拷贝存在，但没有选择压力时不稳定。这种类型表达载体在细胞中必须有选才奪压力才能稳定表达，不适于工业化生产。另一类载体没有在酵母中复制的质粒复制区，而是利用同源片断将载体整合到染色体上，这类染色体稳定性高，适于工业化生产，但拷贝凄W氐。在表达时，外源基因与来自酿酒酵母的高^4达基因启动融合，这些启动子既有组成型表达，也有诱导型表达。由于酿酒酵母安全无毒，在水产养殖中曾被用来强化囟虫、轮虫，作为真鲷仔鱼和牙鲆仔鱼辨料。因此酿酒酵母是表达鱼类生长激素的上佳选择，Piyaviriyakul等(2002)使用含PGK启动子的酿酒酵母附加型载体在酿酒酵母中获得102.5mg/l的重组巨鲶鱼生长激素。马进等(1999)构建了表达虹鳟生长激素的以PGK为启动子的酿酒酵母附加型载体pMArGH16,转化酿酒酵母，获得了表达虹鳟生长激素的酵母工程菌，得到的重组生长激素的表达量约占细胞可溶性蛋白总量的3%。将该酵母作为祠料添加剂招:喂罗非鱼，2%添加量能显著提高幼鱼的增长，体重增长率比对照组提高38%(2001)。但目前尚没有将酿酒酵母应用到牙鲆生长激素的体外表达上，特别是整合型表达。
发明内容本发明提供了一种转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用，可以加快鲆鲽鱼类的生M度，解决目前鲆鲽鱼类较长的养殖过程中，由于温度、水质等原因的影响而生病死亡的问题。本发明的目的是由以下技术方案实现的一种转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述的转基因酵母是将牙鲆生长激素基因转入酿酒酵母中获得的。所述的转基因酵母表达牙鲆生长激素，该转基因酵母已由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.2478。所述的酉良酒酵母为&CCA3iYM7yC"cere5"/ae色氛叙合成缺陷型。所述牙鲆生长激素基因为牙鲆生长激素成熟肽cDNA,含有525bp的核苷酸片段，与序列表第1号序列所示核苷酸序列具有100°/。的同源性。所述转基因酵母表达的牙鲆生长激素为牙鲆生长激素成熟肽，编码174个氨基酸残基，其分子量为19KDa，其M酸序列与序列表第2号序列所示的氨基*列具有100%的同源性。所述的牙鲆生长激素基因转入酿酒酵母中是通过将牙鲆生长激素基因构建载体pIPGK-GH,转化酿酒酵母，获得转基因酵母^cc力a/Y/^c"cerer/w'seYGH。所述的载体pZGH中，牙鲆生长激素cDNA的前端为酿酒酵母的PGK(磷酸甘油激酶基因)的启动子，由PGK启动子来启动牙鲆生长激素的表达，PGK启动子长1490bp,与序列表第3号序列所示的核苷S臾序列具有100°/。的同源性。所述的载体pZGH中，所述生长激素基因表达框的两侧为酿酒酵母的URA3基因，以URA3基因作为与酿酒酵母的基因组DNA发生同源重组的位点，URA3基因长807bp,与序列表第4号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性。一种转牙鲆生长激素基因酵母的制备方法，其特征在于具有如下步骤[1]牙鲆生长激素cDNA的制备提取牙鲆脑垂体总RNA,设计含有酶切位点BamHI和NotI的引物pingl和ping2,pingl引物序列与序列表第5号序列所示的核普酸序列具有100%的同源性，ping2引物序列与序列表第6号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，采用逆转录聚合^t连式反应(RT-PCR)方法，扩增出生长激素成熟肽cDNA,测序确定其与预期的序列一致；[2]构建酿酒酵母转化载体将牙鲆生长激素成熟肽cDNA，经BamHI和NotI双酶切后连入大肠杆菌质粒pUC-PGK，构建转化载体pIPGK-GH，大肠杆菌质粒pUC-PGK是以pUC18为原始载体，在其多克隆位点中依次连入URA3基因上游序列、PGK启动子序列、色氨酸基因序列和URA3基因下游序列构建而成的，测序确定生长激素cDNA序列、PGK启动子序列和URA3序列均与预期的序列一致；牙鲆生长激素基因转化到酿酒酵母中转化载体pIPGK-GH经NcoI酶切后回收获得含牙鲆生长激素基因的线性片段，该线性片段通过LiAc介导的方法转化酿酒酵母感受态细胞，然后将转化的酿酒酵母细胞涂布在色氨酸缺陷型选择培养基上；对色氨S吏缺陷型选择培养基上长出的阳性克隆进行PCR鉴定，将筛选出的含有生长激素基因的酿酒酵母在YPD培养基上连续传代，湘遞生长激素基因稳定存在的酿酒酵母单克隆进行大规模培养；转牙鲆生长激素基因酵母的培养转牙鲆生长激素基因酵母于20-30。C下在YPD液体培养基中震荡或发酵培养，YPD培养基配方如下组分用量(g/L)酵母提取物10蛋白胨20葡萄糖20转牙鲆生长激素基因酵母在养殖鲆鲽鱼类的铜料添加剂或饲料中的应用。转牙鲆生长激素基因酵母的鉴定提取转牙鲆生长激素基因酵母的基因组DNA,分别以EcoRI和BglI进行酶切，然后以牙鲆生长激素cDNA4冢针进行Southern杂交，证实生长激素基因重组整合到酿酒酵母基因组DNA中。牙鲆生长激素在酿酒酵母中表达的Western杂交4企测糸W又转牙鲆生长激素酿酒酵母单菌落，于20-30°C下在YPD液体培养基中振荡培养2-5天。收集转基因酵母，破碎细胞后离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将聚丙烯酰胺劍交转〗莫后与兔抗鱼生长激素抗血清进行杂交，证实牙鲆生长激素已经在酿酒酵母中表达。表达牙鲆生长激素酿酒酵母的冷冻干燥表达牙鲆生长激素酿酒酵母在冷冻离心才几中以4。C,5000-20000g,1-10min的条件离心收集，收集的样品以1。C/min的速率冷冻到-4(TC，然后转入事先预冷的冷冻干燥^L中冷冻干燥，在冷冻干燥的最后两小时内，加热样品到23。C以减少残留水l分。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明得到了转牙鲆生长激素基因酵母，将牙鲆生长激素在酿酒酵母中表达，该酿酒酵母在促进鲆鲽鱼类生长、提高斜料转化率方面具有显著的作用。而且酿酒酵母本身可以作为鱼类的饲料，因此得到的表达生长激素的酿酒酵母不需要纯化，生产容易，成本较低，可以直接用于制备鲆鲽鱼类(含亲鱼和苗种)的生长剂和饲料添加剂。本发明制备的转牙鲆生长激素基因酵母,是在酿酒酵母的URA3基因位点，以同源重组的方式将牙鲆生长激素基因整合到酿酒酵母的基因组上，因此它可以随着细胞的传代而稳定存在。在实验室进行的50代的传代过程中，牙鲆生长激素基因依然稳定存在，没有发生丢失现象，这为将来生产和应用的安全性问题提供了保障。本发明制备的转牙鲆生长激素基因酵母，采用磷酸甘油激酶基因(PGK)启动子来启动生长激素的表达。PGK启动子是一种酿酒酵母组成型强启动子，表达过程中无需诱导条件可以实现外源蛋白的持续稳定表达，得到用酿酒酵母表达的生长激素的量为734ng/ml，表达量为1.93%0。本发明制备的转牙鲆生长激素基因酵母在促进牙鲆生长、提高何料转化率方面具有显著的作用。以转牙鲆生长激素基因酵母作为飼料添加剂投喂牙鲆7周的实验结果表明，转基因酵母在O.5%和1.0%添加量即能显著促进牙鲆生长，二者体重分别比对照提高31.21%和50.24%,斜津+转化率比对照组提高26.15%和3107%。证明了转牙鲆生长激素基因酵母对牙鲆具有明显的促生长作用。本发明制备的转牙鲆生长激素基因酵母安全无毒。以小鼠为实验对象，通过对转牙鲆生长激素基因酵母的经口急性毒性、传统致畸实验、骨髓微核实验以及精子畸形检查，发现转牙鲆生长激素基因酵母的经口LD5。>10g/kg;转基因酵母对孕鼠生殖机能和胎鼠生长发育不会产生影响，对胎鼠没有致畸作用；对小鼠骨髓细胞省i核及精子畸形没有诱导作用。本发明制备的转牙鲆生长激素基因酵母是一种安全有效的鲆鲽鱼类饲料或飼料添加剂，在水产养殖业中具有4交大的应用价值。图1为载体pIPGK-GH的构建流程图；图2为转牙鲆生长激素基因酵母的Southern杂交4企测结果图；图3为牙鲆生长激素在酿酒酵母中表达的Western杂交斥全测结果图。转牙鲆生长激素基因酵母(5^cc力ar咖，7cei1cere「/6"/aeYGH)的保藏曰期2008年4月30日；保藏单位的名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通《敖生物中心；地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；简称CGMCC;保藏编号2478。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例l:转牙鲆生长激素基因酵母的制备[1]牙鲆生长激素cDNA的制备提取牙鲆脑垂体总RNA,设计含有酶切位点BamHI和NotI的引物pingl和ping2，pingl引物序列与序列表第5号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，ping2引物序列与序列表第6号序列所示的核苷g臾序列具有100%的同源性，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，扩增出牙鲆生长激素cDNA，测序确定其与预期的序列一致。[2]构建酿酒酵母转化载体将牙鲆生长激素成熟肽cDNA,经BamHI和NotI双酶切后连入大肠杆菌质粒pUC-PGK，构建转化载体pIPGK-GH。^M杆菌质粒pUC-PGK是以pUQ8为原始载体，在其多克隆位点中依次连入URA3基因上游序列、PGK启动子序列、色氨to因序列和URA3基因下游序列构建而成的。测序确定生长激素cDNA序列、PGK启动子序列和URA3序列均与预期的序列一致。[3]牙鲆生长激素基因转化到酿酒酵母中转化载体pIPGK-GH经NcoI酶切后回收获得含牙鲆生长激素基因的线性片段，该线性片段通过LiAc介导的方法转化酿酒酵母感受态细胞，LiAc介导的转化方法如下(1H兆取酵母单克隆于5mlYPD培养基中，30。C振荡培养过夜；(2)次日，测0D,，以最终006。。=0.4的细胞密度接种5mlYPD培养液，继续培养2-4小时；(3)离心收集酵母细胞，L5mL/管，2500rpm，5min。用无菌水悬浮后再离心收集；(4)弃水，每管加入50(iLLiAc(100mM);(5)离心收集细胞，加入转化混合液(按下列顺序加入)20jaLPEG(50%w/v)36juL1MLiAc25jiL单链载体DNA(2mg/mL)50(iL外源片段(0.l-10(ig)剧烈振荡lmin;(6)30。C保温30min;(7)42。C温育20-25min;(8)离心收集转化细胞，6000-8000rpm,15S。弃转化混合液；(9)加0.2-lmL无菌水，轻轻悬浮；(10)每200|uL涂在色氨酸缺陷型选择培养基上(不加色氨酸的MinimalDextrosePlates);不力口色氛酸的MinimalDextrosePlates酉己方^口下组分用量(g/L)YNB6.7葡萄糖20亮氨酸0.1琼脂15(11)将选择培养基上长出的阳性克隆进行PCR鉴定；(12)将筛选出的含有生长激素基因的酿酒酵母在YPD培养基上连续传代3次；(13)湘遞生长激素基因稳定存在的酿酒酵母单克隆进行大M^i咅养。[4]转牙鲆生长激素基因酵母的培养转牙鲆生长激素基因酵母于20-30。C下在YPD液体培养基中振荡或发酵培养。YPD培养基配方如下组分用量(g/L)酵母提取物10蛋白胨20葡萄糖20实施例2:转牙鲆生长激素基因酵母的鉴定牙鲆生长激素基因重组整合到酿酒酵母基因组DNA中Southern杂交检测提取转牙鲆生长激素基因酵母的基因组DNA，分别用EcoRI和Bgll进行酶切，将牙鲆生长激素cDNA进行地高辛标记制作探针，然后进行Southern杂交。结果如图2所示，其中，M:VEcoRI+HindIII;1:未转化酿酒酵母的基因组DNA(未酶切)；2:EcoRI酶切的未转化酿酒酵母的基因组DNA;3:BglI酶切的未转化酿酒酵母的基因组DNA;4:转化酿酒酵母的基因组DNA(未酶切)；5:EcoRI酶切的转化酿酒酵母的基因组DNA;6:BglI酶切的转化酿酒酵母的基因组DNA;7:未转化酿酒酵母的基因组DNA(未酶切)的Southern杂交结果；8:EcoRI酶切的未转化酿酒酵母的基因组DNA的Southern杂交结果；9:BglI酶切的未转化酿酒酵母的基因组DNA的Southern杂交结果；10:转化酿酒酵母的基因组DNA(未酶切)的Southern杂交结果；11:EcoRI酶切的转化酿酒酵母的基因组DNA的Southern杂交结果；12:BglI酶切的转化酿酒酵母的基因组DNA的Southern杂交结果。结果表明转牙鲆生长激素基因酵母的基因组DNA无论是经过酶切还是没有经过酶切，都可以与探针发生>^应，显示出杂交条带；而未转化酿酒酵母的基因组DNA与探针不能发生反应，无杂交信号。证实牙鲆生长激素基因已经通过同源重组整合到酿酒酵母的基因组DNA上。实施例3:牙鲆生长激素基因在酿酒酵母中的稳定性检测DextrosePlates固体培养基上，；降菌落长出来后，随才几才兆选2个克隆在不加色氨酸的MinimalDextrosePlates固体培养基上划线培养；4寺菌落长出来后，再随才;U兆选2个克隆在YPD固体培养基上划线培养......这样连续传50代后，再随才/Ofe选10个菌落进行PCR检测，均有特异性条带克隆出来，结果表明牙鲆生长激素基因在酿酒酵母中是稳定存在的，不会随着细胞的传代而丟失。实施例4:表达牙鲆生长激素酿酒酵母的冷冻干燥表达牙鲆生长激素酿酒酵母在冷冻离心才几中以4°C，10000g，10min的条f牛离心收集，收集的样品以1°C/min的速率冷冻到-40°C,然后转入事先预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥，在冷冻干燥的最后两小时内，力口热样品到23。C以减少残留水4分。实施例5:牙鲆生长激素在酿酒酵母中表达的Western杂交才全测糸沐转牙鲆生长激素基因酵母单菌落，于20-30°C下在YPD液体培养基中振荡培养2-5天。收集转基因酵母，破碎细胞后离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将聚丙烯酰胺凝胶转膜后与兔抗鱼生长激素抗血清进行杂交。结果如图3所示，其中，M:蛋白分子量标准；1，2:未转化酿酒酵母；3,4:转化酿酒酵母；5，6:未转化酿酒酵母的Western杂交结果；7,8:转化酿酒酵母的Western杂交结果。结果表明转基因酵母在19kD处显现出杂交条带，未转基因酵母没有此杂交条带的出现。证实牙鲆生长激素在酿酒酵母中经过诱导表达了。实施例6:牙鲆生长激素在酿酒酵母中表达量的测定采用酶联免疫法(ELISA法)，将生长激素纯品包被ELISA板，然后依次添加一抗——兔抗鱼生长激素抗体和二抗——-束一艮过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，显色后测定0D柳，根据生长激素纯品的浓度梯度与OD柳的关系绘制标准曲线。将酵母中表达的牙鲆生长激素产品进行ELISA检测。收集O.50D、10mL的酵母菌，离心收集沉淀，并对细胞进行裂解，用Lowry-Kalokar公式计算转基因酵母裂解后的蛋白悬液中蛋白质含量为0.381mg/ml。用转基因酵母YGH的OD柳值(2.93)减去未转基因酵母的OD柳值(0.77)，即为在酿酒酵母中表达的生长激素对应的0D492值(2.16)，对应标准曲线，查出2.16对应的生长激素的量为734ng/ml。据此，得出酿酒酵母YGH总蛋白为0.381mg/ml浓度下表达的生长激素的量为734ng/ml,表达量为1,93%。。实施例7:表达牙鲆生长激素的酿酒酵母对牙鲆生长及生理生化的影响分别离心收集转牙鲆生长激素基因的酿酒酵母和未转基因酵母，冷冻干燥后按照0.5%转基因酵母(w/w)和1°/。转基因酵母(w/w)添加到鲆鲽鱼类的普通詞料中，同时设置不添加酿酒酵母的普通伺料作为对照组，并设一组重智久。购买牙鲆鱼60条，随机分为6缸，10条/缸，培养条件如下23°C,24小时通气，水24小时循环，每三天将鱼缸中的水完全更换一次，每天喂食两次，喂食以不留残饰为准，每次喂食时计算摄食量。鱼买回后，先在实验室条件下驯养10天，当所有的鱼都开始进食时，开始实验。整个实验周期为7周，每5天测一次体重、体长和体宽。经过7周的实验，0,5%和1.0%转基因酵母组鱼的体重增长分别比商品饲料对照组提高了31.21%和50.24%。尽管投喂转基因酵母的牙鲆其摄食量比对照鱼有所增加，统计分析表明二者之间不存在显著差异(P〉0.05)。两个实验组的何料转化率均比对照组有明显提高(分别为26.15%和32.07%)(P<0.05),且1.0%转基因酵母组的辨料转化率显著高于0.5%转基因酵母添加组的转化率。实施例8:表达牙鲆生长激素酿酒酵母的生物安全性;险测选用青岛市动物实验中心的SPF级(清洁级)昆明种小鼠，体重20土2g，许可证号SCXK(鲁)20030010。预养5天后，求遞健康小鼠进行经口急性毒性研究、致畸作用研究、骨髓微核诱导作用研究、精子畸形诱导作用研究。结果表明在对小鼠进行灌胃后的一周时间里，各组小鼠摄食与活动正常，；^现出中毒症状，各组均无小鼠死亡。表明转牙鲆生长激素基因酵母对小鼠不具有毒性，L仏。大于10g/kg。按照我国对化学有毒物品的分级标准，转牙鲆生长激素基因酵母属于实际无毒物质。在表达牙鲆生长激素酿酒酵母对小鼠的母体毒性、胚胎毒性和致畸性的研究中，通过对各组母鼠在期间多个时间点的体重增长进行称重和统计分析表明，转牙鲆生长激素基因酵母对孕鼠体重没有影响，三个转基因酵母组孕鼠的体重与对照组比较都没有显著性差异(P〉0.05)。灌。畏0.5g/kg、2.Og/kg及10.Og/kg转基因酵母的母鼠，其生殖机能与对照组没有差异，其产仔能力和活胎生产率没有受到影响。灌喂转基因酵母的三组母鼠都没有产下死胎。灌喂转基因酵母的母鼠平均每窝生产活胎鼠的数量与对照母鼠没有差别。对照组、0.5g/kg、2.Og/kg及10.Og/kg转基因酵母组母鼠所产胎鼠的雌雄比例分别为i:i.o，i:o.9，i:1.1和i:1.1,组间比4交没有显著差异，表明转基因酵母对小鼠后代性别比例不会产生影响。三个转基因酵母组母鼠所产胎鼠的体重、体长IC长与对照组胎鼠比较没有显著差异(P〉0.05)，四组胎鼠的胎盘重量也没有差别。灌喂O.5g/kg、2.Og/kg及10.0g/kg转基因酵母的三组母鼠均未产生畸形现象，也未产下畸形胎鼠，四组小鼠的外爿见和生理活动表现正常。对活胎鼠的骨骼进行4全查，四组胎鼠的推骨、肋骨和胸骨均未产生数目及形状上的畸形，其颅骨和四肢骨及盆骨等也显示正常形态。胎鼠内脏器官畸形4企查结果表明，摄食转牙鲆生长激素基因酵母对胎鼠组织器官没有不良影响，灌喂转基因酵母的母鼠所产胎鼠具有正常的延髓、脊髓、舌、目艮、心、肺、食管及消化和泌尿生殖器官。2.Og/kg、5.Og/kg和10.Og/kg转基因酵母组小鼠的骨髓细胞微核率与阴性对照组比较均无显著差别(P>0.05)，且没有表现出剂量一效应关系，说明转基因酵母对小鼠骨髓细胞微核发生不具有诱导作用。对小鼠的精子进行研究发现，灌喂2.Og/kg、5.Og/kg和10.Og/kg转基因酵母的小鼠，其畸形精子数量与水对照组没有显著差异(P>0.05),也没有明显的剂量一反应关系。表明转基因酵母对小鼠精子畸形没有诱导作用，未发现有双头、双^C^C折叠的畸形精子。通过小鼠急性毒性试验、传统致畸试验、骨髓微核和精子畸形试验，证明转牙鲆生长激素基因酵母对小鼠不会产生致畸和致突变作用，是一种安全的转基因伺料或祠料添加剂。当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本
技术领域：
的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。序列表<110>中国海洋大学<120>转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用<160〉6<170><210>1<211〉525<212>腿<213〉牙鲆生长激素cDNA(cDNAofGrowthhormoneof/^/^//cMA^<220><221>CDS<222>(1)…(522)<223><400>11ATGCAGCCAATCACAGAGAACCAGCGCCTGTTCTCCATCGCTGTTGGTCGAGTTCAGTAT61CTTCACCTGGTTGCTAAGAAACTCTTCAGTGACTTTGAGAACTCACTACAGTTGGAGGAT121CAACGTCTTCTCAACAAAATCGCTTCAAAAGAATTTTGTCATTCAGATAATTTCTTGAGT181CCGATCGACAAACACGAGACACAAGGCAGCTCAGTTCAGAAGCTTTTATCGGTCTCTTAT241CGATTGATTGAGTCCTGGGAGTTTTTCAGTCGCTTCCTGGTCGCAAGTTTTGCTGTGAGG301ACCCAGGTTACATCCAAACTGTCAGAACTGAAGATGGGTCTCCTGAAGCTGATAGAGGCC361AATCAGGATGGAGCAGGTGGATTCTCTGAGAGTTCGGTGCTCCAGCTCACGCCGTATGGA421AACTCTGAACTGTTCGCCTGCTTTAAGAAGGATATGCACAAGGTGGAGACGTACCTGACC481GTGGCCAAATGCCGACTCTTTCCAGAAGCTAACTGCACCCTGTAG<210>2<211>174<212>PRT<213〉重组牙鲆生长激素(recombinantGrowthhormoneof/^ra7/o/^力"<400>21METGinProlieThrGluAsnGinArgLeuPheSerlieAlaVal16GlyArgValGinTyrLeuHisLeuValAlaLysLysLeuPheSer31AspPheGluAsnSerLeuGinLeuGluAspGinArgLeuLeuAsn46LyslieAlaSerLysGluPheCysHisSerAspAsnPheLeuSer61ProlieAspLysHisGluThrGinGlySerSerValGinLysLeu76LeuSerValSerTyrArgLeulieGluSerTrpGluPhePheSer91ArgPheLeuValAlaSerPheAlaValArgThrGinValThrSer106LysLeuSerGluLeuLysMetGlyLeuLeuLysLeulieGluAla121AsnGinAspGlyAlaGlyGlyPheSerGluSerSerValLeuGin136LeuThrProTyrGlyAsnSerGluLeuPheAlaCysPheLysLys151AspMetHisLysValGluThrTyrLeuThrValAlaLysCysArg166LeuPheProGluAlaAsnCysThrLeu<210><211〉<212〉<213〉<400〉16112118124130136142148154160166172178184190131490醒酉良酒酵母PGK启动子(promoterofPGKofxS^ccAsrcM^cexcereWy/ae)3AAGCTTTCTAGCAAATGTAATTACAACCTGCTAGGATCAGCCTCCCCATCTTACCGCTTTAACCCTTCTATCAAAAATAGGCAGTTAGACGCAAGTACCACGATGACTTCAAATCGATTACTGACTTCAATTACTCGTGATTGGGCGCGAAAGTGTTTCCACTGATCTATTTTGTGGTATAAAATACTTTGCATGAACGCCGTTATCACACATCCGGTGATACACTCACAGTAGCATACAGCGAATTTTTCTGAGCAGGACCATACTGTAATTTTTTTTTCTCAAGACGCGTAAGGAAAGATCCTTTATTCTCCTTCTTGCCAAAACTGATTTGCCGTTCATCTACAATCATCACAGACAATGACAGGTGTAGACCGCCATCTACCAGTGATTAAAACATCGAAGAAGTATAATAATAGAATTGCTTTTACTTTCCTCTTACAGATATTAAGTGAGGAACTTGGCTTCACAATTGATGTTAAATTACATTAAAATCTGTAATACCATTCTAAATCTTCTTTCATTTTGTGCAGAGGGGCATACGAATTGCGGCGGGCACGCCTTCAAAGAAATGATAATAGTTGTGTATTTTTATTAACCTAACATCTGCTATCGCATACCCTCATACTAACCCTCATAACTTGATTAGGGAATTTTCTCTATAACATGTGACAAACGTCCTCTTATGGGGAGAGCAATCATTCAGAAAATATCATTGCCATGGGGTCTCTACTATAGTATTTAGTGTGCTTAATTTTTAACAATAGGCACTGCATTTAATTATCAGGGCAGCACGTGGCTTTATCACAGATTGGTCACACCCCTTAATAACAATTGATCACGATCCTTAATCACCTGCACTGTTTGCATCTTATCTTGTATCTTGTTTTGAGATAACGTAAGTTTCTGTTTTTAGATTCTTTGCAAGAAAGATGCCGATCAGAAAAAGGCTCTTATCGA961GAAAGAAATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAG1021ACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCGTCACACAACAAGG1081TCCTAGCGACGGCTCACAGGTTTTGTAACAAGCAATCGAAGGTTCTGGAATGGCGGGAAA1141GGGTTTAGTACCACATGCTATGATGCCCACTGTGATCTCCAGAGCAAAGTTCGTTCGATC1201GTACTGTTACTCTCTCTCTTTCAAACAGAATTGTCCGAATCGTGTGACAACAACAGCCTG1261TTCTCACACACTCTTTTCTTCTAACCAAGGGGGTGGTTTAGTTTAGTAGAACCTCGTGAA1321ACTTACATTTACATATATATAAACTTGCATAAATTGGTCAATGCAAGAAATACATATTTG1381GTCTTTTCTAATTCGTAGTTTTTCAAGTTCTTAGATGCTTTCTTTTTCTCTTTTTTACAG1441ATCATCAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTAGTAATTATCTACTTTTTYMC<210>4<211>807<212>腿<213〉酿酒酵母URA3基因(URA3of^cc力a/YM^c"cereWs/ae)<400>41TAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCT61CAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCG121TACCACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAA181AACACATGTGGATATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGC241ATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAA301TACAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGACATTAC361GAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAGCAGGCGGCGGAAGA421AGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAGAATTGTCATGCAAGGGCTCCCT481AGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGT541TATCGGCTTTATTGCTCAAAGAGACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGAT601TATGACACCCGGTGTGGGTTTAGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTATAGACC661GTGGATGATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGAAGAGGACTATTTGCA721AAGGGAAGGGATGCTAAGGTAGAGGGTGAACGTTACAGAAAAGCAGGCTGGGAAGCATAT781TTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAA<210〉5<211>30<212〉DNA<213>牙逢平生长;敫素cDNA(cDNAofGrowthhormoneofArW/c/^A^<400>5CGGGATCCATGCAGCCAATCACAGAGAACC〈210>6<211>34<212>DNA<213>牙鲆生长激素cDNA(cDNAofGrowthhormoneof尸扁"c雄75"<400〉6ATAAGAATGCGGCCGCCTACAGGGTGCAGTTAGC权利要求1.一种转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述的转基因酵母是将牙鲆生长激素基因转入酿酒酵母中获得的。2.根据权利要求l所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述的转基因酵母表达牙鲆生长激素，该转基因酵母已由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.2478。3.根据权利要求l所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述的西良酒酵母为^cc力aroy^c"cerew、/ae色氨酸合成在夬陷型。4.根据权利要求1或2所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于:所述牙鲆生长激素基因为牙鲆生长激素成熟肽cDNA,^^有525bp的核苷酸片段，与序列表第1号序列所示核苷g臾序列具有100%的同源性。5.根据权利要求2所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述转基因酵母表达的牙鲆生长激素为牙鲆生长激素成熟肽，编码174个氨基酸戎基，其分子量为19KDa,其to酸序列与序列表第2号序列所示的MJ^f列具有100%的同源性。6.根据权利要求4所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述的牙鲆生长激素基因转入酿酒酵母中是通过将牙鲆生长激素基因构建载体pIPGK-GH，转^匕酿酒酵母，获4寻寿争基因酵母&ccA3rcM^c"cereK/w'aeYGH。7.根据权利要求6所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述的载体pIPGK-GH中，牙鲆生长激素cDNA的前端为酿酒酵母的PGK(磷酸甘油激酶基因)的启动子，由PGK启动子来启动牙鲆生长激素的表达，PGK启动子长1490bp，与序列表第3号序列所示的核苷酸序列具有100°/。的同源性。8.根据权利要求6所述的转牙鲆生长激素基因酵母，其特征在于所述的载体pIPGK-GH中，生长激素基因表达框的两侧为酿酒酵母的URA3基因，以URA3基因作为与酿酒酵母的基因组DNA发生同源重组的位点，URA3基因长807bp,与序列表第4号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性。9.根据权利要求l所述的转牙鲆生长激素基因酵母的制备方法，其特征在于具有如下步骤[1]牙鲆生长激素cDNA的制备提取牙鲆脑垂体总RNA，设计含有酶切位点BamHI和NotI的引物pingl和ping2，pingl引物序列与序列表第5号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，ping2引物序列与序列表第6号序列所示的核芬酸序列具有100%的同源性，采用逆转录聚合酶链式^^应(RT-PCR)方法，扩增出生长激素成熟肽cDNA,测序确定其与预期的序列一致；[2]构建酿酒酵母转化载体将牙鲆生长激素成熟肽cDNA,经BamHI和NotI双酶切后连入^/》杆菌质粒pUC-PGK，构建转化载体pIPGK-GH,大肠杆菌质粒pUC-PGK是以pUC18为原始载体，在其多克隆位点中依次连入URA3基因上游序列、PGK启动子序列、色氨S緣因序列和URA3基因下游序列构建而成的，测序确定生长激素c腿A序列、PGK启动子序列和URA3序列均与预期的序列一致；[3]牙鲆生长激素基因转化到酿酒酵母中转化载体pIPGK-GH经NcoI酶切后回^R^得含牙鲆生长激素基因的线性片段，该线性片段通过UAc介导的方法转化酵母感受态细胞，然后将转化的酿酒酵母细胞涂布在色氨酸缺陷型选择培养基上；对色氨酸缺陷型选择培养基上长出的阳性克隆进行PCR鉴定，将筛选出的含有生长激素基因的酿酒酵母在YPD培养基上连续传代，糸遞生长激素基因稳定存在的酿酒酵母单克隆进行大M^莫培养；[4]转牙鲆生长激素基因酵母的培养转牙鲆生长激素基因酵母于20-30°C下在YPD液体培养基中震荡或发酵培养，YPD培养基配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>10.转牙鲆生长激素基因酵母在养殖鲆鲽鱼类的祠料添力。剂或飼料中的应用。全文摘要本发明公开了一种转牙鲆生长激素基因酵母及其制备方法和应用，所述的转基因酵母是将牙鲆生长激素基因转入酿酒酵母中获得的，得到的酿酒酵母表达牙鲆生长激素。酿酒酵母发酵技术成熟，表达量较高，而且安全无毒，得到的表达牙鲆生长激素的酿酒酵母不需要纯化可以直接用作鲆鲽鱼类养殖的饲料或饲料添加剂，加快鲆鲽鱼类的生长速度，缩短养殖周期。文档编号C12R1/865GK101280282SQ20081010908公开日2008年10月8日申请日期2008年5月23日优先权日2008年5月23日发明者滨刘,刘顺梅,张学成,臧晓南申请人:中国海洋大学