专利名称：合成的hiv gag基因的制作方法
有关申请的相互参照条目无关于联邦资助的R&D的声明无缩微胶片附录的参考文献无发明领域HIV疫苗发明背景人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是获得性人免疫缺陷综合征(AIDS)和有关疾病的致病因子。HIV-1是逆转录病毒家族的RNA病毒，并呈现所有逆转录病毒具有的5’LTR-gag-pol-env-LTR3’结构。另外，HIV-1包含少量具有调节或未知功能的基因，包括tat和rev基因。env基因编码病毒包膜糖蛋白，该包膜糖蛋白先被翻译成为160千道尔顿(kDa)的前体(gp160)，然后细胞蛋白酶将其切割，产生外部120kDa的包膜糖蛋白(gp120)和跨膜的41kDa包膜糖蛋白(gp41)。gp120和gp41仍然保持连接并出现在病毒颗粒和HIV感染的细胞表面上。gp120结合存在于辅助T淋巴细胞、巨噬细胞和其它靶细胞表面上的CD4受体。在gp120结合CD4后，gp41介导引起病毒进入的融合过程。
当病毒颗粒上的gp120结合T4淋巴细胞或其它靶细胞表面的CD4受体时，感染就开始了。已结合的病毒与靶细胞融合，并将其RNA基因组逆转录为细胞的双链DNA。病毒DNA整合入该细胞核中的遗传物质中，在该细胞核中病毒DNA指导产生新的病毒RNA、病毒蛋白以及新的病毒颗粒。新的病毒颗粒从所述靶细胞膜芽生，并感染其它细胞。
T4淋巴细胞是免疫防御的关键，T4淋巴细胞破坏是进行性免疫功能障碍的主要原因，进行性免疫功能障碍是HIV感染的标志。丧失靶细胞使机体抗大多数入侵者的能力严重受损，但是它特别严重影响对病毒、真菌、寄生虫和某些细菌包括分枝杆菌的防御。
HIV-1通过复制、由其感染的细胞芽生并破坏细胞膜，从而杀伤其感染的细胞。HIV-1可以借助于出现在受感染细胞表面的病毒gp120，间接杀伤靶细胞。因为T细胞上的CD4受体与gp120的亲和力强，所以表达CD4受体的健康细胞可以结合gp120，并与受感染的细胞融合形成合体细胞。
HIV-1也可以引发针对受感染细胞的正常细胞免疫防御。在有或无抗体的辅助下，细胞毒防御细胞可以破坏其表面出现病毒蛋白的受感染细胞。最后，游离的gag和gp120蛋白可以在HIV-1感染个体的血液中循环。游离的gp120蛋白可以结合未感染细胞的CD4受体，使其看来被感染似的并诱发免疫应答。
HIV-1感染几乎总是致死性的，而目前没有HIV-1感染的治愈方法。仍然没有可用的预防HIV-1感染的有效疫苗。因为活的减毒病毒存在逆转录或感染的危险，活的减毒病毒可能不能用作疫苗。大多数亚单位疫苗方法预防HIV感染还不成功。对HIV-1感染的治疗在延长某些受感染患者生命的同时，具有严重的副作用。因此，迫切需要有效的治疗方法和疫苗以克制这种致死性感染。
疫苗接种是疾病预防的有效形式，并已证明对抗几种类型的病毒感染是成功的。确定提呈HIV-1抗原给人免疫系统以诱发保护性体液免疫和细胞免疫的途径，是一项困难的任务。到此为止，试图产生有效HIV疫苗的努力还未成功。在AIDS患者，仅存在低水平的游离病毒。通过融合和形成合体细胞的细胞与细胞的相互作用加强了HIV-1的传播。因此，产生的抗游离病毒或病毒亚单位的抗体在消除病毒感染的细胞方面一般是无效的。
疫苗利用机体“记忆”抗原的能力。在免疫系统首次与某种抗原接触后，产生终生保持该抗原免疫记忆的细胞。随后再暴露于该抗原刺激免疫应答，结果是消除病原体或使病原体灭活。
免疫系统以两种方式处理病原体体液应答和细胞介导的应答。在体液应答中，淋巴细胞产生结合该抗原并由此使该病原体灭活的特异性抗体。细胞介导的应答涉及特异性攻击以及破坏受感染细胞的细胞毒T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞。
用HIV-1病毒开发疫苗存在问题，因为HIV-1感染该疫苗需要在免疫系统中激活的某些相同细胞(即T4淋巴细胞)。开发在免疫系统损害发生之前使HIV-1灭活的疫苗是有利的。特别合适的HIV疫苗类型将产生抗HIV免疫应答，该免疫应答识别HIV变异体并在处于其感染初期的HIV阳性个体发挥作用。
开发抗病毒尤其是诸如人免疫缺陷病毒的具有高突变率的病毒的疫苗，希望该疫苗诱发针对该病毒的中和性以及保护性免疫应答，开发这种疫苗的一个主要问题是，不同病毒分离物或病毒株的病毒包膜蛋白的多样性。由于小鼠和人类的细胞毒T淋巴细胞(CTL)均能识别由保守的病毒内蛋白产生的表位，并且人们认为细胞毒T淋巴细胞在抗病毒免疫应答中是重要的，因此努力的方向是开发能够针对不同的病毒株提供异源保护的CTL疫苗。
已知当CD8+CTL的T细胞受体识别与MHC I类分子结合的病毒肽时，杀伤病毒感染的细胞。所述病毒肽产生自内源合成的病毒蛋白，不管该蛋白在病毒中的位置或功能。因此通过识别保守的病毒蛋白的表位，CTL可以提供交叉病毒株保护。能够与MHC I类分子结合、用于CTL识别的肽源自存在于或透过胞质或内质网的蛋白。一般来说，进入内体加工途径(诸如在由MHC II类分子提呈抗原的情况下)的外源蛋白在产生CD8+CTL应答方面是无效的。
为产生CTL应答的大多数努力已采用复制型载体，以在细胞内产生蛋白抗原，或集中在将肽导入细胞溶胶。这些方法的限制是可能降低其作为疫苗的效用。逆转录病毒载体在可以作为融合蛋白表达、同时保持重组病毒复制能力的多肽的大小和结构方面有限制，而对载体本身的免疫应答可能使诸如用于后续免疫接种的牛痘的载体效力受损。另外，病毒载体和修饰的病原体也有可能妨碍其用于人类的固有危险性。此外，选择待提呈的肽表位取决于个体MHC抗原的结构，因此由于杂交繁殖群体中的MHC单倍型多样性，肽疫苗可能具有有限的效力。
Benvenisty，N.和Reshef，L.[PNAS 83，9551-9555，(1986)]表明，腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)或肌内(i.m.)注射引入小鼠的CaCl2沉淀的DNA可以表达。在小鼠中，肌内注射未用CaCl2处理的DNA表达载体使得肌肉细胞摄取DNA并表达该DNA编码的蛋白。质粒保持游离并且不复制。结果是，在肌肉注射入大鼠、鱼和灵长类动物的骨骼肌和大鼠心肌后观察到持续的表达。WO90/11092(1990年10月4日)中报道了用核酸作治疗药物的技术，其中裸露的多核苷酸用来给脊椎动物接种疫苗。
肌肉内免疫不是上述方法成功所必需的。将包被编码人生长激素(HGH)的DNA的金微粒引入小鼠皮肤，使得在小鼠中产生抗-HGH抗体。一种喷射注射器已经用来转染活动物的皮肤、肌肉、脂肪和乳房组织。已经综述了引入核酸的各种方法。Zhu等(Science 261209-211(1993年7月9日)]表明，在小鼠中静脉注射DNA阳离子脂质体复合物导致系统表达克隆的转基因。Ulmer等[Science2591745-1749，(1993)]报道，通过肌内注射编码流感病毒蛋白的DNA，达到针对不同的流感病毒感染提供异源保护。
本发明满足了对特异性治疗剂和预防剂的需要，所述治疗剂和预防剂能够诱发针对病原体和肿瘤抗原的所需免疫应答。诱导T细胞免疫应答的能力在该治疗方法中特别重要，所述T细胞免疫应答可以预防感染或甚至由与获得所述抗原基因的病毒株不同的病毒株引起的疾病。当处理HIV时这种T细胞免疫应答特别重要，因为已经认识到HIV病毒快速突变，并已鉴别了许多有毒分离物[参见例如，LaRosa等，Science 249932-935(1990)，鉴别245个独立的HIV分离物]。根据这种识别的多样性，研究人员已经试图产生基于肽免疫的CTL。因此，Takahashi等[Science 255333-336(1992)]报道，诱导识别HIV包膜(gp160)决定簇的广泛交叉反应性细胞毒T细胞。然而，这些研究者认识到获得真正交叉反应性CTL应答的困难，并提出在非常严格的引发或再刺激T细胞和由已被刺激的CTL引发效应细胞功能(包括细胞毒性)之间存在二岐分枝(dichotomy)。
Wang等报道，在小鼠中通过用克隆的基因组(未剪接的)HIV基因肌肉内接种，诱发抗HIV的免疫应答。然而，在这些研究中获得的免疫应答水平非常低。另外，上述Wang等的论文还报道，DNA构建物采用编码邻接的Tat/rev-gp160-Tat/rev编码序列的HIV必需基因组片段。如下祥述，对于获得gp160的高水平表达这是一种次优系统。因为表达Tat引起Kaposi肉瘤进一步发展，所以该系统也具有潜在危险。
WO93/17706描述了抗病毒接种动物的方法，其中用基因构建物包被载体颗粒，使包被的颗粒加速进入动物细胞。关于HIV，推荐使用减去长末端重复序列的基本上完整的基因组。那种方法对接受者非常危险。一般认为，HIV构建物应该含约50％以下的HIV基因组以确保所述疫苗的安全性，这就保证已去除酶部分和病毒调节蛋白，其中许多具有未知或甚少了解的功能。因此，假如由基因传递技术产生出有用的人HIV疫苗，则仍然存在很多问题。
本发明设想任何一种用于将多核苷酸导入活组织、以诱导表达蛋白的已知方法。然而，本发明提供一种新的免疫原，用于将HIV和其它蛋白引入抗原加工途径，以有效产生HIV特异性的CTL和抗体。这种药物作为疫苗有效诱导细胞和体液的抗HIV和中和HIV的免疫应答。在本发明中，提出了上述问题，并通过提供多核苷酸免疫原解决了这些问题，所述多核苷酸免疫原当导入动物时，指导HIV蛋白和表位的有效表达，而没有与这些方法伴随的附带危险。由此产生的免疫应答有效识别HIV、抑制HIV复制、鉴别并杀伤HIV感染的细胞，而且该免疫应答对许多HIV病毒株是交叉反应的。
生物体的密码子配对是高度非随机的，并且生物体之间互不相同。利用这种信息来构建和表达具有需要水平翻译效率的改变的或合成的基因，以便确定基因组中的哪些区域是蛋白编码区，以便将翻译终止位点导入异源基因以及确定核苷酸序列的关系或遗传起源。
目前在转化生物体中表达外源性异种基因是平常的。无数哺乳动物基因，包括例如鼠和人基因，已经成功插入单细胞生物。在这方面的标准技术包括将待表达的外源基因导入诸如质粒或噬菌体的载体中，以及采用该载体将所述基因插入生物体。通常用与所述基因插入的宿主匹配的强启动子取代这类基因的天然启动子。蛋白测序仪可以测定甚至极微量天然蛋白的氨基酸序列。从这些氨基酸序列可以推导出编码这些蛋白的DNA序列。DNA合成也是一个迅速发展的领域，可以容易地构建相应于那些推导的DNA序列的合成基因。
尽管对表达系统和重组DNA的认识不断发展，但当人们试图在生物体中表达一种外源或合成基因时，仍然存在严重的障碍。许多天然的活性蛋白进行例如糖基化的方式与其在外源宿主中表达时发生的方式不同。为此，对于表达许多哺乳动物基因，诸如酵母的真核生物宿主可能优于细菌宿主。糖基化问题是继续研究的课题。
另一个问题更少了解。通常，即使合成基因与强启动子偶联时，其翻译比预期的效率低得多。对表达生物体外源性的外源基因的情况通常也如此。即使当该基因以产生可回收量翻译产物的足够有效的方式转录时，所述蛋白常常是无活性的或者其性质与天然蛋白不同。
认识到后一个问题常常是由于在不同生物中蛋白折叠不同引起的。解决该问题是困难的，而控制蛋白折叠的机制了解得非常少。
人们认为有关翻译效率的问题与密码子前后效应有关。在所有生物中基因的蛋白编码区遭受各种各样的功能限制，其中某些限制取决于编码正常功能蛋白的条件以及合适的翻译起始和终止信号。然而，已经鉴别了几种蛋白编码区的特征，根据这些限制不容易理解所述特征。两类重要的这类特征是涉及密码子选择和密码子前后效应(codon context)的特征。
已知密码子使用是高度偏倚的，不同生物之间显著不同。已经表明密码子选择型与同工tRNA的相对丰度有关。编码高丰度与低丰度蛋白的基因显示其密码子偏倚不同。已经广泛讨论了密码子选择偏倚改变肽延伸率的可能性。尽管密码子选择的差异与翻译率的差异有关，但难以证实密码子选择对翻译的直接影响。提出的其它密码子选择型的限制因素包括最大化翻译保真度和最适化蛋白合成动力学效率。
除了密码子的非随机选择外，已经积累的大量证据是，密码子/反密码子识别受密码子本身以外的序列影响，该现象称为“密码子前后效应”。邻近核苷酸强烈影响无义密码子以及错义密码子的抑制效率。清楚的是，天然细菌群体中抑制基因活性的丰度以及使用“终止”密码子编码硒代半胱氨酸和磷酸丝氨酸，需要终止为前后序列依赖性的。已经表明类似的前后效应影响翻译保真度以及翻译起始效率。
对大肠杆菌蛋白编码区的统计学分析证实另一种表现的“密码子前后效应”。在一个位置存在的特定密码子强烈影响邻近密码子中某些核苷酸的出现频度，这些前后序列的限制对于高水平与低水平表达的基因显著不同。虽然已经认识这种前后效应，但是关于邻近密码子的优选核苷酸的统计规律的预期值相当低。这限制了这种核苷酸优选数据用于选择密码子以达到需要水平的翻译效率效用。
自动核苷酸测序仪的出现使得可利用各种生物的大量序列数据。理解这些数据存在巨大困难。例如，为了将遗传序列数据与蛋白序列联系起来，重要的是鉴定基因组的编码区。另外，某些生物的基因组起源极其重要。已知某些生物的基因组具有混合祖先。某些来源于病毒的序列现在稳定地掺入真核生物的基因组。所述病毒序列本身可能源自基本上无关的另一物种。在得出有关基因和它们在其它生物中翻译产物之间恰当的相似性方面，了解一种基因的祖先可能是重要的。
需要更好地了解密码子前后效应对翻译的影响，以及需要确定任何所需翻译效应的合适密码子的方法。也需要根据核苷酸序列数据鉴定基因组编码区的方法。也需要控制蛋白折叠和确保外源基因在宿主表达时正确折叠的方法。根据所需翻译效率改变或构建的基因将具有重要价值。
用于微生物表达具有工业和药用价值蛋白的重组DNA技术实践的另一方面是“密码子选择”现象。尽管较早注意到，在遗传转化的宿主细胞中用于基因表达的现有机器将“发挥作用”以构建给定的所需产物，但在微生物获得的表达水平可能发生巨大变异，部分取决于在插入的外源基因中存在的氨基酸特化的遗传密码的具体可选择形式。四种可能的核苷酸碱基的“三联”密码子可以有64种不同变化形式。这些形式提供仅20种不同氨基酸的信息(以及转录起始和终止信息)意味着某些氨基酸可以由一种以上的密码子编码。实际上，某些氨基酸有多达6种“丰余”可选择的密码子，而某些其它氨基酸具有单一的必需密码子。由于不完全了解的原因，可选择的密码子并不均一地出现于不同类型细胞的内源DNA中，似乎在某些类型细胞中存在部分密码子的可变天然序位或“优选”。
作为一个例子，氨基酸亮氨酸由6种DNA密码子确定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG(分别相应于mRNA密码子CUA、CUC、CUG、CUU、UUA和UUG)。微生物基因组密码子频率的全面分析表明，大肠杆菌的内源DNA最常见含有CTG亮氨酸确定密码子，而酵母和粘菌DNA最常见含有TTA亮氨酸确定密码子。根据该序位，一般人们认为，用大肠杆菌宿主获得高水平表达富含亮氨酸的多肽的可能性，某种程度上取决于密码子选择频率。例如，富含TTA密码子的基因极可能在大肠杆菌中表达差，而富含CTG的基因可能高表达该多肽。同样，当酵母是表达富含亮氨酸多肽的预定转化宿主细胞时，用于插入的DNA中的优选密码子将是TTA。
关于重组DNA技术的密码子优选现象的意义是明显的，该现象可以用来解释先前为了在成功转化的宿主生物中获得高水平表达外源基因的许多失败——较少“优选的”密码子可以重复存在于插入的基因中，用于表达的宿主细胞机器可能不能有效发挥作用。该现象提示，已经设计包含预定宿主细胞优选密码子的合成基因，提供用于实践重组DNA技术的一种优选形式的外源遗传物质。
代表真核细胞特征的功能多样性取决于其膜边界的结构分化。为了产生和保持这些结构，蛋白质必需从其内质网的合成部位转运到整个细胞中的预定位置。这需要运输蛋白发出分选信号，由位于主要转运途径的入口点、负责途径选择的分子机器识别该信号。当大多数蛋白通过其生物合成途径时需要仅作出一次分选决定，因为其最终目的地——其行使功能的细胞位置是其永久仃留位置。
保持细胞内的完整性部分取决于选择性分选以及蛋白质准确转运到其正确的目的地。在过去几年中，已经强有力地研究了寻靶分子机器的解剖和蛋白的定位。已经鉴定了蛋白上确定的序列基元，所述基元可以用作“地址标记”。诸如来自组织特异性血纤溶酶原激活蛋白tPA的前导肽或信号肽，用来通过内质网和高尔基器将蛋白转运到细胞分泌途径。已经发现很多分选信号与诸如二亮氨酸基元或酪氨酸为基础的序列的膜蛋白的胞质域相关，所述胞质域可以将蛋白质导向溶酶体区室。对于HIV，从细胞转运和挤出病毒颗粒，取决于gag氨基末端的第二个甘氨酸残基的豆蔻酰化。发明概述提供编码HIV gag和修饰的HIV gag的合成DNA分子。所述合成分子的密码子包括预定宿主细胞的优选密码子。所述合成分子提供优选形式的外源遗传物质。所述合成分子可以用作一种多核苷酸疫苗，该疫苗通过中和抗体和细胞介导的免疫提供对HIV感染的有效免疫预防。本发明提供多核苷酸，当所述多核苷酸直接导入脊椎动物(包括诸如灵长类和人类的哺乳动物)体内时，在动物体内诱导表达所编码的蛋白。附图简述
图1显示在用HIV gag DNA转染后，293细胞系转染体中的gag和tPA gag的相对表达。
图2显示优化HIV gag和tPA-gag DNA疫苗在小鼠中介导的血清抗-gag应答。
图3显示用优化HIV gag或tPA-gag DNA接种后从小鼠获得的脾细胞的抗-gag CTL应答。
图4显示用优化HIV gag或tPA-gag DNA接种后从小鼠获得的脾细胞的gag抗原特异性细胞因子分泌。
图5显示从用HIV p55 gag DNA接种的小鼠获得的抗HIV gagCTL。发明详述提供编码HIV gag的合成DNA分子和编码修饰形式HIV gag的合成DNA分子。设计所述合成分子的密码子以便使用预定宿主细胞优选的密码子。所述合成分子可以用作一种多核苷酸疫苗，该疫苗通过中和抗体和细胞介导的免疫对HIV感染提供有效的免疫预防。所述合成分子可以用作免疫原性组分。本发明提供多核苷酸，当所述多核苷酸直接导入脊椎动物体内，包括诸如灵长类和人类的哺乳动物，在动物体内诱导表达所编码的蛋白。
本文所用的多核苷酸是含有必需调节元件的核酸，使得在导入活的脊椎动物细胞时能够指导细胞机器产生由包含该多核苷酸的基因编码的翻译产物。在本发明一个实施方案中，所述多核苷酸是包含至少一种操作性连接至转录启动子的HIV基因的多脱氧核糖核酸。在本发明的另一实施方案中，该多核苷酸疫苗(PNV)包含编码至少一种HIV基因的多核糖核酸，所述基因适合于由真核细胞的细胞机器(核糖体、tRNA和其它翻译因子)翻译。该多核苷酸编码的蛋白是一种在动物正常情况下不会产生、只在病理情况下产生的蛋白(即异源蛋白)，诸如与人免疫缺陷病毒(HIV)——获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体相关的蛋白，在这种情况下激活所述动物免疫系统以起动保护性免疫应答。因为这些外源蛋白由所述动物的组织产生，所以表达的蛋白以类似于发生相关生物(HIV)实际感染的方式、由主要组织相容性系统(MHC)加工。正如本说明书所示，结果是诱导免疫应答对抗有关病原体。
因此，本发明人已经制备了核酸，当其导入生物系统时诱导表达HIV蛋白和表位。所诱导的抗体应答是所表达HIV蛋白特异性的，并中和HIV。此外，诱导特异性识别并破坏HIV感染的细胞的细胞毒T淋巴细胞。
本发明提供使用多核苷酸的方法，该多核苷酸在导入哺乳动物组织时，在体内单一细胞中诱导不连续基因产物的表达。本发明提供一个不同的解决方法，不需要多步操作rev依赖性HIV基因，以获得rev非依赖性基因。本文所述rev非依赖性表达系统以其右向时是有用的，并是一种用于证实在活体单一细胞中表达所需单一基因产物的系统。
因为本发明的许多应用应用于抗病毒疫苗接种，所以所述多核苷酸常常被称为多核苷酸疫苗或PNV。这并不是说，认为这些多核苷酸在免疫刺激和抗肿瘤治疗中的其它用途不在本发明范围内。
在本发明的一个实施方案中，将编码一种HIV基因产物的基因掺入表达载体中。该载体含有为真核RNA聚合酶识别的转录启动子和HIV基因编码序列末端的转录终止子。在优选实施方案中，所述启动子是具有内含子A序列的巨细胞病毒启动子(CMV-intA)，尽管本领域技术人员会认识到，可以使用无数诸如强免疫球蛋白的其它已知启动子或其它真核生物基因启动子中的任何一种。优选的转录终止子是牛生长激素终止子。特别优选联合的CMVintA-BGH终止子。
为了便于在原核细胞中制备所述多核苷酸，一种抗生素抗性标记也最好包含于该表达载体中，置于一种原核启动子的转录控制下，使得在真核细胞中不表达所述抗生素。可以使用氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因和其它药学可接受的抗生素抗性标记。为了有助于在原核生物中通过发酵高水平地生产所述多核苷酸，含有原核生物复制起点和具有高拷贝数的载体是有利的。许多市售的原核克隆载体具有这些优势。最好是去除非必需DNA序列。也希望该载体不能在真核细胞中复制。这使得多核苷酸疫苗序列整合入接受者基因组的风险降到最小。无论什么时候希望将多核苷酸的表达限制于特定组织类型，都可以使用组织特异性启动子或增强子。
在一个实施方案中，使用表达载体pnRSV，其中劳氏肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列(LTR)用作启动子。在另一实施方案中，使用CMV启动子和BGH转录终止子克隆入其中的突变型pBR322载体——V1。在另一实施方案中，已经将V1和pUC19的元件结合，产生称为V1J的表达载体。将一种HIV基因克隆入V1J或另一种需要的表达载体，所述HIV基因例如gp120、gp41、gp160、gag、pol、env或任何其它可以诱导抗HIV免疫应答的HIV基因。在另一实施方案中，从V1J去除氨苄青霉素抗性基因并用新霉素抗性基因替代，产生V1J-neo，已经将不同HIV基因克隆入V1J-neo中，用于按照本发明的使用。在另一实施方案中，所述载体是V1Jns，该载体与V1Jneo相同，例外的是唯一的Sfil限制性位点已经在V1J-neo的第2114位点工程入单一的Kpn1位点。在人基因组DNA中Sfil位点的发生率非常低(大约每100,000个碱基有1个位点)。因此，该载体仅仅通过用Sfil消化提取的基因组DNA，对表达载体整合入宿主DNA提供仔细的监测。在再一改进实施方案中，所述载体是V1R。在该载体中，从该载体“剪去”尽可能多的非必需DNA，以产生高度压缩的载体。该载体是V1Jns的衍生体。该载体允许使用较大插入片段，较少考虑编码不需要的序列以及优化细胞摄取。
本发明的一个实施方案掺入编码得自HIV实验室适应型病毒株的HIV gag的基因，所述病毒株例如IIIB或CAM-1病毒株。本领域技术人员知道，使用得自其它HIV-1病毒株或功能类似HIV-1基因的HIV-2病毒株的基因，应该预期产生类似于本文关于HIV-1构建物所述的免疫应答。本领域技术人员已知获得这些基因的克隆以及操作方法。
目前许多HIV病毒株的许多基因序列是可以在GENBANK上公开获得，而这类原始的HIV现场分离物可从与Quality Biological，Inc.[7581 Lindbergh Drive，Gaithersburg，Maryland 20879]签定合同制备这些可用病毒株的National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)获得。这类病毒株也可以从世界卫生组织(WHO)[Network forHIV Isolation and Characterization，Vaccine Development Unit，Office ofResearch，Global Programme on AIDS，CH-1211 Geneva 27，Switzerland]获得。本领域技术人员从这些工作将认识到，本发明用途之一是提供体内以及体外测试和分析系统，以便了解HIV序列多样性与HIV中和血清学的关系以及其它数据。HIV病毒株原始分离物的基因掺入提供了免疫原，该免疫原诱导抗所述病毒临床分离物的免疫应答，并由此满足该领域仍未获得解决的需要。此外，随着该有毒分离物的改变，可以修饰该免疫原以反映必需的新序列。
为了保持术语一致性，本文描述多核苷酸免疫原构建物遵循以下常规“载体名-HIV病毒株—基因—其它元件”。加入所述构建物的其它元件下面再详细描述。随着所述病毒致病株的改变，可以改变最适掺入药物的明确基因。然而，如下证实，因为诱导了能够保护抵抗异种病毒株的CTL应答，所以与基于整个病毒或亚单位多肽的疫苗相比，该病毒株的变异性在本发明的免疫原和疫苗中不那么重要。另外，因为容易操作该药物以插入新基因，所以这是通过分子生物学标准技术容易实施的调整。
本文所用的术语“启动子”是指RNA聚合酶连接其上的DNA链上的识别位点。该启动子与RNA聚合酶形成起始复合物，以启动和驱动转录活动。可以用称为“增强子”的激活序列或称为“沉默子”的抑制序列修饰该复合物。
本文所用的术语“前导序列”是指结构基因的5’端、与该基因一起转录的DNA序列。该前导序列通常产生具有有时称为前序列(pro-sequence)的N末端肽延伸的蛋白。对于预定分泌到细胞外基质或者膜的蛋白，一般为疏水性的该信号序列指引该蛋白进入内质网，由内质网释放到合适目的地。
本文所用的术语“内含子”是指出现于基因中间、不编码基因产物氨基酸的DNA部分。切出该内含子的前体RNA，因此使其不能转录成为mRNA，也不能翻译成为蛋白质。
术语“盒”是指含有待表达核酸序列的本发明序列。该盒概念上类似于盒式磁带。每个盒具有其自身的序列。因此通过交换该盒，载体将表达不同序列。因为在5’末端和3’末端有限制性位点，该盒可以容易地插入、去除或用另一种盒替代。
术语“3’非翻译区”或“3’UTR”是指在结构基因3’末端、通常与该基因一起转录的序列。该3’UTR区通常含有多聚A序列。尽管该3’UTR从DNA转录，但是在翻译成为蛋白质之前被切除。
术语“非编码区”或“NCR”是指与结构基因3’UTR区邻接的区。该NCR区含有转录终止信号。
术语“限制性位点”是指限制性内切核酸酶的序列特异性切割位点。
术语“载体”是指通过它将DNA片段导入宿主生物或宿主组织的某些工具。有不同类型的载体，包括质粒、噬菌体和粘粒。
术语“有效量”是指注射足够量PNV以产生足够水平的多肽。本领域技术人员知道该水平可以是变化的。
为了说明本发明，以下提供HIV的背景。人免疫缺陷病毒具有核糖核酸(RNA)基因组。为了产生按照本文所述方法克隆和操作的cDNA拷贝，必须按照本领域已知方法逆转录该RNA基因组。该基因组的每个末端是用作启动子的长末端重复序列。这些末端之间的基因组以不同可读框编码主要的基因产物gag-pol-envgag是群特异性抗原；pol是逆转录酶或聚合酶；该区也以不同的可读框编码负责翻译后加工的病毒蛋白酶，例如将gp160加工成为gp120和gp41；env是包膜蛋白；vif是病毒体传染因子；rev是病毒体蛋白表达的调节物；nef是负调节因子；vpu是病毒体增殖因子“u”；tat是转录的反式激活蛋白；vpr是病毒蛋白r。已经描述了这些元件中每一种的功能。
在本发明一个实施方案中，编码HIV gag蛋白的基因直接连接到转录启动子。然而，在缺乏rev的情况下，由于没有从核输出未剪接的基因，gag的表达被抑制。为了了解该系统，必须进一步祥细描述HIV的生命周期。
在HIV的生命周期中，在感染宿主细胞后HIV RNA基因组反转录为前病毒DNA，该前病毒DNA作为单个转录单位整合到宿主基因组DNA中。所述LTR提供从5’至3’方向(gag，pol，env)转录HIV基因的启动子，以形成整个基因组的未剪接转录物。该未剪接转录物作为由其翻译gag和pol的mRNA发挥作用，同时必须进行有限的剪接以翻译env编码基因。对于待表达的调节基因产物rev，必需剪接一次以上，因为在基因组环境中，如图1所示，rev和env相互重叠。为了转录env，必需终止转录rev，反之亦然。另外，从核转运出未剪接的RNA需要存在rev。然而，为了使rev以这种方式发挥作用，在转录物上必需存在rev效应元件(RRE)[Malim等，Nature338254-257(1989)]。
在本发明多核苷酸疫苗中，通过提供完全剪接的基因消除某些HIV基因的专性剪接(即，提供完整的可读框用于需要的基因产物，而不需要开关可读框或去除非编码区；本领域技术人员知道，当剪接特定基因时，在产生的精确序列中存在一定的自由度；然而，只要获得有功能的编码序列，这是可接受的)。因此，在一个实施方案中，剪接gag完整的编码序列，使得不需要间歇性表达每个基因产物。
已知HIV在群体以及感染个体中的突变倾向，根据本发明产生的体液免疫应答和细胞免疫应答双重应答对抑制HIV感染特别重要。为了配制HIV有效保护性疫苗，最好产生例如对HIV的主要中和靶gp160(env在各种HIV-1、分化体B病毒株中大约80％保守，所述病毒株为美国人群中的主要病毒株)的多价抗体应答，以及产生与gp160保守部分和gag编码的内病毒蛋白反应的细胞毒T细胞。我们已制备了包含选自以下病毒株和基因的gp160基因的HIV疫苗常见的实验室病毒株；在受感染人群中发现的主要的原始病毒分离物；突变的gp160，设计来使交叉病毒株解掩蔽，中和抗体表位；以及诸如gag和pol基因(在HIV分离物中95％保守)的其它典型的HIV基因。
实际上，还未发展到免疫缺陷状态的所有HIV血清学阳性病人均带有抗gag CTL，而这些病人中大约60％显示交叉病毒株、gp160特异性CTL。然而，在发展到疾病状态(称为AIDS)的感染个体中的HIV特异性CTL的量低得多，从而证实了我们可以诱导交叉病毒株的CTL应答的发现的重要性。
在小鼠和灵长类中证实用我们的env和gag多核苷酸疫苗构建物诱导的免疫应答。在小鼠中监测对env的抗体产生证实，给定构建物是适合的免疫原，即大部分接种的动物显示抗体应答。小鼠也提供了适合测试用我们的构建物诱导CTL、最易获得的动物模型，因此用来评价特定构建物是否能够产生这种活性。猴子(非洲绿猴、猕猴、黑猩猩)提供了用于在较大的非啮齿动物中抗体评价的其它物种，包括灵长类。由于在小鼠血清中观察到抗逆转录病毒的高水平内源性中和活性，所以最好用这些物种而不用小鼠进行抗血清中和检测。这些资料证实，我们的疫苗产生足够的免疫原性，以在黑猩猩/HIVIIIB攻击模型的实验中获得保护，所述模型基于该系统已知保护水平的中和抗体。然而，目前在学术界中出现并越来越被接受的保护定义越来越远离所谓的“消除性免疫”，表明完全保护避免HIV感染以预防疾病。该目标的许多相关数包括降低的血液病毒滴度，这通过PCR、通过血清样品的感染性、通过ELISA测定血液中p24或其它HIV抗原的浓度检测的HIV逆转录酶活性、升高的CD4+T细胞浓度、以及提高的生存率检测[参见例如，Cohen，J.，Science 2621820-1821，1993，关于抗HIV疫苗效能定义演变的讨论]。本发明的免疫原也产生抗HIV感染性(临床、原始现场)分离物的中和免疫应答。
ELISA检测用来确定表达分泌型tPA-gag或天然gag的优化gag疫苗载体是否有效产生gag特异性抗体。通过免疫印迹分析优化gag转染的细胞裂解液，提供我们的疫苗载体的gag表达的原始体外特征。这些资料证实gag表达，并用抗HIV抗血清显现转染细胞gag表达对其定量。
产生CTL应答。在细胞内合成的病毒蛋白产生MHC I限制性CTL应答。每一种这些蛋白在血清学阳性病人中引出CTL。我们的疫苗也能够在小鼠和猕猴中引出CTL。小鼠病毒株的免疫遗传学有益于这类研究，如用流感NP证实的一样，[参见Ulmer等，Science2591745-1749，1993]。已经在Balb/c小鼠中确定了HIV蛋白env、rev、ref和gag的几种表位(Frankel，F.R.等，J.Immunol.155，4775-82(1995))，因此有助于体外CTL培养和细胞毒性检测。另一方面，可以使用编码gp160、gp120、pol或gag的完整基因。关于该问题的其它综述，参见例如，(HIV分子免疫学数据库1995，Korber等编辑，Los AlamosNational Laboratory，Los Alamos，NM，USA)。本文所用的T细胞效应子功能与成熟T细胞表型相关，例如，细胞毒性、激活B细胞的细胞因子分泌、和/或巨噬细胞和嗜中性粒细胞的募集或刺激。
TH活性测定。通过加入重组蛋白或肽表位，测试取自疫苗接种动物的脾细胞培养物对特定抗原的回忆。通过这些培养物的增殖或细胞因子的产生，监测由伴随的脾抗原提呈细胞(APC)提呈的这类抗原对T细胞的激活。细胞因子产生型也允许将TH应答分为1型或2型。由于在无免疫应答的血清学阳性病人中的显著TH2应答似乎与细胞免疫排斥有关，所以，确定病人由特定PNV产生的应答类型允许操所作产生的免疫应答是可能的。
基于上述免疫学研究，可预计我们的疫苗在脊椎动物对抗有毒HIV攻击是有效的。在HIVIIIB/黑猩猩攻击模型中用PNV构建物或PNV构建物的混合物充分接种这些动物之后完成这些研究，所述PNV构建物包括gp160IIIB、gagIIIB、nefIIIB和REVIIIB°IIIB病毒株在这方面是有用的，因为已经确立该病毒株黑猩猩致死剂量的滴度。然而，采用任何HIV病毒株和对特定病毒株特异性的表位或与特定病毒株异源的表位，设计相同的研究。除了黑猩猩外，第二种接种/攻击模型是scid-hu PBL小鼠。用后续HIV攻击小鼠宿主，该模型可以测试人淋巴细胞免疫统与我们的疫苗。该系统是有利的，因为该系统容易用于采用任何HIV病毒株的使用，并提供了对抗HIV原始现场分离物的多种病毒株的保护证据。第三种攻击模型采用HIV/SIV病毒杂交体(SHIV)，已经表明其中某些杂交体感染猕猴并导致引起死亡的免疫缺陷病[参见Li，J.等，J.AIDS 5639-646，1992]。用我们的多核苷酸疫苗构建物接种猕猴，对用致死剂量SHIV的后续攻击是有保护作用的。
有无数病毒和细菌衍生的基因不采用在哺乳动物优化表达的密码子。其原因包括这样的事实这些微生物提供其自身聚合酶或特定蛋白或因子，以促进转录/翻译其基因产物。就细菌而言，细菌的特定tRNA的相对丰度可以各不相同。清楚的是，在DNA疫苗情况下的这类基因的体内表达是显著不同的。
典型构建物组分包括(但不限于)HIV env、HIV gag、HIV pol、HIV rev、HIV vpr和HIV nef。编码由病原体而不是HIV表达的抗原的基因，例如但不限于流感病毒核蛋白、血凝素、基质、神经氨酸酶和其它抗原蛋白；单纯疱疹病毒基因；人乳头瘤病毒基因；结核抗原；A、B或C型肝炎病毒抗原。
通过用本发明非复制型质粒DNA进行免疫，证实多核苷酸HIV免疫原对后续病毒攻击的保护效用。这是有利的，因为不涉及感染因子，不需要装配病毒颗粒，并允许选择决定簇。而且，因为gag和蛋白酶以及几种其它病毒基因产物的序列在各种HIV病毒株中是保守的，所以使得能够对与获得克隆基因的病毒株同源的有毒HIV株以及异源的HIV株的后续攻击产生保护。
本发明提供诱导交叉病毒株保护性免疫的方法，而不需要自我复制因子或佐剂。另外，用本发明多核苷酸免疫具有许多其它益处。该疫苗接种的方法应该可应用于肿瘤以及传染性因子，因为CD8+CTL应答对病理生理过程都是重要的[K.Tanaka等，Annu.Rev.Immunol.6，359(1988)]。因此，引发对转化过程关键性蛋白的免疫应答，可能是癌保护或免疫治疗的有效手段。在注射病毒蛋白和人生长激素DNA后针对所表达蛋白产生高效价抗体提示，这是制备基于抗体的疫苗的容易而高效的方法，所述疫苗或者与针对保守抗原的细胞毒T淋巴细胞疫苗分开或者与其联合。
产生和纯化DNA构建物的简便性超过传统的蛋白纯化方法，由此有助于产生联合疫苗。因此，可以制备、混合并同时给予的多种构建物，例如编码gp160、gp120、gp41、gag或任何其它HIV基因的构建物。由于在注射DNA后保持蛋白表达，可以提高B细胞和T细胞记忆的持久性，由此产生长期存在的体液和细胞介导的免疫。
制备和纯化DNA构建物的分子生物学标准技术使得能够制备本发明的DNA免疫原。因此，尽管分子生物学标准技术足以生产本发明制品，但本文公开的特定构建物提供新的多核苷酸免疫原，所述免疫原令人惊奇地产生交叉病毒株和原始HIV分离物的中和，用标准灭活的完整病毒或亚单位蛋白疫苗迄今没能获得这样的结果。
导入疫苗接受者的可表达DNA量或转录的RNA量取决于所用转录和翻译启动子的强度以及取决于所表达基因产物的免疫原性。一般而言，直接注入肌肉组织的免疫或预防有效量大约为1ng-100mg，优选大约10μg-300μg。也设想皮下注射、皮内导入、皮肤压迹(impression through the skin)以及其它诸如腹膜内、静脉内或吸入传递的给药模式。也设想提供加强接种。也设想在用HIV多核苷酸免疫原接种后，用诸如gp160、gp120和gag基因产物的HIV蛋白加强接种。同时或在胃肠外导入本发明PNV后，胃肠外给予白介素-12蛋白也是有利的，所述胃肠外白介素-12给予法诸如静脉内、肌内、皮下或其它方式。
所述多核苷酸可以是裸露多核苷酸，即不与任何蛋白、佐剂或其它影响接受者免疫系统的因子结合。在这种情况下，希望该多核苷酸是生理可接受溶液，诸如但不限于无菌盐水或无菌缓冲盐溶液。另一方面，该DNA可以与诸如卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体的脂质体结合成为DNA-脂质体混合物，或者该DNA可以与诸如一种蛋白或其它载体的本领域已知佐剂结合，以加强免疫应答。也可以有利地使用促进细胞摄取DNA的因子，诸如但不限于钙离子。这些因子在本文一般称为转染促进剂和药用可接受载体。用多核苷酸包被的微粒包被技术是本领域已知的，也可以结合本发明使用。
提供以下实施例以说明本发明，而不希望以任何方式限制本发明。
实施例1异源性表达HIV晚期基因产物诸如env和gag的HIV结构基因需要表达HIV调节基因rev，以便有效地产生全长蛋白。我们已经发现，gag的rev依赖性表达产生低水平蛋白，并且rev本身对细胞可能具有毒性。尽管我们体外获得相对高水平的rev依赖性表达gp160，但是该疫苗在用rev/gp160DNA在体内免疫后，引发抗gp160的低水平抗体。这可能是由于已知的rev细胞毒作用以及在含有数以百计核的肌管中发挥rev功能的困难增加所致(当gag或env蛋白表达的rev依赖性转录发生时，需要rev蛋白在相同核中)。然而，用选择性修饰的env基因获得rev非依赖性表达已是可能的。
一般来说，我们的疫苗采用原始HIV(IIIB、MN或CAM-1)env和gag基因，以在我们的一般化接种载体V1Jns中优化表达，V1Jns包括一个CMV立即早期(IE)启动子、BGH聚腺苷酸化位点和pUC骨架。通过用来自组织特异性血浆纤溶酶原激活蛋白(tPA)基因的前导肽取代其天然的分泌前导肽、并表达产生的在CMVIE启动子和CMV内含子A之后的嵌合基因，根据使用多大的基因区段(例如gp120与gp160)，可以获得env的不同效率的rev非依赖性表达。
如上所述，我们认为用该方案实现以下目的是使我们成功机会最大所必需的(1)能够在灵长类动物中产生较强的中和抗体应答的基于env的载体；(2)用灵长类动物的CTL和辅助效应子功能特征鉴定，引发强T淋巴细胞应答的gag和env载体；(3)在我们的疫苗中使用得自临床有关的HIV-1病毒株的env和gag基因，并特征鉴定它们引发的免疫应答，特别是对原始分离物的中和；(4)采用合适的优化疫苗在诸如黑猩猩/HIV(IIIB)或猕猴/SHIV的动物攻击模型中证实保护作用；以及(5)确定适合临床应用的免疫应答的持续时间。关于这些目的的前三个已经取得显著进展，并且实验正在进行中，以确定我们最近的gp160和gag接种构建物对这些初步结果是否还能改进。
实施例2疫苗生产载体A.V1Jneo表达载体必需去除用于抗生素选择带有V1J的细菌的ampr基因，因为氨苄青霉素不能用于大规模发酵罐。通过用SspI和Eam1105I限制性酶消化，从V1J的pUC骨架去除ampr基因。通过琼脂糖凝胶电泳纯化余下的质粒，用T4 DNA聚合酶使末端平端化，然后用牛小肠碱性磷酸酶处理。用PstI限制酶切下衍生自转座子903并包含在pUC4K质粒中的市售kanr基因，再用琼脂糖凝胶电泳纯化，用T4 DNA聚合酶使其末端平端化。将该片段与V1J骨架连接，产生具有任一方向kanr基因的质粒，所述质粒称作V1Jneo#’1和3。这些质粒中的每一种通过限制酶消化分析、DNA测序接头区证实，并表明产生相似量V1J质粒。异源基因产物的表达也类似于用于这些V1Jneo载体的V1J。我们随意地选择以下称为V1Jneo的V1Jneo#3，它含有与V1J中的ampr基因相同方向的kanr基因，作为表达构建物。B.V1Jns表达载体将一个Sfi I位点加入V1Jneo以有助于整合研究。在该载体BGH序列中的Kpn I位点加入市售的13个碱基对的Sfi I接头(New EnglandBioLabs)。用Kpn I使V1Jneo线性化，凝胶纯化，用T4 DNA聚合酶平端化，并连接至平端的Sfi I接头。通过限制性作图选择克隆分离物，并通过该接头的测序鉴定证实。该新载体叫做V1Jns。V1Jns(含有Sfi I)中的异源基因表达类似于V1Jneo(含有Kpn I)中的相同基因表达。C.V1Jns-tPA为了对分泌蛋白和/或膜蛋白提供异源前导肽序列，修饰V1Jn以包括人组织特异性血浆纤溶酶原激活蛋白(tPA)的前导序列。使两种合成的互补寡聚体退火，然后连接到已经用BgII消化的V1Jn中。这些寡聚体具有适合连接至BgIII切割的序列的突出碱基。连接后破坏上游BgIII位点，保留下游BgIII位点用于随后的连接。通过DNA测序，证实所述连接位点以及完整的tPA前导序列。此外，为了与我们的共有优化载体V1Jns(＝具有SfiI位点的V1Jneo)一致，通过用T4 DNA聚合酶平端化KpnI位点，之后与SfiI接头(商品目录1138号，New England Biolabs)连接，将一个SfiI限制性位点置于V1Jn-tPA的BGH终止子区的KpnI位点。通过限制性消化和琼脂糖凝胶电泳证实该修饰。D.载体V1R制剂在继续努力优化我们的基本接种载体中，我们制备了称为V1R的V1Jns的衍生物。构建该载体的目的是获得最小化的疫苗载体，即没有非必需DNA序列，所述载体仍然保有整个优化异源基因表达的特征以及V1J和V1Jns提供的高质粒产率。我们由文献以及通过实验确定(1)可以去除包含大肠杆菌复制起点的pUC骨架中的多个区，而不影响细菌质粒的产率；(2)假如插入细菌终止子以进行替代，可以去除卡那霉素可读框之后的kanr基因3’区；以及(3)可以从BGH终止子的3’一半去除约300个碱基，而不影响其调节功能(在BGH元件的原始KpnI限制性酶切位点之后)。
通过采用PCR由V1Jns合成三种DNA区段(分别代表CMVintA启动子/BGH终止子、复制起点和卡那霉素抗性元件)，构建V1R。用PCR寡聚物将每种区段的独特限制性酶加入到各个区段末端SspI和XhoI用于CMVintA/BGH；EcoRV和BamHI用于kanr基因；而BcII和SalI用于orir。选择这些酶位点，是因为它们允许定向连接各个PCR衍生DNA区段，随后丧失每个位点EcoRV和SspI留下适合连接的平端DNA，而BamHI和BcII留下互补突出端，SalI和XhoI同样留下互补突出端。在通过PCR获得这些区段之后，用上述合适的限制酶消化各个区段，然后在含有所有三种DNA区段的单一反应混合物中连接在一起。设计orir的5’端包含T2 rho非依赖性终止子序列，该终止子序列通常见于该区，因此它可以提供卡那霉素抗性基因的终止信息。通过限制酶消化(8个酶以上)以及对连接接点的DNA测序证实该连接产物。DNA质粒产率和用V1R中的病毒基因的异源表达似乎类似于V1Jns。所获得的载体的大小净减少1346个碱基(V1Jns＝4.86kb；V1R＝3.52kb)。
实施例3设计提高gag基因表达的合成基因区段将基因区段转换成拥有相同翻译序列的序列，但是具有R.Lathe在研究文章中所定义的可选密码子选择，所述文章载于J.Molec.Biol.第183卷，第1-12页(1985)，题为“由氨基酸序列的数据推导的合成寡核苷酸探针理论和实践的考虑”。提高HIV gag基因区段表达的下述方法学基于我们的假说，即已知不能有效地在哺乳动物细胞中表达该基因是整个转录组合物的结果。因此，采用编码相同蛋白序列的可选密码子，可以去除对gag表达的抑制。所用的特定密码子取代方法描述如下1.鉴定合适可读框的密码子取代。
2.比较野生型密码子观察到的人基因的使用频率。
3.假如密码子不是最常使用的，则用在人细胞中高表达的最适密码子取代它。
4.重复该过程，直至全部基因区段被取代为止。
5.检查新基因序列是否有由这些密码子取代产生的不需要序列(例如“ATTTA”序列、偶然产生的内含子剪接识别位点、不需要的限制切酶位点等)，以及检查消除这些序列的取代密码子。
6.装配合成的基因区段并测试所提高的表达。
用这些方法产生以下合成基因片段，用于HIV gag产生全部包含用于表达的合适密码子选择的基因。尽管上述流程概述我们用于设计DNA疫苗的密码子优化基因，但本领域技术人员应该理解，类似的疫苗效能或基因表达增加可以通过最少改变所述方法或序列最少变异而获得。
实施例4I.HIV gag疫苗构建物这是包含最适密码子的完整的HIV-1(CAM1)gag。1 AGATCTACCA TGGGTGCTAG GGCTTCTGTG CTGTCTGGTG GTGAGCTGGA51 CAAGTGGGAG AAGATCAGGC TGAGGCCTGG TGGCAAGAAG AAGTACAAGC101 TAAAGCACAT TGTGTGGGCC TCCAGGGAGC TGGAGAGGTT TGCTGTGAAC151 CCTGGCCTGC TGGAGACCTC TGAGGGGTGC AGGCAGATCC TGGGCCAGCT201 CCAGCCCTCC CTGCAAACAG GCTCTGAGGA GCTGAGGTCC CTGTACAACA251 CAGTGGCTAC CCTGTACTGT GTGCACCAGA AGATTGATGT GAAGGACACC301 AAGGAGGCCC TGGAGAAGAT TGAGGAGGAG CAGAACAAGT CCAAGAAGAA351 GGCCCAGCAG GCTGCTGCTG GCACAGGCAA CTCCAGCCAG GTGTCCCAGA401 ACTACCCCAT TGTGCAGAAC CTCCAGGGCC AGATGGTGCA CCAGGCCATC451 TCCCCCCGGA CCCTGAATGC CTGGGTGAAG GTGGTGGAGG AGAAGGCCTT501 CTCCCCTGAG GTGATCCCCA TGTTCTCTGC CCTGTCTGAG GGTGCCACCC551 CCCAGGACCT GAACACCATG CTGAACACAG TGGGGGGCCA TCAGGCTGCC601 ATGCAGATGC TGAAGGAGAC CATCAATGAG GAGGCTGCTG AGTGGGACAG651 GCTGCATCCT GTGCACGCTG GCCCCATTGC CCCCGGCCAG ATGAGGGAGC701 CCAGGGGCTC TGACATTGCT GGCACCACCT CCACCCTCCA GGAGCAGATT751 GGCTGGATGA CCAACAACCC CCCCATCCCT GTGGGGGAAA TCTACAAGAG801 GTGGATCATC CTGGGCCTGA ACAAGATTGT GAGGATGTAC TCCCCCACCT851 CCATCCTGGA CATCAGGCAG GGCCCCAAGG AGCCCTTCAG GGACTATGTG901 GACAGGTTCT ACAAGACCCT GAGGGCTGAG CAGGCCTCCC AGGAGGTGAA951 GAACTGGATG ACAGAGACCC TGCTGGTGCA GAATGCCAAC CCTGACTGCA1001 AGACCATCCT GAAGGCCCTG GGCCCTGCTG CCACCCTGGA GGAGATGATG1051 ACAGCCTGCC AGGGGGTGGG GGGCCCTGGT CACAAGGCCA GGGTGCTGGC1101 TGAGGCCATG TCCCAGGTGA CCAACTCCGC CACCATCATG ATGCAGAGGG1151 GCAACTTCAG GAACCAGAGG AAGACAGTGA AGTGCTTCAA CTGTGGCAAG1201 GTGGGCCACA TTGCCAAGAA CTGTAGGGCC CCCAGGAAGA AGGGCTGCTG1251 GAAGTGTGGC AAGGAGGGCC ACCAGATGAA GGACTGCAAT GAGAGGCAGG1301 CCAACTTCCT GGGCAAAATC TGGCCCTCCC ACAAGGGCAG GCCTGGCAAC1351 TTCCTCCAGT CCAGGCCTGA GCCCACAGCC CCTCCCGAGG AGTCCTTCAG1401 GTTTGGGGAG GAGAAGACCA CCCCCAGCCA GAAGCAGGAG CCCATTGACA1451 AGGAGCTGTA CCCCCTGGCC TCCCTGAGGT CCCTGTTTGG CAACGACCCC1501 TCCTCCCAGT AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT(SEQ ID NO1)实施例5体外gag疫苗的表达在转染的人横纹肌肉瘤(RD)或293细胞中测试这些构建物的体外表达。由转染的293细胞定量gag显示，V1Jns-opt-gag和V1Jns-tPA-opt gag载体产生分泌型gag。
实施例6检测HIV-gag细胞毒T淋巴细胞在本节中描述的方法说明用于疫苗接种小鼠的分析检测。一种基本类似的检测可以用于灵长类动物，只是必须建立自体B细胞系以用作每种动物的靶细胞。对于人类，采用Epstein-Barr病毒可以实现自体B细胞系的建立，对于猕猴，采用B型疱疹病毒建立。
采用Ficoll-Hypaque离心分离红细胞和白细胞，从或者新鲜取的血或者脾获得外周血单核细胞(PBMC)。对于小鼠，也可以使用淋巴结。或者通过在IL-2(20U/ml)和伴刀豆凝集素A(2μg/ml)中体外培养6-12天，或者通过采用等量辐射的抗原提呈细胞的特定抗原，从PBMC制备效应CTL。特定抗原可以包括或者为CTL识别所用动物的MHC单倍型的已知表位，或者工程改造来表达合适抗原的疫苗病毒构建物。靶细胞可以是同源或MHC单倍型匹配的细胞系，所述细胞系已经处理以提呈所述合适抗原用于体外刺激CTL。对于Balb/c小鼠，以10μM浓度使用Paterson的gag肽(J.Immunol.，1995)，以用辐射的同源脾细胞体外再刺激CTL，Paterson的gag肽可以用来在细胞毒检测期间，以1-10μM在检测前于37℃温育大约2小时，使靶细胞致敏。对于这些H-2dMHC单倍型小鼠，鼠肥大细胞瘤细胞系P815提供优良的靶细胞。通过于37℃温育靶细胞大约1-2小时(每～5×106细胞加入0.2mCi)、然后洗涤几次靶细胞，使抗原致敏的靶细胞加载Na51CrO4，在被CTL杀伤时从所述靶细胞内释放出Na51CrO4。以诸如100∶1、50∶1、25∶1等的不同效应细胞与靶细胞比率，将CTL细胞群与靶细胞混合，然后一起沉淀，在收获上清液之前于37℃温育大约4-6小时，然后用γ计数仪检测上清液中靶细胞释放出的放射性活性。以靶细胞可释放的总计数(用0.2％Triton X-100处理后获得)的百分率计算细胞毒性，所述总计数已经从中减去靶细胞自发释放的计数。
实施例7检测HIV gag特异性抗体设计ELISA检测针对HIV产生的抗体，用两者中的一种特定重组p24 gag蛋白作底物抗原。96孔微量滴定板每孔加50μl重组抗原(2ug/ml)的PBS(磷酸缓冲盐溶液)溶液于4℃、震荡平台上包被过夜。抗原包括重组p24 gag(Intracell)。平板用洗涤缓冲液(PBS/0.05％Tween 20)冲洗4次，然后每孔加入200ul封闭缓冲液(1％康乃馨乳(Carnation milk)的PBS/0.05％Tween-20溶液)在室温下震荡1小时。免疫前血清和免疫血清用封闭缓冲液按需要稀释范围稀释，每孔加入100μl。平板在室温下震荡温育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤4次。然后，将用封闭缓冲液稀释为1∶2000的、与辣根过氧化酶缀合的第二抗体(抗猕猴Ig，Southern Biotechnology Associates；抗小鼠Ig和抗兔Ig，Jackson Immuno Research)，以100μl/孔加入每个样品中，于室温下震荡温育1小时。平板用洗涤缓冲液洗涤4次，然后每孔加入100μl含1mg/ml邻苯二胺(o-PD，Calbiochem)的100mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)显色。将平板于450nm动态地(反应的第一个10分钟)以及在10分钟和30分钟终点时读取吸光度(Thermo-max microplatereader，Molecular Devices)。
实施例8T细胞增殖检测获得并测试PBMC对特定抗原记忆应答，通过PBMC细胞群内的增殖测定。用3H-胸苷监测增殖情况，将3H-胸苷在收获细胞前加入细胞培养物温育18-24小时。假如细胞发生了增殖，则细胞收获仪将含同位素的DNA阻留于滤膜上，而静止细胞未掺入同位素，游离形式的同位素不被滤膜阻留。对于啮齿类动物或灵长类动物物种，将总体积为200μl的完全培养基(RPMI/10％胎牛血清)中的4×105细胞接种于96孔微量滴定板。单独用PBMC和培养基测定本底增殖应答，采用诸如浓度为1-5μg/ml的植物凝集素(PHA)或伴刀豆凝集素A(ConA)的凝集素产生非特异性应答用作阳性对照。具体抗原包括或者已知的肽表位、纯化蛋白或者灭活的病毒。肽抗原的浓度范围为1-10μM，蛋白抗原的浓度范围为1-10μg/ml。凝集素诱导的增殖高峰在细胞培养物培养的第3-5天，而抗原特异性应答高峰在第5-7天。特异性增殖发生时，所获得的辐射计数至少高于培养基本底3倍，并且辐射计数通常以相对于本底的比率或刺激指数(SI)表示。
实施例9设计我们用的策略，以诱导针对HIV的细胞毒T淋巴细胞(CTL)和中和抗体应答，主要是针对HIV gag(约95％保守)和env(gp160或gp120；70-80％保守)基因产物。gp160含有HIV颗粒上仅有的已知中和抗体表位，而由于已知这些细胞免疫的发生与消除感染后的原发性病毒血症有关，以及CTL在保持无病状态中的作用，强调了抗-env和抗-gag CTL应答的重要性，所述细胞免疫发生于中和抗体出现之前(Koup等，J.Virol.684650(1994))。尽管HIV的遗传多样性是众所周知的，我们还是希望获得更广泛的中和抗体，所述中和抗体由包括几种得自临床分离物的典型env基因和gp41(约90％是保守的；并含有更保守的2F5中和表位)诱导产生，同时高度保守的gag基因应该产生广泛的交叉病毒株CTL应答。因为该疫苗策略产生针对HIV的强体液免疫和细胞免疫(在非人的灵长类动物，与其它可用的HIV疫苗策略相比，该方法具有独特的优势)。A.HIV-1gag多核苷酸疫苗的开发基于我们例如由用于人类表达的最适密码子组成的基因进行的HIV env基因表达实验，设计并合成一种合成的p55 gag基因(optgag)，并将其克隆入V1R，所述基因含有整个过程中产生的350个沉默突变(共计1500个核苷酸)的合适密码子选择。也构建第二种形式的opt gag载体，该载体在NH2末端含有类似于上述HIV env信号肽序列、编码tPA信号肽的序列，也去除位于野生型基因的该位置的核定位序列基元。设计这种修饰以测试，改变gag进入ER/golgi分泌途径的正常细胞内运输类型是否会改变gag DNA疫苗的免疫原性。将tPA前导肽加入gag引起水平高得多的待分泌gag，该分泌蛋白与gag重量相比，是作为更高分子量的形式迁移的。这表明，因为用tPA前导肽修饰发生翻译后修饰——可能是糖基化。
测试了已经用或者两种优化p55 gag构建物(V1R-opt gag±tPA前导序列)中的一种或者V1R-gag(野生型)免疫的小鼠在注射一次后(接种剂量＝10、3.3或1μg/小鼠)的抗-gag肽的CTL应答。所有剂量的两种V1R-opt gag DNA均产生高水平的抗-gag CTL，V1R-tPA-optgag产生最高水平的特异性杀伤(1μg剂量，于E/T＝3下约85％)。比较每个DNA剂量的细胞毒性曲线证实，V1R-tPA-opt gag接种产生较V1R-gag (野生型)强约100倍的CTL应答。总体来说，三种疫苗组的免疫应答显示相同的CTL、T辅助细胞和抗体应答的相对潜能(从高到低依次为)V1R-tPA-opt gag＞V1R-opt gag＞V1R-gag(野生型)。总之，opt gag构建物的CTL、体液免疫应答和辅助T细胞应答高得多，尤其是具有tPA前导序列的opt gag构建物。
实施例10治疗方法给需要抗人免疫缺陷病毒感染的治疗性或预防性免疫的人注射接种编码所有或部分env、gag或pol基因或其组合物的HIV DNA。所述注射可以是腹膜内、皮下、肌内或皮内注射。所述HIV DNA可以用作免疫应答的引物，或者可以用作免疫应答的增强剂。可以在给所述人员注射包含灭活HIV、减毒HIV的药用组合物、包含HIV衍生蛋白的组合物、或它们的组合物之前、同时或之后，进行该DNA注射。
实施例11治疗方法用抗-HIV抗病毒剂或其组合物治疗需要治疗性治疗人免疫缺陷病毒感染的人。用本发明公开的HIV DNA药用组合物注射接种所述受治疗的个体。
权利要求
1.合成的多核苷酸，它包含编码非哺乳动物蛋白或其片段的DNA序列，所述DNA序列包含在哺乳动物宿主优化表达的密码子。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述蛋白选自HIV蛋白、HSV蛋白、HAV蛋白、HBV蛋白、HCV蛋白、HPV蛋白、HSV蛋白、疟原虫蛋白、分枝杆菌蛋白、疏螺旋体蛋白和轮状病毒蛋白。
3.权利要求2的多核苷酸，其中所述蛋白是一种HIV蛋白。
4.权利要求3的多核苷酸，它具有以下DNA序列1 AGATCTACCA TGGGTGCTAG GGCTTCTGTG CTGTCTGGTG GTGAGCTGGA51 CAAGTGGGAG AAGATCAGGC TGAGGCCTGG TGGCAAGAAG AAGTACAAGC101 TAAAGCACAT TGTGTGGGCC TCCAGGGAGC TGGAGAGGTT TGCTGTGAAC151 CCTGGCCTGC TGGAGACCTC TGAGGGGTGC AGGCAGATCC TGGGCCAGCT201 CCAGCCCTCC CTGCAAACAG GCTCTGAGGA GCTGAGGTCC CTGTACAACA251 CAGTGGCTAC CCTGTACTGT GTGCACCAGA AGATTGATGT GAAGGACACC301 AAGGAGGCCC TGGAGAAGAT TGAGGAGGAG CAGAACAAGT CCAAGAAGAA351 GGCCCAGCAG GCTGCTGCTG GCACAGGCAA CTCCAGCCAG GTGTCCCAGA401 ACTACCCCAT TGTGCAGAAC CTCCAGGGCC AGATGGTGCA CCAGGCCATC451 TCCCCCCGGA CCCTGAATGC CTGGGTGAAG GTGGTGGAGG AGAAGGCCTT501 CTCCCCTGAG GTGATCCCCA TGTTCTCTGC CCTGTCTGAG GGTGCCACCC551 CCCAGGACCT GAACACCATG CTGAACACAG TGGGGGGCCA TCAGGCTGCC601 ATGCAGATGC TGAAGGAGAC CATCAATGAG GAGGCTGCTG AGTGGGACAG651 GCTGCATCCT GTGCACGCTG GCCCCATTGC CCCCGGCCAG ATGAGGGAGC701 CCAGGGGCTC TGACATTGCT GGCACCACCT CCACCCTCCA GGAGCAGATT751 GGCTGGATGA CCAACAACCC CCCCATCCCT GTGGGGGAAA TCTACAAGAG801 GTGGATCATC CTGGGCCTGA ACAAGATTGT GAGGATGTAC TCCCCCACCT851 CCATCCTGGA CATCAGGCAG GGCCCCAAGG AGCCCTTCAG GGACTATGTG901 GACAGGTTCT ACAAGACCCT GAGGGCTGAG CAGGCCTCCC AGGAGGTGAA951 GAACTGGATG ACAGAGACCC TGCTGGTGCA GAATGCCAAC CCTGACTGCA1001 AGACCATCCT GAAGGCCCTG GGCCCTGCTG CCACCCTGGA GGAGATGATG1051 ACAGCCTGCC AGGGGGTGGG GGGCCCTGGT CACAAGGCCA GGGTGCTGGC1101 TGAGGCCATG TCCCAGGTGA CCAACTCCGC CACCATCATG ATGCAGAGGG1151 GCAACTTCAG GAACCAGAGG AAGACAGTGA AGTGCTTCAA CTGTGGCAAG1201 GTGGGCCACA TTGCCAAGAA CTGTAGGGCC CCCAGGAAGA AGGGCTGCTG1251 GAAGTGTGGC AAGGAGGGCC ACCAGATGAA GGACTGCAAT GAGAGGCAGG1301 CCAACTTCCT GGGCAAAATC TGGCCCTCCC ACAAGGGCAG GCCTGGCAAC1351 TTCCTCCAGT CCAGGCCTGA GCCCACAGCC CCTCCCGAGG AGTCCTTCAG1401 GTTTGGGGAG GAGAAGACCA CCCCCAGCCA GAAGCAGGAG CCCATTGACA1451 AGGAGCTGTA CCCCCTGGCC TCCCTGAGGT CCCTGTTTGG CAACGACCCC1501 TCCTCCCAGT AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT(SEQ ID NO1).
5.权利要求3的多核苷酸，它在导入脊椎动物组织包括人体内组织时，在体内诱导抗-HIV中和抗体、HIV特异性T细胞免疫应答或保护性免疫应答，其中所述多核苷酸包含编码HIV gag、gag蛋白酶或env基因产物的基因。
6.在脊椎动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将lng-100mg权利要求1的多核苷酸导入所述脊椎动物组织。
7.权利要求6的方法，所述方法还包括给予减毒的病原体、杀伤的病原体、亚单位疫苗、蛋白疫苗和它们的组合物。
8.诱导抗HIV感染的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包括权利要求3的多核苷酸和一种药用可接受载体以及一种可任选的佐剂。
9.在灵长类动物中诱导抗-HIV免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求3的多核苷酸导入所述灵长类动物组织，并同时胃肠外给予一种细胞因子。
10.一种方法，所述方法诱导抗原提呈细胞以刺激细胞毒T细胞增殖以及辅助T细胞增殖——一种包括HIV抗原特异性的淋巴因子分泌的效应子功能，所述方法包括使脊椎动物在体内暴露于权利要求3的多核苷酸。
11.治疗需要这种治疗的患者的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求3的多核苷酸和一种抗HIV抗病毒剂。
12.药用组合物，所述组合物包含权利要求1的多核苷酸。
全文摘要
提供编码HIV gag和修饰的HIV gag的合成DNA分子。所述合成分子的密码子是预定宿主细胞优选的密码子。所述合成分子可以用作一种多核苷酸疫苗,该疫苗通过刺激中和抗体和细胞介导的免疫,提供抗HIV感染的有效免疫预防。
文档编号A61K38/00GK1252075SQ9880397
公开日2000年5月3日 申请日期1998年2月3日 优先权日1997年2月7日
发明者小J·W·希弗, M·E·M·达维斯, D·C·弗雷德, M·A·刘, H·C·佩里 申请人:麦克公司