一种人工合成的抗虫基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种人工合成的抗虫基因及其应用，特别设及一种根据玉米偏好密码 子设计并合成的抗虫基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如化、EPSPS等，大多来自原核生物， 由于原核生物基因自身的特点，如DAT含量较高，超过60%，造成基因表达的mRNA在植物 体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、 mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结 构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5' -UTR序列和3'末端的polyA 加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽抱杆菌的野生型 杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001%或者几乎 检测不到。
[0003] 玉米惧是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米惧危害造成玉米产量损失在5%左 右。我国是玉米惧的多发和重发区，20世纪70年代W来，几乎每两年就大发生一次，年损失 玉米380-640万吨，相当于一个中等玉米省的产量。
[0004] 由于玉米的内源抗虫性是受多基因控制的，且屯、叶期祀标害虫和穗期祀标害虫基 因各自独立遗传，用常规育种方法培育抗惧杂交种不仅周期长，而且很难获得兼抗两个世 代玉米惧的亲本。同时，玉米抗惧基因很有可能与高产性状呈负相关，20年来各国抗惧育种 均未取得明显进展。
【发明内容】
阳〇化]本发明的一个目的是提供一种DNA分子，该DNA分子是抗虫基因。
[0006] 本发明所提供的DNA分子，名称为mcrylAh，其核巧酸序列为序列表中序列3或序 列3的第1-2007位。
[0007] 所述DNA分子的核巧酸序列还可为与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至 少具有98%的同一性，且编码序列9所不蛋白质（命名为化ylAh蛋白）。
[0008] 其中，序列3由2010个核巧酸组成，其末尾处为两个终止密码子，编码序列9所示 的化ylAh蛋白。序列9由668个氨基酸组成。
[0009] 含有所述DNA分子（mcrylAh)的重组载体、重组宿主菌、重组细胞系或转基因植物 也属于本发明的保护范围。
[0010] 根据需要，所述重组载体既可为克隆载体，也可为表达载体；在本发明的一个实施 例中，所述重组载体具体为PS3300-UMG2-UC2A。在本发明的一个实施例中，所述重组宿主菌 为携带有所述DNA分子的农杆菌，如LBA4404。所述重组细胞系可W为真核细胞，也可W为 原核细胞，如植物细胞系。所述转基因植物（如玉米）包括种子、愈伤组织、完整植株和细 胞。
[0011] 由所述DM分子（mcrylAh)转录所得的RNA也属于本发明的保护范围。
[0012] 所述DNA分子（mcrylAh)在培育抗虫转基因玉米中的应用也属于本发明的保护范 围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0013] 所述DNA分子（mcrylAh)在提高玉米化ylAh蛋白表达量中的应用也属于本发明 的保护范围。所述化ylAh蛋白为序列表中序列9所不的蛋白质。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述玉米具体为玉米化II。
[0015] 在本发明中，所述抗虫具体为抗玉米惧。
[0016] 本发明针对原核生物抗虫基因化ylAh(序列1)在植物中表达较低的问题，在保持 原氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好性密码子对其进行优化，去除影响RNA稳定性 的结构（如polyA、重复序列、AT和GC串联重复、RNA二级结构、核糖体结合位点等），增加 GC含量等，使其在玉米中高效稳定表达。
[0017] 实验证实，本发明所提供的人工合成的抗虫基因（序列3)的转基因玉米，其 化ylAh蛋白蛋白的表达量明显提高，每克（鲜重）叶片中化ylAh蛋白的表达量可达 3. 18μg，而原始基因表达量仅为1.01μg。同时，本发明所提供的人工合成的抗虫基因（序 列3)的转基因玉米对祀标害虫的抗性也明显提高，转入mcrylAh基因的Te代植株，在玉米 5-6叶期接虫后，无明显的虫害，表现正常；而转crylAh基因（优化前，序列2)及非转基因 植株，在接虫后，虫害非常严重。
【附图说明】
[0018]图 1 为载体PS3300-UMCT-UMG2、PS3300-UMG2-UCA和PS3300-UMG2-UC2A的质粒 图谱。其中，A为PS3300-UMCT-UMG2的质粒图谱巧为PS3300-UMG2-UCA的质粒图谱；C为 PS3300-UMG2-UC2A的质粒图谱。
[0019] 图2为转基因玉米CrylAh基因、mCrylAh基因和mG2-aroA基因的PCR检测图谱。 其中，A为转基因玉米化ylAh基因的PCR检测图谱；1 :〇r(质粒阳性对照）；2:Marker;3 : CK(未加DNA) ;4:CK(非转基因玉米）；5-24:转化ylAh基因玉米事件。B为转基因玉米 mCrylAh基因的PCR检测图谱；1 :αΤ(质粒阳性对照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4 : CK(非转基因玉米）；5-24:转mCrylAh基因玉米事件。C为转基因玉米mG2-aroA基因的 PCR检测图谱；1 :〇r(质粒阳性对照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4:CK(非转基因玉 米）；5-14 :转CrylAh基因玉米事件；15-24:转mCrylAh基因玉米事件。
[0020] 图3为转基因玉米苗期草甘麟的耐受性检测结果。
[002U 图4为转基因玉米田间抗虫性检测结果。其中，A为海南抗虫的转mCrylAh基因 玉米株系；B为海南不抗虫的非转基因对照株系。
【具体实施方式】
[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 实施例1、密码子优化型抗虫基因的获得
[00巧]本实施例根据化ylAh全长基因（核巧酸序列如序列表中序列1所示，参见中国专 利申请：200410009918. 9)编码蛋白的前667个氨基酸序列（前667个氨基酸序列如序列 表中序列8所示，对应的核巧酸序列如序列表中序列2所示），在保证氨基酸序列不变的前 提下，首先采用玉米偏好密码子对化ylAh基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有 密码子，并调整了密码子的使用频率（表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的 造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核巧酸序列为 序列表中序列3。序列3与化ylAh基因（序列1)的l-20(nbp(即序列2)的同源性只有 70%，而G+C含量由原来的37. 4%增加到56. 3%。同时为了便于克隆，在起始密码子后添 加GGCS个核巧酸。序列3所示基因即为密码子优化型抗虫基因，将其命名为mcrylAh。密 码子在化ylAh基因和me巧lAh基因中的使用频率见表1。为方便克隆，发明人在序列3的 5'端引入Spel酶切位点，在3'端引入Aatll酶切位点，最终序列如序列表中序列4所示。 序列4的第7-2016位即为序列3。序列1的第1-2001位（即序列2)编码序列表中序列8 所示蛋白，序列3W及序列4的第7-2016位均编码序列9所示蛋白（与序列8所示蛋白相 比多出序列9自N端起的第2个氨基酸残基），将该蛋白命名为化ylAh蛋白。 阳0%] 表1玉米优选密码子标准
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[0029]
[0030] 实施例2、mcrylAh转基因玉米的获得
[0031] 一、重组表达载体PS3300-UMG2-UCA和PS3300-UMG2-UC2A的构建 W巧为了提高mcrylAh基因（序列扣在受体生物中的表达水平，发明人在构建mcrylAh基因的重组表达载体时，在me巧lAh基因的5'端添加了Ω序列和Kozak序列，Ω/ Kozak序列（简称0MK)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白基因 编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，5'端有一个UAUUUUUACAACAA序列 W及4个UUAC序列，运些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。 Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白的序列。启动子 选用组成性启动子化i启动子，其序列如序列表中序列6所示。再则，在编码序列3'端设计 了2个连续的终止密码子，W及加入人工合成的化lyA巧-N0S稳定终止序列。PolyA巧-N0S 序列如序列表中序列7所示。其中，PolyA具有维持mRNA稳定等作用，T-N0S终止序列确保 了翻译的准确终止。
[0033] 携带有crylAh和mcrylAh基因的重组表达载体PS3300-UMG2-UCA和 PS3300-UMG2-UC2A的构建具体程序如下：
[0034] a.Spel和Aatll酶切PS3300-UMCT-UMG2质粒（质粒图谱如图1中A所示），回 收大片段。 阳03引其中，PS3300