一种人工设计化学合成的基因及其表达的多肽产物的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人工设计化学合成的基因artf2及其表达的多肽产物Artf2的制备与应用。所述人工合成基因artf2具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。该基因artf2表达的多肽产物Artf2具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本发明所述的人工设计化学合成基因artf2的表达产物——多肽Artf2及其生物制品，无毒、环保，在促进植物生长发育、增产、增强植物抗逆性及抗病驱虫等方面应用效果良好，前景广阔。
【专利说明】一种人工设计化学合成的基因及其表达的多肽产物的制备 与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物基因工程领域，具体地说，涉及一种人工设计化学合成的基因及 表达的多肽产物的制备，以及该基因和表达的多肽产物在农业生产和植物改良等方面的应 用。
【背景技术】
[0002] 基因的研究是生物工程及医学工程的重要课题。基因的来源分为自然存在和人工 合成。至今已有大量自然基因被分离，克隆，并申请了专利。但在2013年6月13日美国 最高法院裁定：人类自身的基因 DNA片段不得申请专利，但人工合成的基因，可受到专利保 护。
[0003] 人工合成基因发端于1952年核酸的化学合成，50年代中期，Khorana等建立并发 展了磷酸二酯合成法。从上世纪60年代，DNA连接酶，RNA连接酶等工具酶的发现，使核酸 人工合成除化学方法以外，又有了酶促方法。这种酶可以将寡核苷酸片段连接成很长的核 酸链，核酸合成的化学法和酶促法相结合，可以实现较长核酸片段的人工合成。1972年， Khorana等人合成了相当于酵母丙氨酸tRNA基因规模的DNA双链，而在1979年首先完成了 包括启动和调节顺序在内的共有207个碱基对的大肠杆菌酪氨酸校正tRNA全基因序列。
[0004] DNA人工合成技术逐步成熟以后，很快就应用在蛋白质和多肽的基因人工合成方 面。自从1977年Itakura完成了人生长激素释放抑制因子(一个十四肽的多肽激素）基因 的人工全合成和表达以后，一系列的蛋白质和多肽的基因均相继利用人工合成，以及半合 成的方法得到，并已获表达。
[0005] 多肽是一大类由氨基酸残基构成的无高级结构的生物活性物质。它们与蛋白质的 最根本区别不在于氨基酸数量的多少，而是多肽无高级结构而蛋白质有高级结构。生物提 取的多肽具有很强的活性，也叫做活性肽。生物体中产生的多肽的种类成千上万，如胰岛 素，生长激素，干扰素，胸腺素 al，舒缓激肽，脑啡肽等人促红细胞生成素，人促血小板生成 素，人神经生长因子及白细胞介素1等，在生物的代谢方面起着重要的作用。人们已经分离 出了许多活性多肽并在农业，医学诊断治疗，保健方面发挥了很大的作用。昆虫受到外界环 境刺激时产生大量的具有抗菌活性的阳离子多肽，人们已筛选出百余种抗菌肽，体内外实 验证实，多个抗菌肽不仅有很强的杀菌能力还能杀死肿瘤细胞。蛇毒内也存在多种活性多 肽，从蛇毒内分离出一个13个氨基酸（INKAIAALAKKLL)小肽，其对G+及G-菌均有极强的 杀菌能力。现已发现中药的很多有效成分是小分子多肽，比如我国科学家从大豆内加工分 离出的活性多肽，可通过小肠直接吸收，能防治血栓，高血压和高血脂，还能延缓变老，提高 肌体肿瘤力。从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管疾病的小肽。多肽在 诊断试剂中最主要的用途是用作抗原检测病毒、细胞、支原体、螺旋体等微生物和囊虫、锥 虫等寄生虫的抗体，多肽抗原比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，且易于制备，因 此装配的检测试剂，其检测抗体的假阴性率和本底反应都很低，易于临床应用。现在用多肽 抗原装配的抗体检测试剂包括：甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨细胞病毒、单纯疱 疹病毒、风疹病毒、梅毒螺旋体、囊虫、锥虫、莱姆病及类风湿等。
[0006] 多肽在农业生产上也有着很重要的作用。首先多肽类物质在植物体内有传递信号 的功能，多肽信号分子在植物的生长发育和生殖发育中有重要的调节作用。其次多肽可以 提高农作物对病害、病毒病、部分虫害以及不良环境包括干旱、水涝、冷冻等等的抵抗能力， 多肽的这种功能是通过提高农作物自身的免疫能力实现的，从某种意义上来说，多肽类物 质就像农作物的保健品。农作物在环境胁迫条件下，能通过调节不同基因进行适应。目前 多肽类产品已经用于农业生产中，如多肽尿素、多肽有机复合肥等。这些产品中的多肽，都 是通过酶解的方式从植物蛋白或动物蛋白中获得。我们人工设计并化学合成了一个基因 ari/J?，并通过基因工程技术转到了 E. coli. JM109 (DE3)中，进而培养、诱导得到了该基因 表达的多肽产物Artf 2。这种多肽产物可以做成新型生物肥料或生物农药，它对植物主要有 以下作用：（1)促进植物的根系发育，使根系更为发达，从而提高植物对土壤中肥料的吸收 利用。（2)使植物叶片颜色加深，叶片变大变厚，能使植物的光合作用显著加强。（3)可以 调高植物抗病、抗病毒、抗虫以及对各种不良环境的抵抗能力。而且多肽Artf2无毒环保， 对环境友好，因此在经济作物和蔬菜等的绿色生产方面有广泛的用途。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种人工合成的基因 artf2及其表达的多肽 Artf2,以及由上述多肽Artf2制得的生物制品在促进植物的生长发育及增产、提高植物的 抗病性、增强植物的抗逆性及驱虫性等方面的应用。
[0008] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是： 一种人工合成基因 artf2,为下列序列之一 ：1)如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2) 将SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加，且与SEQ ID No. 1具有相同编码产物的核苷酸序列。
[0009] 由上述人工合成基因编码的多肽Artf2,具有下列氨基酸序列之一 ：1)如SEQ ID No. 2所示的由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；2)将SEQ ID No. 2所示的 氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与具有如SEQ ID No. 2所示 的氨基酸序列的多肽活性相同的由SEQ ID No. 2序列衍生的多肽。
[0010] 该人工合成基因 artf2可采用化学合成方法或PCR扩增法制备。
[0011] 化学合成基于SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或用PCR方法获得含有SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列或其衍生物，酶切连接该基因 artf2入原核表达载体或真核表达载体， 如pET28a或其他类型的表达载体中。转化重组表达载体进入宿主菌，如：大肠杆菌等，构建 基因表达工程菌。也可将含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列克隆至植物表达载体，在植 物中表达该含SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的多肽等。
[0012] 包含上述基因序列artf2 (S卩，SEQ ID No. 1所示序列）的重组质粒。
[0013] 包含上述基因序列artf2 (S卩，SEQ ID No. 1所示序列）的工程菌。在本发明的一 个具体实施例中，提供了一种包含上述基因序列的大肠杆菌。
[0014] 本发明提供了一种由包含SEQ ID No. 1所示基因序列的工程菌通过发酵制得的多 肽Artf2。从生物体内的器官或分泌物提取多肽的产率低，蛋白水解生产多肽的条件难以控 制，产品多种多样。因此，本发明提供包括小规模的实验室发酵和大规模的工业化发酵两种 方式获得含有SEQ ID No. 2所示序列的多肽Artf2,该方法产率高、获得的产品纯。
[0015] 上述人工合成基因 artf2编码的多肽Artf2在制备生物制品方面的应用。具体如 在制备生物农药、生物肥料等方面的应用。在一个具体实施例中，通过发酵获得具有如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的多肽Artf2或其衍生物，将该多肽Artf2稀释或者是添加其他物 质(如氨基酸、微量元素等，微量元素包括铁、锰、锌等）配制后，用作生物农药或生物肥料等 生物制品，通过喷洒、灌根、浸种等方式，促进植物的生长发育、增产、提高植物抵抗病虫害、 抗逆性等。
[0016] 上述生物制品在下述方面的应用：1)促进植物生长发育；2)促进植物增产；3)提 高植物的抗病性，具体地，包括提高植物对细菌、真菌以及病毒的抗性；4)增强植物的抗逆 性，具体地，包括增强植物的抗干旱、抗冻、抗寒以及抗水涝等抗逆性；5)增强植物的驱虫 性。包括但不限于使用以下方式对植物施以上述生物制品：喷洒、灌根、浸泡种子等方式。 所述生物制品适用于多种植物，包括但不限于以下植物：蔬菜、茶叶、果树、花木、粮食等。
[0017] 一种培育转基因植物的方法，将上述基因序列artf2 (S卩，SEQ ID No. 1所示序列） 导入目的植物，获得转基因植物。
[0018] 按照SEQ ID No. 1所示的基因 artf2的核苷酸序列，设计一对PCR扩增引物，即： 上游引物 Pl :5' - TCGCGGATCCATGGGAGCTTCTCTGCAAAT -3' 下游引物 P2 :5' - CCGCAAGCTTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCA -3' 其中，G/GATCC为引物的BamHl限制酶位切点，A/AGCTT为HindIII限制酶位切点。以 artf2为模板进行PCR扩增。扩增条件：95°C预变形2min30sec，再按照95°C 30sec，58°C 30sec，68°C lmin，程序扩增共30个循环。
[0019] 本发明获得的人工合成基因 artf2,具有SEQ ID No. 1所示序列，其编码区共有 1029核苷酸（SEQ ID No. 1所示序列的最后3个核苷酸taa，是终止密码子，不能翻译氨基 酸)，该基因编码的多肽产物Artf2,无高级结构，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，共有 343个氨基酸残基，分子量为34. 3kda。本发明中将人工设计基因 artf2化学合成后，经PCR 扩增，用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。将纯化产物和经限制性酶EcoRV消化处理的pEV 质粒进行连接，得到pEV-artf2重组质粒。然后用该重组质粒转化大肠杆菌E. coli DH5a， 在加有100mg/L氨苄青霉素（Amp)的LB固体培养基中37°C培养生长，通过选择压筛选出 阳性克隆菌株E.coli DH5a-pEV-artf2。通过该菌株的培养可源源不断地提取得到质粒 pEV-artf2〇
[0020] 将质粒pEV-artf2和pET28a质粒用BamHl和HindIII双酶切，把artf2基因克隆 到pET28a中，得到重组质粒pET28a-artf2。再用这重组质粒转化菌株E. coli JM109(DE3)。 用加有50mg/L卡那霉素（Km)的LB培养基筛选得到阳性克隆的表达工程菌株E. coli JM109 (DE3)-pET28a-artf2,即，含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的工程菌。
[0021] 通过实验室的小规模发酵（50-1000ml三角摇瓶）或者是工业化的大规模发酵(发 酵罐设备）制得含有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽Artf2。在实验室用三角摇瓶 发酵培养工程菌株E. coli JM109 (DE3)-pET28a-artf2,诱导表达多肽产物Artf2,诱导剂 IPTG 终浓度 0· 2mM/L。
[0022] 工业化大规模制备用2吨发酵罐设备。通过供气，补料，调酸碱发酵培养，用IPTG 终浓度0. 5mM/L诱导并制备多肽产物Artf2生物制品。
[0023] 综上所述，本发明如SEQ ID No. 1所示的基因序列artf2及其编码的如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽Artf2,无毒、环保，在促进植物生长发育、增产、提高植物抗 病性、抗逆性及驱虫性等方面应用效果良好，前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为多肽Artf2的电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0026] 本发明所用的质粒和菌株都是商品化购得，其中， 大肠杆菌 E. coli JM109(DE3)，购自 Promega 公司； 大肠杆菌E. coli DH5a购自北京博迈德科技发展有限公司； PEV质粒由北京普尔普乐生物技术有限公司提供； pET28a质粒购自Promega公司； 本申请发明人人工设计的基因 artf2 (如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列）由北京 普尔普乐生物技术有限公司用化学合成的方法合成，具体采用先进的PCR的两步DNA合 成法（PCR-based two-step DNA synthesis (PTDS))，该方法已在 A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences. Xiong AS et al. (2004a)文献中有详尽的描述，在此不再一一赞 述。该合成的基因 artf2经ABI公司的3730XL测序仪测序，其核苷酸序列与SEQ ID No. 1 所示的序列相一致。
[0027] 实施例1 基因 artf2的PCR扩增及纯化 按照SEQ ID No. 1所示的基因 artf2的核苷酸序列，设计一对PCR扩增引物，即： 上游引物 Pl :5' - TCGCGGATCCATGGGAGCTTCTCTGCAAAT -3' 下游引物 P2 :5' - CCGCAAGCTTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCA -3' 其中，G/GATCC为引物的BamHl限制酶位切点，A/AGCTT为HindIII限制酶位切点。以 artf2为模板进行PCR扩增。扩增条件：95°C预变形2min30sec，再按照95°C 30sec，58°C 30sec，68°C lmin，程序扩增共30个循环。扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
[0028] 实施例2 artf2基因克隆菌株的构建 对实施例1中的PCR扩增纯化产物和经限制性酶EcoRV消化的pEV克隆载体进行连接， 得到pEV-artf2质粒。然后用该重组质粒转化大肠杆菌E. coli DH5a，通过在加有IOOmg/ L氨苄青霉素（Amp)的LB固体培养基中37°C培养生长，通过选择压筛选出阳性克隆菌株 E. coli DH5a-pEV_artf2。通过该菌株的培养可源源不断地提取得到质粒pEV_artf2。
[0029] 实施例3 artf2基因表达工程菌株的构建 将质粒pEV-artf2和pET28a质粒用BamHl和HindIII双酶切，把artf2基因克隆到 pET28a中，得到重组质粒pET28a-artf2。再用这重组质粒转化E. coliJM109 (DE3)，用加 有50mg/L卡那霉素（Km)的LB培养基筛选得到阳性克隆的表达工程菌株E. coliJM109 (DE3) -pET28a-artf2〇
[0030] 实施例4 artf2基因的表达及多肽产物Artf2检测 将表达工程菌株E. coli JM109 (DE3) -pET28a-artf2在加有Km 50mg/L的LB液体培 养基中37°C震动培养至吸光值0D600=0. 7,加入诱导剂IPTG到终浓度0. 5mM，继续培养4小 时。8000rpm离心5分钟，收集菌体超声波破碎，12% SDS_PAGE凝胶电泳。凝胶经考马斯亮 蓝染色后，胶版的样品泳道有一条显著的34. 3kda条带。如图1所示为artf2基因表达产 物多肽Artf2的条带，图中： 泳道2 :标准蛋白，分子量从下往上依次为14. 4、20、31、43、66. 2、97. 2kda ; 泳道3 :标准蛋白，分子量为66. 2和97. 2kda ; 泳道1及泳道4-7 :不同稀释度的多肽Artf2,以泳道7的发酵液为1个单位浓度，泳道 1为1/2浓度发酵液，泳道4为1/6浓度发酵液，泳道5为1/4浓度发酵液，泳道6为1/8浓 度发酵液。
[0031] 实施例5 多肽Artf2的发酵制备及纯化 发酵制备可分为实验室小量发酵制备和工业化大规模发酵制备 5. 1实验室制备：将表达工程菌种E. coli JM109 (DE3) -pET28a-artf2平皿划线培养 过夜，挑选生长良好的单菌落接种到50ml或IOOOml三角瓶的液体培养基中，37°C、200rpm 振荡培养12h，加终浓度0. 2mM IPTG诱导4小时。培养液经8000rpm离心5min，收集沉淀 的菌体，加缓冲液超声波破碎，再离心去细胞碎片，得到较高纯度的多肽Artf2。
[0032] 5. 2工业化大规模发酵制备：采用二级或三级发酵程序，在发酵罐中加入70%体积 的发酵培养基：每升含葡萄糖15克，酵母和蛋白胨浸提物20克，硫酸镁0. 5克，磷酸二氢 钾1克，磷酸氢二钾12克，PH7. 2,灭菌30分（120°C，I. IMPa)。按4%体积比接入菌种液， 37 °C发酵，溶氧（DO)控制在30%左右，氨水调节pH在7. 0左右。当工程菌进入对数生长后 期，加入诱导剂IPTG至0. 5mM，再诱导发酵4小时放罐。发酵液经85°C 10分钟灭活菌体， 快速降温并用高压均质破碎机破碎，添加98%的非活性物质(包括铁、锰、锌等微量元素以 及氨基酸)，制成多肽Artf 2生物制品。
[0033] 实施例6 多肽Artf2生物制品的使用方法及效果 上述实施例5制备的多肽Artf2生物制品可用于植物，尤其是农林蔬果方面大面积使 用，使植物的生长发育、产量、抗病性、抗逆性、驱虫性等方面均得到有效提高及增强。
[0034] 以下各项试验中，实验组（即采用了多肽Artf2生物制品或多肽Artf2生物制品的 稀释液）提及的各项性能的提高均是相对于对照组而言，如无特别说明，对照组均是指的采 用与实验组相同的方法作用于植物，只是将多肽Artf2生物制品替换成清水。
[0035] 6. 1叶面喷洒：在作物生长期都可使用。将本多肽生物制品配成稀释200-300倍 溶液（多肽Artf2含量约20-30 mg/L)，喷施叶面，每三周一次。可增加植物根茎叶产量 10-30%，提高产量10-25%。其中：大白菜经3次喷洒后长势良好，叶片肥嫩，增产30% ;玉米 幼苗在3片眞叶时喷洒，10天后，平均株高比对照组玉米幼苗高8-12厘米，产量高出16% ; 蚕豆幼苗喷施后，提前一周开花，座果率提高8-12%，且驱蚜虫效果明显；茶树每2周喷施一 次，促使侧芽大量萌发，提高了茶叶产量，增加茶叶的采收次数，另外喷施了本生物制品的 茶叶不长小叶螨，不仅增加了茶农销售茶叶的收入，而且减少了农药的使用，降低了生产成 本；桑树每2周喷一次，桑葚肥大甜美，桑叶产量增加14% ;长满蚜虫、叶片不能正常展开的 花椒，在喷施本多肽制品的一周左右，蚜虫绝大多数消失，叶片恢复生长；大棚里的蔬菜(西 红柿和黄瓜）在喷施本品后，红蜘蛛明显减少，降低了病毒病的发生几率。
[0036] 6. 2植物灌根：采用灌根效果明显，使用浓度为将本生物制品稀释200-300倍的溶 液。玉兰，迎春等经灌根后生长速度提高30%，不长蚜虫，叶片大而厚，枝叶繁茂，开花期提 前，花期增长；大枣灌根后座果率增加，裂果减少，果实品质大幅度提高；对发生早期炭疽 病的柑橘树灌根后，控制了炭疽病的继续蔓延，产量没有受到影响；葡萄在发芽和结果的整 个生长期，灌根3-5次，除定期浇水外，不再进行其他管理，葡萄产量不仅没有低于正常管 理的对照组，而且葡萄的品质提高，甜度增加；兰棚里的盆栽兰花每隔15-20天灌根一次， 茎腐病和软腐病几乎不会发生，且对介壳虫的防治效果优于某种触杀性的化学农药。兰花 叶色深绿，叶面油亮有光泽，商品性增强，大大地提高了养兰者的经济效益。落地生根、矮牵 牛经灌根，叶片明显变大变厚，生长速度提高50%以上。
[0037] 6. 3浸种拌种：以本多肽生物制品100-200倍稀释液浸种2-4小时。种子经处理 后，出苗整齐、根好苗壮，抗病能力显著增加。例如玉米种子经多肽Artf2浸种，出芽率几乎 达100%，而对照组的出芽率只有80%，而且幼苗的生长速度和成活率也明显高于对照。
[0038] 6. 4植物抗干旱：将玉米种子发芽长出2片真叶，喷洒多肽生物制品200-300倍稀 释液，2周后停止浇水。10天后对照组(采用与实验组相同的方式，一组对照为采用清水喷 洒、一组对照为采用培养基喷洒）的植株萎蔫而实验组植株挺拔，继续停止浇水，待实验组 也发生萎蔫现象后，恢复浇水，实验组大部分植株由萎蔫变为挺拔，恢复生长，而两组对照 组几乎全部倒苗，表明该多肽制品抗干旱效果明显。
[0039] 6. 5植物抗病毒：烟草幼苗喷洒3次生物制品200-300倍稀释液，90%以上植株没 感染花叶病毒，而对照组只有45%没感染花叶病毒。
[0040] 6. 6提高植物抗逆性：植物喷施本多肽生物制品200-300倍稀释液后，对不良环境 的抵抗能力显著增强。例如喷施本多肽生物制品200-300倍稀释液的小麦遭遇干热风后， 产量非但没有减少反而增产8%左右；喷施本多肽生物制品200-300倍稀释液的大豆被冰雹 砸坏后，不补苗，其产量和其他没有施用该生物制品而补苗的大豆产量仍然不相上下。说明 多肽Artf2生物制品对提高植物的抗逆性有着良好的作用。
【权利要求】
1. 一种人工合成基因 artf2,为下列序列之一 ：1)如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列； 2)将SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加，且与SEQ ID No. 1具有相同编码产物的核苷酸序列。
2. 由权利要求1所述人工合成基因 artf2编码的多肽Artf2,具有下列氨基酸序列之 一 ：1)如SEQ ID No. 2所示的由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；2)将 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与具有 如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽活性相同的由SEQ ID No. 2序列衍生的多肽。
3. 如权利要求1所述的人工合成基因 artf2在以下方面的应用：1)促进植物生长发 育；2)促进植物增产；3)提高植物的抗病性；4)增强植物的抗逆性；5)增强植物的驱虫性； 6)转基因植物培育。
4. 包含权利要求1所述基因序列artf2的重组质粒。
5. 包含权利要求1所述基因序列artf2的工程菌。
6. 如权利要求2所述的多肽Artf2在制备生物制品方面的应用。
7. -种由权利要求2所述的多肽Artf2制得的生物制品。
8. 如权利要求7所述的生物制品在下述方面的应用：1)促进植物生长发育；2)促进植 物增产；3)提高植物的抗病性；4)增强植物的抗逆性；5)增强植物的驱虫性。
9. 一种培育转基因植物的方法，其特征在于，将如权利要求1所述基因序列导入目的 植物，获得转基因植物。
【文档编号】C12N15/11GK104212797SQ201410477638
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】张世瑜, 郭鲁宏 申请人:张世瑜, 郭鲁宏