合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物的制作方法

专利名称：合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物的制作方法
相关申请本申请是1997年4月11日申请的美国专利申请序列第08/834，655号的部分继续申请。
介绍发明领域本发明涉及在微生物或动物中调节涉及长链多不饱和脂肪酸(PUFA)产生的酶和/或酶组分的水平。背景多不饱和脂肪酸(PUFA)的两个主要家族是ω3脂肪酸(例如二十碳五烯酸(EPA))和ω6脂肪酸(例如花生四烯酸(ARA))。PUFA是细胞原生质膜的重要组分，在原生质膜中它们可被发现为诸如磷脂之类的形式。PUFA对于正确的发育(特别是发育中的婴儿大脑)以及组织形成和修复是必需的。在人类和动物中，PUFA也用作其它重要分子的前体，所述其它重要分子包括前列环素、类花生酸、白三烯和前列腺素。四种主要的有重要性的长链PUFA包括二十二碳六烯酸(DHA)和EPA(它们主要发现于不同类型的鱼油中)、γ-亚麻酸(GLA)(它主要发现于许多植物的种子中，所述植物包括月见草(Oenothera biennis)、琉璃苣(Borago officinalis)和黑茶子(Ribes nigrum))，以及硬脂四烯酸(stearidonic acid)(SDA)(它发现于海洋油类(marine oils)和植物种子中)。GLA和另一种重要的长链PUFA花生四烯酸(ARA)发现于丝状真菌中。ARA可以从包括肝脏和肾上腺的动物组织中纯化。GLA、ARA、EPA和SDA本身为重要的长链脂肪酸，或作为其饮食前体，参与前列腺素合成、心脏病的治疗和脑组织的发育。
对于DHA，存在许多用于工业生产的来源，包括多种海洋生物、得自冷水海鱼的油和蛋黄组分。对于ARA，包括被孢霉属(Mortierella)、虫霉属(Entomophthora)、Phytium和Porphyridium在内的微生物可以用于工业生产。SDA的工业来源包括木霉属(Trichodesma)和Echium。GLA的工业来源包括月见草、黑茶子和琉璃苣。然而，有几个与由天然来源，PUFA的工业生产有关的缺点。PUFA的天然来源诸如动物和植物倾向于具有高度异源的油组分。因此，得自这些来源的油需要广泛的纯化，以分离出一种或多种所需PUFA，或生产富含一种或多种PUFA的油。天然来源在可获量方面也易受控制不了的波动。鱼类资源可以经历天然变化，或可以由于过度捕捞而枯竭。鱼油有不良味道和气味，这些不良味道和气味也许不可能经济地从所需产品中分离掉，并且鱼油可能使得这类产品作为食物增补剂为不可接受的。动物油，特别是鱼油，可能积累环境污染物。天气和疾病可以引起鱼类和植物资源产量的波动。可用于轮作生产油料作物(oil-producing crop)的耕地易受到来自人口稳步增长和相关的对尚存耕地上食物生产需求增加的竞争。产生PUFA的作物(诸如琉璃苣)尚未适应工业化栽培，在单一作物栽培中可能表现不好，因此，这类作物的生长没有经济上的竞争性，在那里可以培育更有利并且更好建立的作物。诸如被孢霉属的生物的大规模发酵也是昂贵的。天然的动物组织含有少量ARA，且难以加工。诸如Porphyridium和被孢霉属的微生物难以在工业规模上培养。
含有PUFA的食物增补剂和药用制剂可能保留PUFA来源的缺点。诸如鱼油胶囊的增补剂可能含有低水平的特别需要的组分，因此需要大剂量；而高剂量导致摄入高水平的不合需要的组分，包括污染物。所述增补剂的不良味道和气味可能使得这类方式不受欢迎，并且可能阻碍患者依从。提供脂肪酸增补剂必须小心，因为过量撮入可能导致内源生物合成途径的抑制，并导致在体内与各种脂质组分中的其它必需脂肪酸竞争，从而导致不良结果。例如，ω3脂肪酸饮食量高的爱斯基摩人，其出血的倾向增加。(美国专利第4,874,603号)。
许多酶参与PUFA的生物合成。通过Δ12-去饱和酶由油酸(18∶1Δ9)生产亚油酸(LA，18∶2Δ9，12)。通过Δ6-去饱和酶由亚油酸(LA，18∶2Δ9，12)生产GLA(18∶3Δ6，9，12)。由二高-γ-亚麻酸(二高-γ-亚麻酸)(DGLA，20∶3Δ8，11，14)生产ARA(20∶4.Δ5，8，11，14)由Δ5-去饱和酶催化。然而，动物除在Δ9位外，不能去饱和，因此，不能将油酸(18∶1Δ9)转化为亚油酸(18∶2Δ9，12)。同样哺乳动物不能合成α-亚麻酸(ALA，18∶3Δ9，12，15)。其它真核生物，包括真菌和植物，具有于Δ12位和Δ15位去饱和的酶。因此，动物主要的多不饱和脂肪酸来自饮食和/或者得自亚油酸(18∶2Δ9，12)或∝-亚麻酸(18∶3Δ9，12，15)的去饱和及延长。因此，有价值的是，从天然产生这些脂肪酸的物种中获得参与PUFA生物合成的遗传物质，并在可以操作的微生物系统或动物系统中表达所分离的物质，以提供商业量的一种或多种PUFA的生产。因而，需要脂肪酸去饱和酶、编码脂肪酸去饱和酶的基因以及生产它们的重组方法；此外，需要含有相对高比例和/或富含特定PUFA的油。还需要生产特定PUFA的既经济、又可靠的方法。相关参考文献在USPN 5,552,306中描述了用Δ6-去饱和酶生产γ-亚麻酸。在USPN 5,376,541中公开了用高山被孢霉(Mortierella alpina)生产8，11-二十碳二烯酸(8，11-eicosadienoic acid)。在USPN 5,407,957中描述了用沟鞭藻生产二十二碳六烯酸。在PCT申请WO 96/13591和USPN5,614,400中描述了Δ6-棕榈酰-酰基载体蛋白去饱和酶的克隆。在PCT申请WO 96/21022中描述了从琉璃苣克隆Δ6-去饱和酶。在公布的专利申请PCT WO 91/13972、EP 0 550 162 A1、EP 0 561 569 A2、EP 0 644263 A2和EP 0 736 598 A1以及在USPN 5,057,419中描述了Δ9-去饱和酶的克隆。在PCT申请WO 94/11516和USPN 5,443,974中描述了从各种生物中克隆Δ12-去饱和酶。在PCT申请WO 93/11245中描述了从各种生物克隆Δ15-去饱和酶。本文引用的所有出版物和美国专利或申请均通过引用全面结合到本文中。
发明概述提供制备多不饱和长链脂肪酸的新组合物和方法。所述组合物包括编码Δ6-和Δ12-去饱和酶和/或具有Δ6-和/或Δ12-去饱和酶活性的多肽的核酸、所述多肽、分离并监测所述核酸或多肽的探针。所述方法涉及培养一种宿主微生物或动物，该宿主微生物或动物表达一种或多种引入的基因，其中所述基因至少编码一种去饱和酶，特别是Δ6-、Δ9-、Δ12-或Δ15-去饱和酶。所述方法也涉及使用反义构成物或基因断裂，以降低或消除不需要的去饱和酶的表达水平。所述去饱和酶多肽表达的调节，由于改变参与PUFA生物合成的酶和底物的浓度，因而提供相对增加的所需去饱和PUFA。本发明发现例如在大规模生产GLA、DGLA、ARA、EPA、DHA和SDA中的用途。
在一个本发明优选实施方案中，提供分离的核酸包括在图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ ID NO3)中描述的核苷酸序列、由按照图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ ID NO3)的核苷酸序列编码的多肽、以及包含图3A-E(SEQ ID NO2)或图5A-D(SEQ ID NO4)中描述的氨基酸序列的纯化或分离的多肽。在本发明的另一实施方案中，提供一种分离的核酸，它编码的多肽具有描述于图3A-E(SEQ IDNO2)或图5A-D(SEQ ID NO4)的氨基酸序列。
也提供一种分离的核酸，它包含一段编码多肽的核苷酸序列，该多肽在从羧基端起的碳6或碳12位将脂肪酸分子去饱和，其中所述核苷酸序列的平均A/T含量低于大约60％。在一个优选实施方案中，所述分离的核酸得自真菌，诸如被孢霉属的真菌。更优选的是真菌菌种高山被孢霉。
在本发明另一个优选实施方案中，提供分离的核酸，其中所述核酸的核苷酸序列描述于图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ ID NO3)中。本发明也提供于羧基端起的碳6或碳12位将脂肪酸分子去饱和的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽为真核多肽或由真核多肽衍生而来，其中优选的真核多肽得自真菌。
本发明还包括与图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ ID NO3)杂交的核酸序列。最好是这种分离的核酸，其核苷酸序列与图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ ID NO3)的同源性至少为大约50％。本发明也包括其核苷酸序列与图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ IDNO3)的同源性至少为大约50％的分离的核酸。在一个优选实施方案中，本发明的核酸包括一段核苷酸序列，它编码图3A-D(SEQ ID NO2)中描述的一段氨基酸序列，该段氨基酸序列选自氨基酸残基50-53、39-43、172-176、204-213和390-402。
本发明也提供核酸构成物，它包含描述于图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ ID NO3)、连接于异源核酸的核苷酸序列。在另一个实施方案中，提供的核酸构成物包含描述于图3A-E(SEQ ID NO1)或图5A-D(SEQ ID NO3)中的核苷酸序列，该核苷酸序列与在宿主细胞中有功能的表达控制序列操作性地连接。所述宿主细胞或者为真核细胞，或者为原核细胞。优选的真核宿主细胞为选自以下的细胞哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括鸟类细胞，优选的真菌细胞包括酵母细胞，而优选的藻类细胞为海洋藻类细胞。优选的原核细胞包括选自以下的细胞细菌、蓝细菌、含有噬菌体和/或病毒的细胞。所述重组宿主细胞的DNA序列最好含有在所述宿主细胞中具有功能的启动子，该启动子最好是诱导型的。在一个更优选的实施方案中，所述微生物细胞为被孢霉属的真菌细胞，更优选的真菌为高山被孢霉。
另外，本发明提供核酸构成物，它包含编码多肽的一段核苷酸序列，所述多肽包含的氨基酸序列对应于图3A-E(SEQ ID NO2)或图5A-D(SEQ ID NO4)中所描述的氨基酸序列或与其互补列，其中所述核酸与在微生物细胞中有功能的表达控制序列操作性地连接，其中所述核苷酸序列编码有功能活性的多肽，该多肽于从脂肪酸分子羧基端起的碳6或碳12位将脂肪酸分子去饱和。本发明的另一实施方案为包含下述核苷酸序列的核酸构成物，所述核苷酸序列编码有功能活性的Δ6-去饱和酶，该酶的氨基酸序列对应于图3A-E(SEQ ID NO2)中所描述的全部或部分氨基酸序列或与其互补，其中所述核苷酸序列与在宿主细胞中有功能的转录控制序列操作性地连接。
本发明的又一实施方案为包含核苷酸序列的核酸构成物，所述核苷酸序列编码有功能活性的Δ12-去饱和酶，该酶的氨基酸序列对应于图5A-D(SEQ ID NO4)中所描述的全部或部分氨基酸序列或与其互补，其中所述核苷酸序列与在宿主细胞中有功能的转录控制序列操作性地连接。所述宿主细胞或者为真核宿主细胞，或者为原核宿主细胞。优选的真核宿主细胞为选自以下的细胞哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括鸟类细胞，优选的真菌细胞包括酵母细胞，而优选的藻类细胞为海洋藻类细胞。优选的原核细胞包括选自以下的细胞细菌、蓝细菌、含有噬菌体和/或病毒的细胞。所述重组宿主细胞的DNA序列最好含在所述宿主细胞中有功能的启动子，且该启动子最好是诱导型的。一个优选的重组宿主细胞是微生物细胞，诸如酵母细胞，如酵母属(Saccharomyces)细胞。
本发明也提供重组微生物细胞，它包含至少一个拷贝的编码有功能活性的高山被孢霉脂肪酸去饱和酶的核酸，该酶的氨基酸序列正如图3A-E(SEQ ID NO2)中所描述的，其中所述细胞或所述细胞的亲代用包含所述DNA序列的载体转化，并且其中所述DNA序列与表达控制序列操作性地连接。在一个优选实施方案中，所述细胞为微生物细胞，它富含18∶2脂肪酸，特别是所述微生物细胞来自选自原核细胞和真菌细胞属时。在另一个优选实施方案中，按照本发明的微生物细胞包含对所述微生物细胞为内源性的表达控制序列。
本发明也提供在宿主细胞中生产GLA的方法，其中该方法包括在一定条件下培养宿主培养物，所述培养物具有的许多细胞含有一种或多种这样的核酸，所述核酸编码的多肽将LA转化为GLA，其中所述一种或多种核酸与表达控制序列操作性连接，由此表达所述一种或多种核酸，由此在该宿主细胞中生产GLA。在所述方法的几个优选实施方案中，用于该方法中的多肽为有功能活性的酶，它于从脂肪酸分子羧基端起的碳6位将脂肪酸分子去饱和；所述一种或多种核酸得自高山被孢霉；所述多肽的底物为外源供应；所述宿主细胞为微生物细胞；所述微生物细胞为酵母细胞，诸如酵母属细胞；而培养条件为可诱导的。
也提供包含一种或多种PUFA的油，其中所述一种或多种PUFA的量为大约0.3-30％的花生四烯酸(ARA)、大约0.2-30％的二高-γ-亚麻酸(DGLA)和大约0.2-30％的γ-亚油酸(GLA)。本发明优选的油为ARA∶DGLA∶GLA之比大约为1.0∶19.0∶30至6.0∶1.0∶0.2的油。本发明的另一优选实施方案为在药学上可接受的载体中包含所述油的药用制剂。还提供包含本发明油的营养组合物。本发明的营养组合物最好胃肠外或内部给予哺乳动物宿主。用于内部消耗的本发明的优选组合物是婴儿配制食品。在一个优选实施方案中，本发明的营养组合物为液体形式或固体形式，并且可以在食物增补剂中配制或配制为食物增补剂，而所述油以胶囊形式提供。本发明的油可以不含其它油的特殊组分，并可以得自微生物细胞，诸如酵母细胞。
本发明还提供将脂肪酸去饱和的方法。在一个优选实施方案中，该方法包括在适宜于表达由所述核酸编码的多肽的条件下，培养按照本发明的重组微生物细胞，其中所述宿主细胞还包含所述多肽的脂肪酸底物。也提供用这样一种方法去饱和的脂肪酸以及包含按照本发明方法生产的脂肪酸的油组合物。
本发明还包括纯化的核苷酸序列或多肽序列，所述序列与SEQ IDNO1-SEQ ID NO40中提出的核苷酸序列和肽序列大致相关或同源。本发明还涉及使用SEQ ID NO1至SEQ ID NO40中提出的序列，作为鉴别相关序列的探针、作为表达系统的组分和作为可用来生产转基因油的系统的组分。
本发明还涉及液体或固体形式、含有本发明长链脂肪酸的配制食品、食物增补剂或食物增补剂。这些配制食品和增补剂可以给予人类或动物。
本发明的配制食品和增补剂还可以包含至少一种选自以下的常量营养物(macronutrient)椰子油、豆油、canola油、甘油单酯和甘油二酯、葡萄糖、食用乳糖、电透析乳清、电透析脱脂乳、乳清、大豆蛋白和其它蛋白水解物。
本发明的配制食品还可以包括至少一种维生素，选自维生素A、C、D、E和复合维生素B；和至少一种矿物质，选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁。
本发明还涉及一种方法，治疗患有由多不饱和脂肪酸摄入不足或产生不足而引起疾病的患者，该方法包括给予所述患者本发明的食物代用品，其给予量足以实现治疗该患者。
本发明还涉及本发明物质的化妆品组合物和药用组合物。
本发明还涉及药学上可接受的载体中的转基因油。本发明还涉及含转基因油的营养增补剂、美容剂(cosmetic agent)和婴儿配制食品。
本发明还涉及获得被改变的长链多不饱和脂肪酸生物合成的方法，它包括以下步骤在一定条件下，培养具有含转基因细胞的微生物，所述转基因编码的转基因表达产物于从脂肪酸分子的羧基端起碳6或碳12位将所述脂肪酸分子去饱和，其中所述转基因与表达控制序列操作性地连接，由此表达所述转基因，改变所述细胞中长链多不饱和脂肪酸的生物合成。
本发明还涉及包括至少一种选自以下的营养物的药用组合物维生素、矿物质、碳水化合物、糖、氨基酸、游离脂肪酸、磷脂、抗氧化剂和酚类化合物。
附图简述

图1展示多种生物由棕榈酸(C16)合成花生四烯酸(20∶4Δ5，8，11，14)和硬脂四烯酸(18∶4Δ6，9，12，15)的可能途径，所述生物包括藻类、被孢霉属和人类。这些PUFA可以用作对人类和其它动物重要的其它分子的前体，所述重要的其他分子包括前列环素、白三烯和前列腺素，显示了其中某些的可能途径。
图2展示再次从多种生物搜集的、生产除ARA外的PUFA(包括EPA和DHA)的可能途径。
图3A-E展示高山被孢霉Δ6-去饱和酶的DNA序列和推导的氨基酸序列图3A-E(SEQ ID NO 1Δ6去饱和酶cDNA)图3A-E(SEQ ID NO 2Δ6去饱和酶的氨基酸)图4展示高山被孢霉Δ6-去饱和酶的部分氨基酸序列与其它相关序列的序列对比。
图5A-D展示高山被孢霉Δ12-去饱和酶的DNA序列和推导的氨基酸序列图5A-D(SEQ ID NO 3Δ12去饱和酶cDNA)。
图5A-D(SEQ ID NO 4Δ12去饱和酶的氨基酸)。
图6A和6B展示不同表达构成物在酵母中对GLA表达的影响。
图7A和7B显示宿主菌株对GLA生产的影响。
图8A和8B显示在酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC334中温度对GLA生产的影响。
图9显示Ma 29的蛋白序列和重叠群253538a的序列对比。
图10显示Ma 524的蛋白序列和重叠群253538a的序列对比。
序列表简述SEQ ID NO1显示高山被孢霉Δ6-去饱和酶的DNA序列。
SEQ ID NO2显示高山被孢霉Δ6-去饱和酶的蛋白序列。
SEQ ID NO3显示高山被孢霉Δ12-去饱和酶的DNA序列。
SEQ ID NO4显示高山被孢霉Δ12-去饱和酶的蛋白序列。
SEQ ID NO5-11显示各种去饱和酶的序列。
SEQ ID NO13-18显示各种PCR引物的序列。
SEQ ID NO19和SEQ ID NO20显示盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)去饱和酶的核苷酸序列和氨基酸序列。
SEQ ID NO21和SEQ ID NO22显示Phaeodactylum tricornutum去饱和酶的核苷酸序列和氨基酸序列。
SEQ ID NO23-26显示Schizochytrium cDNA克隆的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO27-33显示人类去饱和酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO34-SEQ ID NO40显示人类去饱和酶的肽序列。
优选实施方案的描述为了确保完全理解本发明，提供以下定义Δ5-去饱和酶Δ5去饱和酶是在距脂肪酸分子羧基端的碳5和碳6位之间引入双键的酶。
Δ6-去饱和酶Δ6-去饱和酶在距脂肪酸分子羧基端的碳6和碳7位之间引入双键的酶。
Δ9-去饱和酶Δ9-去饱和酶在距脂肪酸分子羧基端的碳9和碳10位之间引入双键的酶。
Δ12-去饱和酶Δ12-去饱和酶在距脂肪酸分子羧基端的碳12和碳13位之间引入双键的酶。
脂肪酸脂肪酸是含有长烃链和一个末端羧基的一类化合物。脂肪酸包括如下
考虑到这些定义，本发明涉及新的DNA序列、DNA构成物，提供允许调整例如微生物细胞或动物的长链多不饱和脂肪酸含量的方法和组合物。对宿主细胞进行操作，以表达编码多肽的DNA的有义或反义转录物，所述多肽催化脂肪酸的去饱和。所表达酶的底物可以由宿主细胞产生，或可以外部供给。为了实现表达，所转化的DNA与在该宿主细胞中有功能的转录和翻译的起始和终止调节区操作性地连接。可以提供包含待表达基因的构成物，以使其整合入该宿主细胞的基因组中，或可以在该宿主细胞中自主复制。为了生产亚油酸(LA)，一般使用的表达盒包括这样一个盒，它提供Δ12-去饱和酶活性，特别是在产生或可以吸收油酸的宿主细胞中(美国专利第5,443,974号)。通过提供限制酶活性的Δ9-去饱和酶的表达盒，也可以增加LA的产量。对于ALA的生产，一般使用的表达盒包括这样一个盒，它提供Δ15-或ω3-去饱和酶活性，特别是在产生或可以吸收LA的宿主细胞中。对于GLA或SDA的生产，一般使用的表达盒包括这样一个盒，它提供Δ6-去饱和酶活性，特别是在分别产生或可以吸收LA或ALA的宿主细胞中。ω6-类型的不饱和脂肪酸(诸如LA或GLA)的生产在不能产生ALA的宿主微生物或动物中是有利的。通过抑制Δ15-或ω3-类型的去饱和酶的活性，可以消除、降低和/或抑制宿主ALA的产生(参见图2)。通过提供反义Δ15或ω3转录物的表达盒进行的标准选择；通过插入、缺失、置换部分或全部所述靶基因，以破坏靶Δ15-或ω3-去饱和酶基因；或通过加入Δ15-或ω3-去饱和酶的抑制剂，可完成这一步。同样，通过提供反义Δ6转录物的表达盒、通过破坏Δ6-去饱和酶基因、或通过使用Δ6-去饱和酶抑制剂，在具有Δ6-去饱和酶活性的微生物或动物中生产LA或ALA是有利的。
脂肪酸的微生物生产微生物生产脂肪酸与从诸如鱼类或植物的天然资源纯化脂肪酸相比，有几个优势。已知与高等生物的油组成相比，许多微生物具有大大简化的油组成，这使得更容易纯化所需组分。微生物生产不易受诸如天气和食物供应这些外部变化引起的波动。微生物生产的油大体上没有环境污染物的污染。另外，微生物可以提供可能具有特殊用途的特定形式的PUFA。例如，螺旋藻属(Spirulina)可以提供于甘油三酯的第一位和第三位占优势的PUFA；用胰腺脂酶消化，优先从这些位置释放脂肪酸。在人类和动物摄入得自螺旋藻属的甘油三酯后，这些PUFA作为游离脂肪酸由胰腺脂酶释放出来，因此可例如直接用于婴儿脑的发育。另外，通过控制培养条件，特别是通过提供微生物表达酶的特定底物，或通过加入抑制不希望有的生化途径的化合物，可操纵油的微生物生产。除这些优势外，通过在宿主中提供新的合成途径，或通过抑制不希望有的途径，由重组微生物生产脂肪酸提供改变天然存在的微生物脂肪酸分布型的能力，由此提高所需PUFA或其结合形式的水平，并降低不希望有的PUFA的水平。
在动物中脂肪酸的生产在动物中生产脂肪酸也有几个优点。在动物中表达去饱和酶基因，可以在动物组织中产生水平大大提高的所需PUFA，使得从那些组织进行的回收更加经济。例如，很好地建立了在动物乳中表达所需PUFA并从动物乳中分离PUFA的方法。除了提供用于纯化所需PUFA的资源外，可以通过单独或结合其它人类基因表达去饱和酶基因，对动物乳进行操作，以在婴儿发育的不同阶段提供与人乳大致相似的动物乳。当不可能或不希望人类哺乳时，或在营养不良或疾病的情况下，人化的动物乳可以用作婴儿配制食品。
根据所述宿主细胞、底物的可获量以及所需的终产物，几种多肽、特别是去饱和酶是有价值的。“去饱和酶”是指这样一种多肽，它可以使一种或多种脂肪酸去饱和，产生单或多不饱和脂肪酸或其有价值的前体。特别有价值的是这样的多肽，它可以催化以下转化硬脂酸转化为油酸、油酸转化为LA、LA转化为ALA、LA转化为GLA或ALA转化为SDA，所述多肽包括于Δ9、Δ12，(ω6)、Δ15，(ω3)或Δ6位去饱和的酶。“多肽”是指任何氨基酸链，与长度或例如糖基化或磷酸化的翻译后修饰无关。对于选择具有去饱和酶活性的具体多肽的考虑，包括该多肽的最适pH、该多肽是否为限速酶或其组分、所用的去饱和酶对于所需多不饱和脂肪酸的合成是否为必需的、和/或该多肽需要的辅因子。所表达的多肽最好具有与它在宿主细胞中所在位置的生化环境相匹配的参数。例如，该多肽可能必须与该宿主细胞中的其它酶竞争底物。因此，在确定给定宿主细胞中给定多肽改善PUFA生产的适应性方面，考虑所述多肽的Km和比活的分析。在特定情况下使用的多肽是这样的多肽，它可以在目的宿主细胞中存在的条件下起作用，但在其它情况下可以是具有去饱和酶活性的任何多肽，它具有能够改善所需PUFA相对生产的所需特征。
对于由油酸生产亚油酸，所用的DNA序列编码具有Δ12-去饱和酶活性的多肽。对于由亚油酸生产GLA，所用的DNA序列编码具有Δ6-去饱和酶活性的多肽。在特定情况下，Δ6-去饱和酶活性的表达可以与Δ12-去饱和酶活性的表达相偶联，并且例如通过提供生产Δ15-去饱和酶转录产物的反义序列的转录盒，通过破坏Δ15-去饱和酶基因，或通过使用天然的或已经突变的、其Δ15-去饱和酶活性低的宿主细胞，可任选地除去所述宿主细胞中存在的任何Δ15-去饱和酶活性。通过使用特定的去饱和酶抑制剂，诸如在美国专利第4,778,630号中描述的那些抑制剂，也可以完成不对不希望的去饱和酶途径的抑制。此外，用于Δ6-去饱和酶表达的宿主细胞可以具有高的Δ12-去饱和酶活性，或该宿主细胞已经突变成具有高Δ12-去饱和酶活性。所用盒的组合的选择部分取决于该宿主细胞的PUFA分布型和/或去饱和酶分布型。当该宿主细胞表达Δ12-去饱和酶活性，且在缺乏Δ15-去饱和酶活性或该酶活性被除去的情况下，单独过量表达Δ6-去饱和酶一般足以提供增加GLA的产量。在该宿主细胞表达Δ9-去饱和酶活性的情况下，Δ12-和Δ6-去饱和酶的表达可以提供增加的GLA的产量。当Δ9-去饱和酶活性缺乏或有限时，可以使用Δ9-去饱和酶的表达盒。图2显示了由硬脂酸(18∶0)合成花生四烯酸(20∶4Δ5，8，11，14)的流程。该途径中的关键酶为Δ6-去饱和酶，它将亚油酸转化为γ-亚麻酸。也显示了由Δ6-去饱和酶使α-亚麻酸(ALA)向硬脂四烯酸的转化。
具有去饱和酶活性的多肽源具有去饱和酶活性的多肽和编码这类多肽的寡核苷酸来源是产生所需多不饱和脂肪酸的生物。作为一个实例，具有产生GLA或ARA能力的微生物可以用作Δ6-或Δ12-去饱和酶活性源。这类微生物包括例如属于以下属的微生物被孢霉属、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophathora)、青霉属(Penicillium)、Porphyridium、Coidosporium、毛霉属(Mucor)、镰孢属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)和虫霉属(Entomophthora)。在Porphyridium内，特别有价值的是Porphyridium cruentum。在被孢霉属内，特别有价值的是长被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)、拉曼被孢霉angulispora变种(Mortierella ramanniana，var.angulispora)和高山被孢霉。在毛霉属内，特别有价值的是卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和爪哇毛霉(Mucor javanicus)。
可以以多种方法鉴定编码所需去饱和酶的DNA。作为一个实例，用可检测的、酶促或化学合成的探针，筛选所需的去饱和酶源，例如筛选来自被孢霉属的基因组DNA或cDNA文库，所述探针可以由DNA、RNA或非天然存在的核苷酸或它们的混合物制备。可以用由已知的去饱和酶的DNA酶促合成探针，用于正常或严格性降低的杂交法。寡核苷酸探针也可以用来筛选资源，并可以基于已知的去饱和酶的序列，包括已知的去饱和酶中保守的序列，或基于得自所需纯化蛋白的肽序列。基于氨基酸序列的寡核苷酸探针可以是简并的，以包括遗传密码的简并性，或可以是有倾向性的，以利于所述源生物的优选密码子。寡核苷酸也可以用作从来自已知来源或推测来源的反转录的mRNA进行PCR的引物；所述PCR产物可以是全长的cDNA，或可以用来产生探针，以获得所需的全长cDNA。或者，可以对所需蛋白进行完全测序，并进行编码该多肽DNA的全合成。
一旦分离出所需的基因组DNA或cDNA，则可以用已知方法测序。本领域认识到，这类方法易发生错误，使得通常对同一区域进行多次测序，并且在产生的推导序列中，特别是在具有重复域、广泛的二级结构或异常的碱基组成诸如具有高GC碱基含量的区域中，预计仍导致可测的错误率。当产生差异时，可以进行重新测序，并且可以使用特殊的方法。特殊的方法可以包括通过使用不同的温度；不同的酶；改变寡核苷酸形成高级结构能力的蛋白质；改变的核苷酸，诸如ITP或甲基化dGTP；不同的凝胶组成，例如加入甲酰胺；不同的引物或位于距问题区域不同距离的引物；或不同的模板，诸如单链DNA，来改变测序条件。也可以进行对mRNA的测序。
对绝大部分情况而言，具有去饱和酶活性的多肽的某些或全部编码序列来自天然来源。然而，在某些情况下，例如为增强表达，最好是通过使用宿主优选的密码子修改全部或部分密码子。可以由特定目的宿主物种中最大量表达的蛋白质中最高频率的密码子，确定宿主优选的密码子。因此，可以全部和部分合成具有去饱和酶活性的多肽的编码序列。也可以合成全部或部分所述DNA，以去除能存在于转录的mRNA中二级结构的去稳定化的序列或区域。还可以合成全部或部分所述DNA，以将碱基组成改变为所需宿主细胞中更优选的碱基组成。在文献中很好建立了合成序列并使序列连接在一起的方法。体外诱变和选择、定点诱变或其它方法可以用来获得天然存在的去饱和酶基因的突变，以产生具有体内去饱和酶活性、具有更理想的物理学和动力学参数以在所述宿主细胞中起作用的多肽，所述参数诸如半衰期更长或所需多不饱和脂肪酸的生产速率更高。
高山被孢霉的去饱和酶特别有价值的是高山被孢霉的Δ6-去饱和酶，它有457个氨基酸，预测的分子量为51.8kD；图3显示了其氨基酸序列。编码高山被孢霉Δ6-去饱和酶的基因可以在转基因微生物或动物中表达，以更多地实现由亚油酸合成GLA，或由ALA合成硬脂四烯酸。也可以使用与高山被孢霉Δ6-去饱和酶DNA大致相同的其它DNA，或其编码的多肽与高山被孢霉Δ6-去饱和酶多肽大致相同的DNA。大致相同是指氨基酸序列或核酸序列与高山被孢霉Δ6-去饱和酶的氨基酸序列或编码该氨基酸序列的核酸序列，按照优选增加的顺序(in order of increasingpreference)，表现出的同源性至少为60％、80％、90％或95％。对于多肽，比较序列的长度一般至少为16个氨基酸，优选为至少20个氨基酸，或最优选至少为35个氨基酸。对于核酸，比较序列的长度一般至少为50个核苷酸，优选至少为60个核苷酸，更优选至少为75个核苷酸，最优选至少为110个核苷酸。通常采用以下序列分析软件测量同源性例如Genetics Computer Group (University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705)的序列分析软件包、MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228 S.Park St.，Madison，Wisconsin 53715)和MacVector(Oxford Molecular Group，2105 S.Bascom Avenue，Suite 200，Campbell，California 95008)。这类软件通过对各种置换、缺失和其它修饰指定同源性程度，来匹配相似的序列。保守置换通常包括在以下组内的置换甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。也可以在保守的疏水性或亲水性的基础上(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157105-132，1982)，或在呈现相似多肽二级结构的能力的基础上(Chou和Fasman，Adv.Enzymol.4745-148，1978)，进行置换。
高山被孢霉的Δ12-去饱和酶也有价值，图5显示了其核苷酸序列和氨基酸序列。编码高山被孢霉Δ12-去饱和酶的基因可以在转基因微生物或动物中表达，以实现由油酸更多地合成LA。也可以使用与高山被孢霉Δ12-去饱和酶DNA大致相同的其它DNA，或可使用编码的多肽与高山被孢霉Δ12-去饱和酶多肽大致相同的DNA。
其它去饱和酶本发明包括来自相同生物或其它生物的相关去饱和酶。这类相关的去饱和酶包括在被孢霉属相同种或不同种内天然存在的、公开的Δ6-或Δ12-去饱和酶变异体、以及来自其它物种的、与公开的Δ6-或Δ12-去饱和酶同源的变异体。也包括这样的去饱和酶，所述去饱和酶尽管与高山被孢霉的Δ6-或Δ12-去饱和酶不是大致相同，但分别于距脂肪酸分子羧基端碳6或碳12处将脂肪酸分子去饱和，或于18碳的脂肪酸分子中距末端甲基碳为碳12或碳6处将脂肪酸分子去饱和。可以通过其作用能力与公开的去饱和酶功能大致相同，来鉴别相关的去饱和酶；也就是说，仍能够有效地将LA转化为GLA，将ALA转化为SDA或将油酸转化为LA。通过就与公开的去饱和酶的序列同源性而筛选序列数据库，通过基于公开的去饱和酶的探针与从源生物构建的文库进行杂交，或通过采用源生物的mRNA和基于公开的去饱和酶的探针进行RT-PCR，也可以鉴定相关的去饱和酶。这类去饱和酶包括来自人类、盘基网柄菌和Phaeodactylum tricornum的去饱和酶。
可以通过常规诱变、表达产生的突变多肽和测定其活性，来确定对于去饱和酶活性重要的去饱和酶多肽区域。突变体可以包括缺失、插入和点突变或它们的组合。典型的功能分析开始于缺失诱变，以确定该蛋白功能所必需的N-端或C-端极限，然后制备内部缺失、插入和点突变，以进一步确定功能所必需的区域。也可以使用其它技术，诸如盒式诱变和全合成。例如通过用外切核酸酶顺序去除5’或3’编码区，来完成缺失诱变。可获得用于这类技术的试剂盒。缺失后，通过将含有起始密码子或终止密码子的寡核苷酸分别与5’或3’缺失后的缺失编码区连接，以完成所述编码区。或者，通过种种方法，包括定点诱变、诱变PCR或通过在现有的限制性位点消化的DNA上连接，将编码起始密码子或终止密码子的寡核苷酸插入该编码区中。通过各种方法，包括使用DNA现存的限制性位点、通过利用诱变引物定点诱变或诱变PCR，可相似地制备内部缺失。通过诸如接头-扫描诱变、定点诱变或诱变PCR的方法，制备插入。通过诸如定点诱变或诱变PCR的技术制备点突变。
也可以使用化学诱变来鉴别去饱和酶多肽中对于活性重要的区域。表达突变的构成物，并分析产生的改变了的蛋白作为去饱和酶起作用的能力。这类结构-功能分析可以确定哪些区可以改变、哪些区耐受插入以及那些点突变允许该突变蛋白以与天然去饱和酶大致相同的方式起作用。所有这类突变蛋白和编码它们的核苷酸序列均在本发明的范围内。
去饱和酶基因的表达一旦获得了编码去饱和酶多肽的DNA，则将其置于能够在宿主细胞中复制的载体中，或通过诸如PCR或长PCR的技术进行体外增殖。复制型载体可包括质粒、噬菌体、病毒、粘粒等等。所希望的载体包括可用于目的基因诱变、或用于目的基因在宿主细胞中表达的那些载体。长PCR的技术已经使得大构成物的体外增殖成为可能，因此，对目的基因的修饰，诸如诱变或加入表达信号，以及产生的构成物的增殖可以完全在体外发生，而不使用复制型载体或宿主细胞。
为了表达去饱和酶多肽，将功能性转录和翻译起始区和终止区与编码该去饱和酶多肽的DNA操作性地连接。该多肽编码区的表达可以在体外发生，或在宿主细胞中发生。转录和翻译起始区和终止区得自种种非限制性的来源，包括待表达的DNA、已知或推测能够在所需系统中表达的基因、表达载体、化学合成或来自宿主细胞中的内源基因座。
体外表达例如通过将去饱和酶多肽的编码区置于为体外使用而设计的表达载体中，并加入兔网织红细胞裂解物和辅因子，则可以完成体外表达；如果需要，可以掺入标记的氨基酸。这类体外表达载体可以提供在所用的系统中必需的某些或全部表达信号。这些方法是本领域众所周知的，该系统的组分为市售的。然后可以例如通过测定其活性，直接测定该反应混合物中的多肽，或可以纯化合成的多肽，然后进行测定。
在宿主细胞中的表达可以以瞬时方式或稳定方式完成在宿主细胞中的表达。瞬时表达可以由引入的构成物产生，所述构成物含有在该宿主细胞中起作用的表达信号，但所述构成物在该宿主细胞中不复制并极少整合，或该宿主细胞不增殖。也可以通过诱导与目的基因操作性连接的可调节启动子的活性，完成瞬时表达，尽管这类诱导型系统通常表现出低基础水平的表达。通过引入可以整合到宿主基因组的构成物或在该宿主细胞中自主复制的构成物，可以完成稳定的表达。通过利用位于该表达构成物上或用该表达构成物转染的选择标记，然后通过选择表达该标记的细胞，可以选择目的基因的稳定表达。当稳定表达产生于整合时，构成物的整合可以随机发生在宿主基因组中，或可以通过使用含有与宿主基因组同源的区域(该区域足以定向引导与该宿主基因座重组)的构成物，定向引导构成物的整合。当将构成物导向内源基因座时，该内源基因座可以提供所有或某些转录和翻译调节区。
当需要该去饱和酶多肽在源生物中的表达增加时，可以使用几种方法。可以将编码该去饱和酶多肽的另外的基因引入宿主生物中。通过同源重组，例如通过将较强的启动子插入宿主基因组中，以引起表达增加，通过从宿主基因组中缺失去稳定序列的信息，而从mRNA或者所编码的蛋白中去除去稳定序列，或通过将稳定化序列加入该mRNA中(USPN 4,910,141)，也可以增加天然去饱和酶基因座的表达。
当希望表达一种以上不同的基因时，可以使用合适的调节区和表达方法，通过使用复制型载体或通过整合入宿主基因组中，在宿主细胞中增殖引入的基因。在由独立复制的载体表达两种或两种以上基因的情况下，最好是每种载体具有不同的复制方式。每个引入的构成物，无论其是否整合，均应该有不同的选择方式，且应该与其它构成物缺乏同源性，以维持稳定的表达，并防止构成物中元件的再分配。调节区的合理选择、引入的构成物的选择方法和增殖方法可以通过实验而确定，使得所有引入的基因在必需水平上表达，以提供所需产物的合成。
作为实例，当该宿主细胞为酵母时，提供在酵母细胞中有功能的转录和翻译区，特别是来自该宿主物种的转录和翻译区。例如可以从糖酵解途径中的基因，诸如醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸激酶等的基因，或从诸如酸性磷酸酶、乳糖酶、金属硫蛋白、葡糖淀粉酶等的可调节基因，获得转录起始调节区。在特殊情况下，根据是需要组成型转录还是诱导型转录、启动子与目的可读框结合的特定效率、将强启动子与提供诱导型转录的不同启动子的控制区结合的能力、构建的容易性等等，可以使用多种调节序列中的任何一种。特别有价值的是在半乳糖存在下被激活的启动子。半乳糖诱导型启动子(GAL1、GAL7和GAL10)已被广泛地用于在酵母中高水平和可调节地表达蛋白(Lue等，Mol.Cell.Biol.第7卷，第3446页，1987；Johnston，Microbiol.Rev.第51卷，第458页，1987)。来自GAL启动子的转录由GAL4蛋白激活，该蛋白结合于该启动子区，并当半乳糖存在时激活转录。在缺乏半乳糖时，拮抗物GAL80结合于GAL4，并阻止GAL4激活转录。加入半乳糖阻止GAL80抑制由GAL4产生的激活。
已经发现翻译起始密码子ATG周围的核苷酸序列影响在酵母细胞中的表达。如果所需多肽在酵母表达差，则可以修饰外源基因的核苷酸序列，使其包括一段有效的酵母翻译起始序列，以获得最适的基因表达。对于在酵母属中的表达，可以通过将无效表达的基因与一种酵母属内源基因(最好是高度表达的基因，诸如乳糖基因)符合读框地融合，对所述无效表达的基因进行定点诱变来进行这一步。
终止区可以得自该基因的3’区，起始区得自该基因或来自不同的基因。已知或已经发现大量的终止区在来自相同和不同属和种的多种宿主中是令人满意的。终止区的选择通常更多的是为了方便起见，而不是因为任何特殊的性质。最好是，终止区得自酵母基因，特别是酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。还已知两种哺乳动物基因γ干扰素和α2干扰素基因的3’区在酵母中起作用。
将构成物引入宿主细胞中可以用标准技术，将包含目的基因的构成物引入宿主细胞。这些技术包括转化、原生质体融合、脂质转染、转染、转导、接合、感染、弹道冲击(bolistic impact)、电穿孔、微注射、划痕或将目的基因引入该宿主细胞的任何其它方法。所用的转化方法包括乙酸锂转化(Methods in Enzymology，第194卷，第186-187页，1991)。为了方便起见，本文将已经用任何方法操作摄入DNA序列或构成物的宿主细胞，称为“转化的”或“重组的”。
主题宿主将具有至少一个拷贝的表达构成物，可以具有两个或多个拷贝，这取决于该基因是否整合入基因组、扩增、或存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。当主题宿主为酵母时，可以使用四个主要类型的酵母质粒载体酵母整合型质粒(YIp)、酵母复制型质粒(YRp)、酵母着丝粒质粒(YCp)和酵母游离型质粒(YEp)。YIp缺乏酵母复制起点，必需作为在酵母基因组中整合的元件繁殖。YRp具有得自染色体的自主复制序列，作为中等拷贝数(20-40)的自主复制型、不稳定分离的质粒繁殖。YCp具有复制起点和着丝粒序列，作为低拷贝数(10-20)的自主复制型、稳定分离的质粒繁殖。YEp具有来自酵母2μm质粒的复制起点，作为高拷贝数的自主复制型、不规则分离的质粒繁殖。通过对该质粒上的标记维持选择，可以确保在酵母中存在所述质粒。特别有价值的是酵母载体pYES2(一种得自Invitrogen的YEp质粒，提供尿嘧啶原养型，并提供用于表达的一个GAL1半乳糖诱导型启动子)、pRS425-pG1(一种YEp质粒，得自T.H.Chang博士(俄亥俄州立大学的分子遗传学助教授)，含有一个组成型GPD启动子，并提供亮氨酸原养型)和pYX424(一种YEp质粒，具有一个组成型TP1启动子，提供亮氨酸原养型；Alber，T.and Kawasaki，G.(1982).J.Mol.& Appl.Genetics1419)。
可以通过对所引入构成物上含有的标记进行选择，来鉴定转化的宿主细胞。或者，由于为许多转化技术可将许多DNA分子引入宿主细胞，可以将独立的标记构成物与所需构成物一起引入。通常，根据细胞在选择培养基上生长的能力，来选择转化的宿主。选择培养基可以掺入抗生素，或缺乏未转化宿主生长所必需的因子，诸如营养物或生长因子。为此引入的标记基因可以赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，并且当在转化的宿主中表达时，允许在选择培养基上生长。当可以直接或间接检测所表达的标记蛋白时，也可选择转化的宿主。该标记蛋白可以单独表达，或作为与另一蛋白的融合体表达。可以根据标记蛋白的酶活性检测该标记蛋白；例如，β半乳糖苷酶可以将底物X-gal转化为有色产物，而荧光素酶可以将荧光素转化为发光产物。可以根据标记蛋白发光或修饰的特征，检测该标记蛋白；例如，Aequorea victoria的绿色荧光蛋白用蓝光照射时发荧光。可用抗体检测该标记蛋白或例如目的蛋白上的分子标记。例如，可以目测或用诸如FACS或用抗体的淘选的技术，选择表达该标记蛋白或标记的细胞。可以用在酵母中发挥作用的任何标记，选择酵母转化子。希望的是卡那霉素抗性和氨基糖苷G418、以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸或色氨酸的培养基上生长的能力。
特别有价值的是Δ6-和Δ12-去饱和酶介导的在原核宿主细胞和真核宿主细胞中PUFA的生产。有价值的原核细胞包括埃希氏菌属(Eschericia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、蓝细菌属(cyanobacteria)等等。真核细胞包括哺乳动物细胞(诸如哺乳期动物细胞)、鸟类细胞(诸如鸡细胞)和适合于遗传操作的其它细胞，包括昆虫细胞、真菌细胞和藻类细胞。所述细胞可以作为宿主生物(包括动物)的部分或全部而被培养或形成。在生产PUFA，特别是用于转移、细胞导向和选择中，也可以与所述细胞一起使用病毒和噬菌体。在一个优选实施方案中，该宿主是产生和/或可以同化外部供应的Δ6-和/或Δ12-去饱和酶底物的任何微生物或动物，最好是产生大量的一种或多种底物的微生物或动物。宿主动物的实例包括小鼠、大鼠、兔子、鸡、鹌鹑、火鸡、牛、绵羊、猪、山羊、牦牛等，它们适合于遗传操作和快速扩大的表达转基因群体的克隆。对于动物，通过修饰基因的调节区，可使去饱和酶转基因适合于以在靶细胞器、组织和体液中表达。特别有价值的是在该宿主动物的乳中生产PUFA。
在酵母中表达宿主微生物的实例包括酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)或诸如念珠菌属、克鲁维酵母属的其它酵母、或其它真菌，例如丝状真菌，诸如曲霉属、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属等。宿主微生物的所需特征例如为，它在遗传上被很好地进行了特征鉴定，采用超高密度发酵时，能用于高水平表达产物，以及由于打算将计划的终产物用于人类摄入，因此列于GRAS(一般认为是安全的)表上。特别有价值的是使用酵母，更特别是面包酵母(S.cerevisiae)，作为本发明的宿主细胞。特征有价值的菌株是SC334(Mat α pep4-3prb1-1122 ura3-52 leu2-3，112 reg1-501 gal1；Gene 8357-64，1989，Hovland P.等)、YTC34(αade2-101 his3Δ200 lys2-801 ura3-52；得自T.H.Chang博士，俄亥俄州立大学的分子遗传学助教授)、YTC41(a/αura3-52/ura3＝52 lys2-801/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trp1-Δ1/trp1-Δ1his3Δ200/his3Δ200 leu2Δ1/leu2Δ1；得自T.H.Chang博士，俄亥俄州立大学的分子遗传学助教授)、BJ1995(得自the Yeast Genetic StockCentre，1021 Donner Laboratory，Berkeley，CA 94720)、INVSC1(Matα hiw3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52；得自Invitrogen，1600 Faraday Ave.，Carlsbad，CA 92008)和INVSC2(Matαhis3Δ200 ura3-167；得自Invitrogen)。
在鸟类物种中表达为了在诸如鸡、火鸡、鹌鹑和鸭的鸟类物种和细胞中生产PUFA，按照本领域抑制的方法，将编码Δ6和/或Δ12-去饱和酶的核酸序列引入所述细胞，进行基因转移。如果需要转基因动物，则可以提供具有下述载体的胚胎多能干细胞，所述载体携带编码去饱和酶的转基因，并使多能干细胞发育为成年动物(USPN 5,162,215；Ono等(1996)Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3)287-292；WO9612793；WO 9606160)。在大多数情况下，将修饰该转基因以表达高水平的去饱和酶，以便增加PUFA的产量。例如，可以通过提供在鸟类细胞中起作用的转录和/或翻译调节区，诸如在特定组织和例如蛋黄的蛋组分中指导表达的启动子，来修饰转基因。所述基因调节区可以得自多种来源，包括鸡贫血症病毒，或鸟白血病病毒或诸如鸡卵清蛋白基因的鸟类基因。
在昆虫细胞中表达可以采用带有一个或多个去饱和酶转基因的杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中生产PUFA。杆状病毒表达载体可得自几种商业来源，诸如Clonetech。也提供产生藻类(诸如海洋藻类)杂种和转基因品系的方法，其中所述藻类品系含有并表达去饱和酶转基因。例如可以按USPN5,426,040中所述，制备转基因海洋藻类。象上述其它表达系统一样，通过使该多肽编码序列与选择用于特殊用途的合适的转录和翻译调节区相适应，可以调节该去饱和酶转基因表达和活性的定时、程度。特别有价值的是可以在预选定的生长条件下被诱导的启动子区。例如，将温度敏感型突变和/或代谢物反应性突变引入到所述去饱和酶转基因的编码序列、其调节区和/或引入了该转基因的细胞的基因组中，这种方法可用于此意图。
在适于所需最终结果的合适条件下，培养转化的宿主细胞。对于在培养基中生长的宿主细胞，通常优化所述条件，以生产最大产量或最经济产量的PUFA，这涉及选定的去饱和酶活性。可以优化的培养基条件包括碳源、氮源、加入的底物、所加底物的终浓度、所加入底物的形式、需氧或厌氧生长、生长温度、诱导剂、诱导温度、诱导下的生长期、收获时的生长期、pH、密度和选择的维持。诸如酵母这样的目的微生物最好在选择培养基中生长。对于酵母，最好使用复合培养基，诸如蛋白胨培养液(YPD)或已知成分培养基(含有氨基酸、酵母氮碱和硫酸铵，并缺乏用于选择的组分，例如尿嘧啶)。理想的是，将待加入的底物首先溶于乙醇中。必要时，可以例如通过包含或加入半乳糖以诱导来自GAL启动子的表达诱导目的多肽的表达。
在植物中表达可以采用各种植物转化系统，在植物中生产PUFA；诸如使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、植物病毒、粒子细胞转化和在申请人的相关申请美国申请序列第08/834,033号和第08/956,985号以及与该申请同时申请的部分继续申请中公开的此类系统，所述申请通过引用结合到本文中。
在动物中表达可以同样以瞬时或稳定的方式，完成在宿主动物细胞中的表达。通过已知的方法，例如感染和脂质转染，可完成瞬时表达，并可以重复进行瞬时表达，以便维持所引入的构成物的所需表达水平(参见Ebert，PCT申请WO 94/05782)。通过将构成物整合入宿主基因组，产生转基因动物，则可以完成稳定表达。可以例如通过将该构成物微注射入受精卵的前核，或通过转染、反转录病毒感染或其它技术，引入该构成物，由此将该构成物引入到可以形成成年动物或掺入成年动物的细胞系中(美国专利第4,873,191号；美国专利第5,530,177号；美国专利第5,565,362号；美国专利第5,366,894号；Willmut等(1997)Nature385810)。将重组的卵或胚胎转移至代理母亲中(美国专利第4,873,191号；美国专利第5,530,177号；美国专利第5,565,362号；美国专利第5,366,894号；Wilmut等(出处同上))。
出生后，对转基因动物进行鉴定，例如根据所引入的标记基因的存在(诸如毛色)，或通过血液、乳或组织样品的PCR或DNA印迹，以检测所引入的构成物，或通过免疫测定或酶法测定，以检测所表达的蛋白或由其产生的产物(美国专利第4,873,191号；美国专利第5,530,177号；美国专利第5,565,362号；美国专利第5,366,894号；Wilmut等(出处同上))。所得的转基因动物可能完全是转基因的，或可能是仅在一个细胞亚群具有该转基因的嵌合体。通过将具核细胞与去核卵融合、然后转移入代理母亲，则完成哺乳动物的克隆，这种技术的出现使在获得的包含所引入构成物的“建立者”动物或细胞时进行快速、大规模的生产成为可能；在此之前，该转基因必需存在于该动物的生殖系中，以进行繁殖(Wilmut等(出处同上))。
在宿主动物中表达出现了一定的效率，特别在该宿主为家畜的情况下。为了在容易得自该宿主动物的流体(诸如乳)中生产PUFA，可以在雌性宿主的乳房细胞(mammary cell)中表达该去饱和酶转基因，并且改变所述宿主细胞的PUFA含量。可以改变所述去饱和酶转基因以用于表达，使得它保留在所述乳房细胞中，或分泌到乳中，以形成定位到乳中的PUFA反应产物(PCT申请WO 95/24488)。可以采用特定的调节序列，诸如牛α-乳清蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白或乳清酸性蛋白的调节序列，将表达定向，以在乳房组织中表达。并可以任选地包括一个或多个内含子和/或分泌信号序列(美国专利第5,530,177号；Rosen，美国专利第5,565,362号；Clark等，美国专利第5,366,894号；Garner等，PCT申请WO 95/23868)。可以采用以该方式改变的去饱和酶转基因或反义去饱和酶转录物的表达，来改变特定PUFA或其衍生物在该动物乳中的水平。另外，可以表达所述去饱和酶转基因本身或使其与其它转基因一起表达，以便产生含较高比率所需PUFA的动物乳或类似人乳的PUFA比率和浓度的动物乳(Prieto等，PCT申请WO 95/24494)。
脂肪酸的纯化可以在宿主微生物或动物中发现作为游离脂肪酸或结合形式的所述去饱和脂肪酸，结合形式诸如酰基甘油、磷脂、磺酰脂或糖脂，可以通过本领域熟知的种种方法从该宿主细胞中提取。这类方法可以包括用有机溶剂抽提、超声处理、用例如二氧化碳进行超临界流体抽提和诸如压榨的物理方法或它们的组合。特别有价值的是用己烷或甲醇和氯仿抽提。需要时，可以将水层酸化，以将带负电的部分质子化，由此增加所需产物在有机层中的分配。抽提后，可以通过在氮气流下蒸发，而除去有机溶剂。当以结合形式分离时，可以将所述产物酶促切割或化学切割，以释放该游离脂肪酸或复合程度较低的目的结合物，然后可以经过进一步的操作，以产生所需的终产物。希望的是，用氢氧化钾切割结合形式的脂肪酸。
如果必需进一步纯化，则可以使用标准方法。这类方法可以包括抽提、用尿素处理、分部结晶、HPLC、分部蒸馏、硅胶层析、高速离心或蒸馏，或这些技术的组合。可以通过已知技术，在任何步骤进行反应基团(诸如酸基团或链烯基基团)的保护，诸如烷基化或碘化。所用的方法包括所述脂肪酸的甲基化，以产生甲酯。同样，可以在任何步骤除去保护基团。希望的是，可以通过用尿素处理和/或分部蒸馏，完成含GLA、SDA、ARA、DHA和EPA的部分的纯化。
脂肪酸的用途发现本发明的脂肪酸的许多用法。可以发现基于本发明DNA的探针可以用于分离相关分子的方法中，或可以用于检测表达去饱和酶的生物的方法中。用作探针时，所述DNA或寡核苷酸必须是可检测的。通常通过将一个标记或者连接于一个内部位点，例如通过掺入修饰的残基，或连接于5’或3’末端，来完成这一步。这类标记可以是可直接检测的，可以结合于可被检测的标记的第二分子，或可以结合于一个未标记的第二分子和一个可检测的标记的第三分子；可以将该方法扩展，只要获得满意的可检测信号是可行的，而且背景信号的水平不是不可接受的。第二系统、第三系统或桥连系统可以包括使用针对任何其它分子的抗体，包括标记抗体或其它抗体，或可以涉及相互结合的任何分子。例如生物素-链霉抗生物素/抗生物素蛋白系统。可检测标记通常包括放射性同位素、化学和酶促产生的分子或改变光的分子、产生可检测反应产物的酶、磁性分子、荧光分子或其荧光或发光特性在结合时改变的分子。可以在USPN 5,011,770中发现标记方法的实例。或者，通过等热滴定量热法测量探针结合于靶时溶液热量的变化，或通过将该探针或靶包被在表面上、并分别检测用于结合的靶或探针产生的光从该表面散射的变化，可以直接检测靶分子的结合，同样可以用BIAcore系统进行。
发现通过重组方法产生的PUFA在种类繁多的领域中的应用。给动物或人类以各种形式增补PUFA，不仅可以导致加入的PUFA水平的提高，而且也可以导致其代谢产物水平的提高。
营养组合物本发明也包括营养组合物。用于本发明目的这类组合物包括任何食品或用于人类消费(包括肠消费或胃肠外消费)的制剂，这组合物当被摄入机体时，(a)用作营养或建立组织或供应能量和/或(b)维持、恢复或支持适当的营养状况或代谢功能。
本发明的营养组合物包含至少一种按照本发明生产的油或酸，并且可以是固体形式或液体形式。另外，该组合物可以包括特定用途所需量的食用常量营养物、维生素和矿物质。根据该组合物是否计划用于正常、健康的婴儿、儿童或伴随某些代谢病(诸如代谢失调)而有特定需要的成年人，将改变这类组分的量。
可以加入该组合物的常量营养物的实例包括但不限于食用脂、碳水化合物和蛋白质。这类食用脂的实例包括但不限于椰子油、豆油以及甘油一酯和甘油二酯。这类碳水化合物的实例包括但不限于葡萄糖、食用乳糖和水解淀粉(search)。另一方面，可以用于本发明营养组合物的蛋白质的实例包括但不限于大豆蛋白，电透析乳清、电透析脱脂乳、乳清或这些蛋白质的水解物。
关于维生素和矿物质，可以将以下物质加入本发明的营养组合物中钙、磷、钾、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和维生素A、E、D、C和维生素B复合物。也可以加入其它这类维生素和矿物质。
用于本发明营养组合物的组分将为半纯化或为纯化来源。半纯化的或纯化的是指已经通过天然物质纯化或合成而制备的物质。
本发明营养组合物的处理包括但不限于婴儿配制食品、食物增补剂和重水合组合物。特别有价值的营养组合物包括但不限于用于给婴儿胃肠增补或胃肠外增补的营养组合物、专家婴儿配制食品、老年人的增补剂和用于患有胃肠道困难和/或吸收障碍的人的增补剂。
营养组合物典型的本发明营养组合物将含有特定用途的所需量的食用常量营养物、维生素和矿物质。根据该组合物是否计划用于暂时暴露于应激反应的正常、健康个体、或用于由于某些慢性病或急性病(例如代谢失调)而有特许需要的受治疗者，将改变这类组分的量。本领域技术人员会认识到，用于本发明营养组合物的组分来源为半纯化和纯化的。半纯化的或纯化的是指已经通过天然物质纯化或合成而制备的物质。这些技术是本领域熟知的(参见例如，食品组分和食品加工的联邦调控法典；推荐的食品许可(Code of Federal Regulations for Food成分andFood Processing；Recommended Dietary Allowances)，第10版，NationalAcademy Press，Washington，D.C.，1989)。
在一个优选实施方案中，本发明的营养制剂为肠营养制品，更优选为成年人或儿童肠营养制品。按照本发明的再一方面，提供适于喂养正经历应激反应的成年人或儿童的营养制剂。该配制食品除含有本发明的PUFA外，还含有设计提供成年人每日营养需求量的常量营养物、维生素和矿物质。
常量营养组分包括食用脂、碳水化合物和蛋白质。食用脂的实例为椰子油、豆油、甘油一酯和甘油二酯以及本发明的PUFA油。碳水化合物的实例为葡萄糖、食用乳糖和水解玉米淀粉。虽然也可以得到并可以使用其它蛋白源，但典型的蛋白质源为大豆蛋白，电透析乳清或电透析脱脂乳、或乳清或这些蛋白质的水解物。这些常量营养物将以通常接受的营养化合物的形式加入，其量等于人乳中的存在量，或根据能量，即基于每卡。
配制液体和肠营养配制食品的方法是本领域众所周知的，并在实施例中详细描述。
可以将该肠配制食品消毒，随后在即食(ready-to-feed)(RTF)基础上利用，或以浓缩液体或粉末贮存。可以通过喷雾干燥按上述而制备的肠配制食品，制备该粉末，该配制食品可以通过将该浓缩物再水化来重建。成年人和婴儿营养配制食品是本领域众所周知的，并且是市售的(例如Ross Products Division，Abbott Laboratories的Similac、Ensure、Jevity和Alimentum)。可以将本发明的油或酸按下述量加入到这些配制食品的任一种中。
液体形式的营养组合物的能量密度通常可以为大约0.6-3.0Kcal/ml。当为固体形式或粉末形式时，该营养增补剂可以含有大约1.2至9Kcal/gm以上，最好为3-7Kcal/gm。一般而言，液体制品的重量摩尔渗透压浓度应该低于700mOsm，更优选低于660mOsm。
该营养配制食品除包括本发明的PUFA外，通常还包括维生素和矿物质以帮助个人摄入这些物质的每日最小需求量。在以上列出的PUFA外，最好除抗氧化剂外，也希望可以用锌、铜和叶酸补充该营养组合物。据认为，这些物质也将增强应激反应的免疫系统，并因此会提供对所述个体的其它益处。锌、铜或叶酸的存在是可任选的，不是为了获得对免疫抑制的有益作用而需求的。同样，也可以用这些相同的物质补充药用组合物。
在一个更优选的实施方案中，所述营养物除含有抗氧化剂系统和PUFA组分外，还含有碳水化合物源，其中至少5％(重量)的所述碳水化合物为难消化的寡糖。在再一更优选的实施方案中，该营养组合物另外含有蛋白质、牛磺酸和肉碱。
用所公开方法制备的PUFA或其衍生物可以用作食物代用品或增补剂，特别是婴儿配制食品，用于正经受静脉内喂食的患者或用于预防或治疗营养不良。通常，人乳的脂肪酸分布型包含大约0.15％至0.36％的DHA、大约0.03％至大约0.13％的EPA、大约0.30％至0.88％的ARA、大约0.22％至大约0.67％的DGLA和大约0.27％至大约1.04％的GLA。另外，已经报道，人乳中主要的甘油三酯为1，3-二油酰-2-棕榈酰，而且据报道2-棕榈酰甘油酯比2-油酰或2-lineoyl甘油酯的吸收好(USPN 4,876,107)。因此，脂肪酸诸如按本发明生产的ARA、DGLA、GLA和/或EPA，可以用来改变婴儿配制食品的组成，以更好地复制人乳的PUFA组成。特别是，用于药用增补剂或食物增补剂、特别是人乳替代品或增补剂的油组合物，最好包含一种或多种ARA、DGLA和GLA。更优选的是，该油包含大约0.3-30％ARA，、大约0.2-30％DGLA和大约0.2至大约30％GLA。
除该浓度外，可以改变ARA、DGLA和GLA的比率，以用于具体的给定的最终用途。当作为乳增补剂或替代品配制时，含有ARA、DGLA和GLA中的两种或多种的油组合物分别提供的比率为大约1∶19∶30至大约6∶1∶0.2。例如，动物乳的ARA∶DGLA∶DGL之比的变化范围可以为1∶19∶30至6∶1∶0.2，这包括的中间之比最好为大约1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶4。当在宿主细胞中一起生产时，可以采用调整诸如GLA和DGLA的前体底物转化为ARA的比率和百分率，以精确地控制所述PUFA的比率。例如，可以用5％-10％的DGLA向ARA的转化率，产生大约1∶19的ARA与DGLA之比，而可以用大约75％-80％的转化率，产生大约6∶1的ARA与DGLA之比。因此，无论在细胞培养系统中，还是在宿主动物中，均可以采用调节上述去饱和酶表达的定时、程度和特异性，以调节PUFA水平和比率。根据所用的表达系统，例如细胞培养物或在乳中表达油的动物，也可以分离所述油，并以所需浓度和比率进行混合。可以按照标准方法，确定提供这些PUFA比率的油量。PUFA或含有PUFA的宿主细胞也可以用作动物的食物增补剂，以将动物组织或乳的脂肪酸组成改变为人类和动物消费更希望的组成。
对于食物增补剂，可以将纯化的PUFA或其衍生物加入烹饪油、脂肪或配制的margarine中，以便在正常使用中，接受者将接受所需的量。所述PUFA也可以加入婴儿配制食品、营养增补剂或其它食品中，并且发现可以用作抗炎剂或胆固醇降低剂。
药用组合物本发明也包括药用组合物，它包含一种或多种按照本文所述方法生产的酸和/和所产生的油。更具体地说，这样的药用组合物可以包含一种或多种所述酸和/或油以及标准的、熟知的、无毒的、药用可接受载体、辅助剂或溶媒，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乙醇、多元醇、植物油、润湿剂或诸如水/油乳液的乳液。该组合物可以或者为液体形式，或者为固体形式。例如，该组合物可以为片剂、胶囊、可摄入液体或粉末、注射液或局部乳膏或乳油形式。
可能的给药途径包括例如经口、直肠和胃肠外途径。当然，给药途径取决于所需的效果。例如，如果用该组合物治疗粗糙、干燥或老化的皮肤，治疗受伤或烧伤的皮肤，或治疗受疾病或病症影响的皮肤或头发，它或许可以局部使用。
本领域技术人员可以确定该组合物给予患者的剂量，这取决于各种因素，诸如患者的体重、患者的年龄、患者的免疫状况等。
关于形式，该组合物可以例如为溶液、分散体、悬浮液、乳剂或然后重建的无菌粉末。
另外，本发明的组合物可以用于化妆目的。可以将其加入预先存在的化妆组合物中，以形成混合物，或可以用作唯一的组合物。
药用组合物可以用来给予个体PUFA组分。合适的药用组合物可以包含生理可接受的无菌水溶液和非水溶液、分散体、悬浮液或乳液以及无菌粉剂，所述粉剂用于重建为用于摄入的无菌溶液或分散体。合适的水性和非水载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、它们合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。可以例如在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，并通过使用表面活性剂，维持合适的流动性。最好也可以包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。除这类惰性稀释剂外，该组合物也可以包括辅助剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和香味剂。
除所述活性化合物外，悬浮液也可以含有悬浮剂，作为例子的是乙氧基化的异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、aluminum metahydroxide、皂土、琼脂-琼脂和西黄耆胶或这些物质的混合物等。
可以采用本领域熟知的技术，制备诸如片剂和胶囊的固体剂量形式。例如，本发明的PUFA可以用常规的片剂基质(诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉)与粘合剂(诸如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶)、崩解剂(诸如马铃薯淀粉或藻酸)和润滑剂(诸如硬脂酸或硬脂酸镁)一起制成片剂。可以通过将这些赋形剂与抗氧化剂和所述PUFA组分一起加入明胶胶囊中，以制备胶囊。应该加入药用制剂的所述抗氧化剂和PUFA组分的量应该符合上述指南。
用于本申请的术语“治疗”是指或者预防、或者降低不良事件的发生率。例如，治疗免疫抑制是指或者预防该抑制的发生，或者降低这种抑制的量。术语“患者”和“个体”可互换使用，均指动物。本申请中所用的术语“动物”是指任何温血哺乳动物，包括但不限于狗、人、猴子和猿。本申请所用的术语“大约”是指从所述范围或数目变化一个合理量的量，取决于使用的上下文。本说明书中具体表示的任何以数字表示的数目或范围，应该考虑根据以上术语进行修改。
“剂量”和“一份饮食”可互换使用，是指该患者在单次服用(setting)中摄入、设计传递有效量抗氧化剂和结构甘油三酯的营养组合物或药用组合物的量。如对本领域技术人员显而易见的，该液体营养粉末的单个剂量或一份饮食应该供应上述量的抗氧化剂和PUFA。该剂量或一份饮食的量应该是在一次服用中典型成年人可以消费的体积。该量的变化范围可以很宽，取决于该患者的年龄、体重、性别或医疗状态。然而，作为一般指导，液体营养制品的单份饮食或剂量应该考虑为包括100-600m1的体积，更优选为125-500ml，最优选为125-300ml。
甚至当不需要增补饮食时，也可以将本发明的PUFA加入食品中。例如，可以将该组合物加入任何类型的食品中，包括但不限于人造奶油、改性奶油、奶酪、乳、酸乳酪、巧克力、糖果、小吃(snacks)、色拉油、烹饪用油、烹饪用脂、肉类、鱼和饮料。
药物应用对于药物的使用(人或牲畜)，一般口服所述组合物，但可以通过所述组合物可以被成功吸收的任何途径给予，所述途径例如为胃肠外(即皮下、肌内或静脉内)、直肠或阴道途径或局部途径，例如皮肤乳膏或洗剂。本发明的PUFA可以单独给予，或可以结合药用可接受的载体或赋形剂一起给予。当可获得时，明胶胶囊是优选的口服形式。上述食物增补剂也可以提供一种口服给药途径。本发明的不饱和酸可以以结合形式给予，或作为所述脂肪酸的盐、酯、酰胺或前体药物给予。本发明包括任何药用可接受的盐；尤其优选的是钠盐、钾盐或锂盐。也包括N-烷基多羟胺(N-alkylpolyhydroxamine)盐，诸如在PCT申请WO96/33155中发现的N-甲基葡糖胺。优选的酯为乙酯。作为固体盐，所述PUFA也可以以片剂形式给予。对于静脉内给药，所述PUFA或其衍生物可以加入商业制剂中，诸如Intralipids。典型的正常成年人血浆脂肪酸分布型包含6.64-9.46％的ARA、1.45-3.11％的DGLA和0.02-0.08％的GLA。这些PUFA或其代谢前体可以或者单独给予，或者以与其它PUFA的混合物给予，以获得患者中的正常脂肪酸分布型。需要时，制剂的各个组分可以以试剂盒形式单独提供，供单次使用或多次使用。特定脂肪酸的典型剂量为每日0.1mg-20g，或甚至每日100g，根据需要最好为每日10mg至1、2、5或10g，或其衍生物的摩尔当量(molarequivalent)量。本发明包括根据甘油三酯计算的包含大约2％至大约30％(重量)脂肪酸的胃肠外营养组合物；最好是具有占总PUFA组合物大约1％至25％(重量)的GLA的组合物(USPN 5,196,198)。可以任选地包括其它维生素、特别是脂溶性维生素(诸如维生素A、D、E)和肉碱。需要时，可以加入诸如α生育酚的防腐剂，通常加入大约0.1％(重量)。
合适的药用组合物可以包含生理可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液以及用于重建为无菌注射液或分散体的无菌粉末。合适的水性或非水载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、它们合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯，诸如油酸乙酯。可以例如通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小，并通过使用表面活性剂，维持合适的流动性。最好也可以包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。除这类惰性稀释剂外，该组合物也可以包括辅助剂、诸如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂和香味剂。
除所述活性化合物外，悬浮液也可以含有悬浮剂，例如为乙氧基化的异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、aluminum metahydroxide、皂土、琼脂-琼脂和西黄耆胶或这些物质的混合物等。
尤其优选的药用组合物含有溶于水性介质或溶剂中的甘油一酯和甘油二酯的二酰基酒石酸酯。甘油一酯和甘油二酯的二酰基酒石酸酯的HLB值为大约9-12，其亲水性比现有的抗微生物脂质显著更强，现有的抗微生物脂质的HLB为2-4。那些现有的疏水脂质不能配制为水性组合物。如本文公开的，那些脂质现在可以结合甘油一酯和甘油二酯的二酰基酒石酸酯而溶解于水性介质中。按照该实施方案，将甘油一酯和甘油二酯的二酰基酒石酸酯(例如，DATEM-C12∶0)与其它活性抗微生物脂质(例如，18∶2和12∶0的甘油一酯)一起融化并混合，以获得均匀的混合物。均一性提供提高的抗微生物活性。该混合物可以完全分散于水中。不加入甘油一酯和甘油二酯的二酰基酒石酸酯，并在导入水中之前将其与其它甘油一酯预混合，则这一点是不可能的。然后，可以在无菌条件下，将该水性组合物与生理可接受的稀释剂、防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。可能需要这样，以形成喷雾剂或吸入剂。
本发明也包括用脂肪酸治疗许多疾病。可以采用增补本发明的PUFA，在血管成形术后治疗再狭窄。可以用本发明的PUFA治疗炎症、类风湿性关节炎以及哮喘和牛皮癣的症状。证据表明，PUFA可能参与钙代谢，提示本发明的PUFA可以用来治疗或预防骨质疏松和肾结石或尿道结石。
本发明的PUFA也可以用来治疗癌症。已经表明，恶性细胞的脂肪酸组成已改变；已经表明，加入脂肪酸减缓恶性细胞的生长，并引起细胞死亡，并且提高它们对化疗剂的敏感性。已经表明，GLA引起在癌细胞上重新表达E-钙粘着蛋白细胞粘着分子，这些分子的丧失与攻击性转移有关。将GLA的水溶性锂盐静脉内给予胰腺癌患者的临床测试，产生统计学显著增加的存活率。增补PUFA也可以用来治疗与癌症有关的恶病质。
本发明的PUFA也可以用来治疗糖尿病(USPN 4,826,877；Horrobin等，Am.J.Clin.Nutr.第57卷(增刊)，732S-737S)。已经证明在糖尿病动物中脂肪酸代谢和组成改变。已经提出，这些改变涉及某些由糖尿病引起的某些长期并发症，包括视网膜病、神经病、肾病和生殖系统损害。已经表明，含有GLA的报春花油(primrose oil)预防并逆转糖尿病性神经损害。
本发明的PUFA可以用来治疗湿疹、降低血压和提高数学计分。已经提出必需脂肪酸涉及湿疹，研究已经显示出用GLA治疗对湿疹产生的有益效果。已经表明，GLA还减少与应激反应有关的血压升高，并在算术检定上改善表现。已经表明，GLA和DGLA抑制血小板聚集、引起血管舒张、降低胆固醇水平并抑制血管壁平滑肌和纤维组织的增生。(Brenner等，Adv.Exp.Med.Bio1.第83卷，第85-101页，1976)。已经表明，单独或结合EPA给予GLA或DGLA降低或预防胃肠出血和由非类固醇抗炎药物引起的其它副作用(USPN 4,666,701)。已经表明，GLA和DGLA还预防或治疗子宫内膜异位和月经前综合征(USPN4,758,592)，并且治疗肌痛性脑脊髓炎和病毒感染后的慢性疲劳(USPN5,116,871)。
本发明PUFA的其它用途包括用于治疗AIDS、多发性schlerosis、急性呼吸综合征、高血压和炎性皮肤病。本发明的PUFA也可以用于一般健康状态以及老年病学治疗的配制食品。
兽医应用应该注意到，上述药用组合物和营养组合物可以用于动物以及人类，因为动物经历许多与人类相同的需求和条件。例如，本发明的油或酸可以用于动物饲料增补剂。
通过说明提出以下实施例，而不是限制性的。
实施例实施例1构建高山被孢霉的cDNA文库实施例2从高山被孢霉分离Δ6-去饱和酶的核苷酸序列实施例3鉴定与高山被孢霉Δ6-去饱和酶同源的Δ6-去饱和酶实施例4从高山被孢霉分离Δ12-去饱和酶的核苷酸序列实施例5高山被孢霉去饱和酶克隆在面包酵母中的表达实施例6培养条件的初次优化实施例7PUFA在酵母脂质部分中的分布实施例8进一步的培养优化和Δ6与Δ12-去饱和酶的共表达实施例9鉴定高山被孢霉Δ5和Δ6去饱和酶的同源物实施例10鉴定其它产生PUFA的生物中的高山被孢霉Δ5和Δ6同源物实施例11鉴定其它产生PUFA的生物中的高山被孢霉Δ5和Δ6同源物实施例12人类去饱和酶的基因序列实施例13营养组合物实施例1构建高山被孢霉的cDNA文库采用Hoge等(1982)的方案(Experimental Mycology 6225-232)，从3日龄的产生PUFA的高山被孢霉培养物分离总RNA。采用BRL的λ-ZipLox系统，按照生产商的说明，用该RNA制备双链cDNA。将高山被孢霉cDNA的几个大小分级部分分别包装，以产生具有不同平均大小插入片段的文库。一个“全长”文库含有大约3×106个克隆，平均插入片段的大小为1.77kb。“测序级”文库含有大约6×105个克隆，插入片段的平均大小为1.1kb。
实施例2从高山被孢霉分离Δ6-去饱和酶的核苷酸序列通过对实施例1所述的高山被孢霉cDNA测序级文库的克隆进行随机测序，获得一个部分cDNA克隆Ma524的核酸序列，它编码高山被孢霉的Δ6脂肪酸去饱和酶。如下切割含cDNA的质粒将5μl噬菌体与100μl大肠杆菌DH10B(ZIP)混合，大肠杆菌DH10B生长于补充了10μg/ml卡那霉素、0.2％麦芽糖和10mM MgSO4的ECLB中；于37℃温育15分钟。加入0.9ml SOC，将100μl所述细菌立即在ECLB+50μg Pen平板上铺平板，铺10个平板。回收时间不需要45分钟。将平板于37℃培养过夜。对于用来制备甘油贮存物和小量制备DNA的过夜培养物，将菌落挑到ECLB+50μg Pen培养基中。将用于小量制备的一等份培养物甘油贮存物贮存。与在100μg/ml Pen上铺平板相比，在ECLB+50μg Pen/ml上铺平板产生的菌落更多，含有插入片段的菌落的比例更大。
挑出随机菌落，采用Qiagen小量制备试剂盒纯化质粒DNA。由所述cDNA插入片段的5’端获得DNA序列，用BLASTX算法，将其与国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)的非丰余数据库(nonredundant database)进行比较。根据DNA序列与先前鉴定的去饱和酶的DNA序列的同源性，鉴定Ma524为推定的去饱和酶。
从高山被孢霉的全长文库中分离出一个全长的cDNA克隆，命名为pCGN5532。该cDNA作为一个1617bp的插入片段包含于载体pZL1(BRL)中，该插入片段起始于第一个ATG，含有一个编码457个氨基酸的可读框。我们发现，已知在膜结合的去饱和酶中保守的3个保守的“组氨酸框”(Okuley等(1994)The Plant Cell 6147-158)存在于氨基酸位置172-176、209-213和395-399处(参见图3)。正如其它膜结合的Δ6-去饱和酶一样，最后一个HXXHH组氨酸框基序发现为QXXHH。发现Ma524的氨基酸序列显示出与Caenorhabditis elegans粘粒WO6D2.4的一部分显著同源，该部分为来自向日葵、集胞藻属(Synechocystis)和螺旋藻属的Δ6-去饱和酶的细胞色素b5/去饱和酶融合蛋白。另外，Ma524显示出与琉璃苣Δ6-去饱和酶的氨基酸序列具有同源性(PCT申请W)96/21022)。因此看来Ma524编码与琉璃苣和藻类Δ6-去饱和酶相关的Δ6-去饱和酶。所述肽序列作为SEQ ID NO5-SEQ ID NO11显示。
发现所编码蛋白的氨基末端显示出与细胞色素b5蛋白有着显著的同源性。该被孢霉属cDNA克隆看来代表细胞色素b5和一个脂肪酸去饱和酶之间的融合体。由于人们认为细胞色素b5作为膜结合去饱和酶的电子供体而发挥作用，因此可能该去饱和酶蛋白的N-末端细胞色素b5域参与其功能。当在异源系统中表达该去饱和酶进行PUFA生产时，这可能是有利的。然而，应该注意到，尽管发现Ma524氨基酸序列和琉璃苣的Δ6含有同源性区域，但所述cDNA的碱基组成表现出显著不同。例如琉璃苣的cDNA显示出其碱基组成为60％A/T，某些区域超过70％，而Ma524显示出其碱基组成平均为44％A/T，所有区域均不超过60％。这对于在偏好不同碱基组成的微生物或动物中表达所述cDNA可能具有意义。已知，当该宿主优选的碱基组成不同于所引入基因的碱基组成时，可发生重组基因的差表达。这种表达差的机制包括mRNA的稳定性降低、隐蔽剪接位点减少和/或翻译性降低等等。
实施例3鉴定与高山被孢霉Δ6-去饱和酶同源的Δ6-去饱和酶用Ma524的氨基酸序列，通过NCBI对表达序列标记(＂EST＂)数据库进行BLASTX检索，鉴定编码推定的Δ6-去饱和酶的核酸序列。几个序列表现出显著的同源性。具体地说，两个拟南芥(Arabidopsis thaliana)序列(登记号为F13728和T42806)的推导氨基酸序列，显示出与Ma524的推导氨基酸序列的两个不同区的同源性。设计以下PCR引物ATTS4723-FOR(与F13728互补) SEQ ID NO135′CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG和T42806-REV(与T42806互补)SEQ ID NO145′CAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTGAAACTG。用BRLSuperscript RTase和引物TSyn(5′-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3′)(显示为SEQ ID NO12)，对从拟南芥发育中的长果(silique)分离出的5μg总RNA进行反转录。在含有以下物质的50ul体积中进行PCR得自25ng总RNA的模板、每种引物各2pM、每种三磷酸脱氧核糖核苷各200μM、60mM Tris-Cl，pH 8.5、15mM(NH4)2SO4、2mM MgCl2、0.2 U Taq聚合酶。热循环仪的条件如下94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒。连续进行35个循环的PCR，然后于72℃另外进行7分钟的延伸。PCR产生一个大约～750个碱基对的片段，将其进行亚克隆，命名为12-5，并进行测序。形成该片段的每个末端以对应于拟南芥属(Arabidopsis)的EST，据此设计PCR引物。将12-5的推定氨基酸序列与Ma524、人EST(W28140)、小鼠(W53753)和C.elegans(R05219)(参见图4)的氨基酸序列进行比较。与被孢霉属Δ6-去饱和酶的同源型表明，这些序列代表推定的去饱和酶多肽。根据该实验方法，采用基于EST序列的探针能克隆全长基因是可能的。克隆后，可以将所述基因然后置于表达载体中，在宿主细胞中表达，并且可以如下测定其特定的Δ6-去饱和酶或其它去饱和酶的活性。
实施例4从高山被孢霉分离Δ12-去饱和酶的核苷酸序列根据高山被孢霉累积的脂肪酸，高山被孢霉似乎可能具有一个ω6型的去饱和酶。该ω6-去饱和酶负责由油酸(18∶1)生产亚油酸(18∶2)。亚油酸(18∶2)是Δ6-去饱和酶的一种底物。设计该实验，以确定高山被孢霉是否具有Δ12-去饱和酶多肽，如果具有该多肽，则鉴定相应的核苷酸序列。
对高山被孢霉测序级文库的一个随机克隆Ma648进行测序，并根据其DNA序列与先前鉴定的去饱和酶DNA序列的同源性，鉴定为推定的去饱和酶，如同对Ma524所述(参见实施例2)。该核苷酸序列示于SEQID NO13中。该肽序列示于SEQ ID NO4中。由Ma648 cDNA 5’端推定的氨基酸序列显示出其与大豆微粒体ω6(Δ12)去饱和酶(登记号为L43921)以及蓖麻籽的油酸12-水解酶(登记号为U22378)的显著同源性。另外，当与种种其它ω6(Δ12)和ω3(Δ15)脂肪酸去饱和酶序列比较时，观察到了同源性。
实施例5高山被孢霉去饱和酶克隆在面包酵母中的表达酵母的转化按照标准方案(Methods in Enzymology，第194卷，第186-187页，1991)，进行酵母的乙酸锂转化。简而言之，酵母于30℃生长于YPD中。将细胞离心下来，重悬浮于TE中，再离心下来，重悬浮于含100mM乙酸锂的TE中，再次离心下来，并重悬浮于TE/乙酸锂中。将重悬浮的酵母于30℃振荡温育60分钟。加入载体DNA，将酵母等分加入试管中。加入转化DNA，将试管于30℃温育30分钟。加入PEG溶液(35％(w/v)PEG 4000、100mM乙酸锂、TE pH7.5)，然后于30℃温育50分钟。于42℃进行5分钟的热休克，沉淀细胞，用TE洗涤，再次沉淀，并重悬浮于TE中。然后将重悬浮的细胞在选择培养基上铺平板。去饱和酶在转化的酵母中表达根据面包酵母中去饱和酶的活性，筛选高山被孢霉cDNA克隆。用carnola Δ15-去饱和酶(用甘蓝型油菜(Brassica napus)栽培品种212/86种子的第一链cDNA，采用基于公开序列(Arondel等 Science2581353-1355)的引物，通过PCR获得)作为阳性对照。将Δ15-去饱和酶基因以及来自cDNA克隆Ma524和Ma648的基因置于表达载体pYES2(Invitrogen)中。分别产生质粒pCGR-2、pCGR-5和pCGR-7。将这些质粒转染入酿酒酵母菌株334中，在允许检测特定的去饱和酶活性的底物存在下及半乳糖诱导后，进行表达。对照菌株为含有未改变的pYES2载体的酿酒酵母菌株334。所用的底物、所产生的产物和所显示的去饱和酶活性是DGLA(向ARA转化将指示Δ5-去饱和酶活性)、亚油酸(向GLA转化将指示Δ6-去饱和酶活性；向ALA转化将指示Δ15-去饱和酶活性)、油酸(由酿酒酵母产生的内源底物，向亚油酸转化将指示Δ12-去饱和酶活性，这是酿酒酵母缺乏的)、或ARA(向EPA转化将指示Δ17-去饱和酶活性)。
在特定底物存在下，培养物于15℃生长48-52小时。抽提脂质部分进行分析如下通过离心沉淀细胞，用无菌ddH2O洗涤一次，并再次沉淀。将沉淀与甲醇一起进行涡旋混合；加入氯仿与tritridecanoin(作为内标)。将该混合物于室温下温育至少1小时，或于4℃过夜。抽提氯仿层，并通过一张Whatman滤纸过滤，用1克无水硫酸钠除去颗粒和残留的水。于氮气流、40℃蒸发有机溶剂。然后将2ml 0.5N氢氧化钾的甲醇溶液加入封闭的试管中，将抽提的脂质衍生化为脂肪酸甲酯(FAME)，用于气相色谱分析(GC)。将样品加热至95℃-100℃ 30分钟，并冷却至室温。加入大约2ml 14％三氟化硼的甲醇溶液，并重复加热步骤。在抽提的脂质混合物冷却后，加入2ml水和1ml己烷，以抽提FAME用于GC分析。通过将所产生的产物用(所产生的产物和所加入的底物)之和来除，然后乘以100，计算出转化的百分率。为了计算油酸的转化百分率，由于未加入底物，因此将所产生的总亚油酸用油酸和所产生的亚油酸之和来除，然后乘以100。在以下表1中提供了去饱和酶活性的结果。
表1高山被孢霉去饱和酶在面包酵母中的表达克隆 酶活性 底物的转化％pCGR-2Δ600 (18∶2至18∶3w6)(canola Δ15 Δ1516.3 (18∶2至18∶3w3)去饱和酶) Δ5 2.0 (20∶3至20∶4w6)Δ172.8 (20∶4至20∶5w3)Δ121.8 (18∶1至18∶2w6)pCGR-5Δ6 6.0(高山被孢霉 Δ150Ma524 Δ5 2.1Δ170Δ123.3pCGR-7Δ6 0(高山被孢霉 Δ153.8Ma648 Δ5 2.2Δ170Δ1263.4Δ15-去饱和酶对照克隆表现出16.3％的底物转化率。表达Ma524cDNA的pCGR-5克隆表现出6％的底物向GLA的转化率，表明该基因编码Δ6-去饱和酶。表达Ma648 cDNA的pCGR-7克隆，将底物转化为LA的转化率为63.4％，表明该基因编码Δ12-去饱和酶。在这些情况下，背景(底物的非特异性转化)为0-3％。我们也发现通过用不同浓度的底物引起的该活性的底物抑制。与将底物加至25μM时相比，将底物加入至100μM时，向产物转化的百分率降低(参见以下)。另外，通过将底物浓度在5μM和200μM之间改变，发现转化率的范围为大约5％至大约75％以上。这些数据表明，具有不同底物专一性的去饱和酶可以在异源系统中表达，并可以用来生产多不饱和长链脂肪酸。
表2以总脂质的百分率表示目的脂肪酸，该总脂质从具有指示质粒的酵母宿主酿酒酵母334中抽提。在生长培养基中不存在葡萄糖。用亲和气相色谱分离相应的脂质。用GC/MS证实所述产物的身份。当将甘蓝型油菜Δ15-去饱和酶的底物亚油酸从外部加入诱导的酵母培养物中时，检测到该酶的预期产物α-亚麻酸。这一发现表明，酵母表达去饱和酶基因，在目前的生长条件下可以产生有功能的酶和可检测量的产物。当两种外部加入底物中的任一种以游离形式加入到诱导的酵母培养物中时，尽管加入到酵母中的较长链的PUFA二高-γ-亚麻酸(20∶3)的量比亚油酸(18∶2)略少，但两种外部加入的底物均被酵母摄取。当在诱导和表达酿酒酵母334(pCGR-5)期间存在亚油酸时，检测到γ-亚麻酸。该PUFA的存在证实了来自pCGR-5(MA524)的Δ6-去饱和酶活性。在来自酿酒酵母334(pCGR-7)表达的抽提的脂质中鉴定出的亚油酸，将高山被孢霉的cDNA MA648分类为Δ12-去饱和酶。
表2脂肪酸，以从酵母抽提的总脂质的百分率表示<
加入100μM的底物*18∶1为酵母中的内源脂肪酸表中的关键词18∶1＝油酸18∶2＝亚油酸α-18∶3＝α-亚麻酸γ-18∶3＝γ-亚麻酸18∶4＝硬脂四烯酸20∶3＝二高-γ-亚麻酸20∶4＝花生四烯酸实施例6优化培养条件表3A显示外源游离脂肪酸底物浓度对酵母摄取的影响，并以占抽提的总酵母脂质的百分率显示脂肪酸产物的转化。在所有情况下，少量的外源底物(1-10μM)导致脂肪酸底物的摄取低和产物的形成少。在生长和诱导培养基中25-50μM浓度的游离脂肪酸形成最高百分率的所形成的脂肪酸产物，而100μM的浓度和随后高摄取入酵母中，似乎降低或抑制该去饱和酶活性。用于酵母表达Δ12-去饱和酶的脂肪酸底物的量在相同生长条件下是相似的，因为底物油酸是内源酵母脂肪酸。将α-亚麻酸用作pCGR-5(Δ6)的另一底物，产生预期的产物硬脂四烯酸(表3A)。当在表3B中比较相应的脂肪酸底物向其相应产物的百分率转化率时，很好地说明高脂肪酸底物浓度的反馈抑制。在所有情况下，生长培养基中的100μM底物降低向产物的百分率转化率。α-亚麻酸的摄取与以游离形式加入的其它PUFA相当，而Δ6-去饱和酶向产物硬脂四烯酸的百分率转化率为3.8-17.5％，在所有检查的底物中是最低的(表3B)。诸如YPD(丰富培养基)的培养基与具有葡萄糖的基本培养基相比，其对Δ12-去饱和酶转化率的影响是戏剧性的。当用丰富培养基培养并诱导酵母去饱和酶Δ12表达时，不仅油酸向亚油酸的转化率降低(表3B)，而且形成的亚油酸的百分率也降低11％(表3A)。当在用于生产Δ6-去饱和酶的生长培养基存在葡萄糖时，培养基组成的影响也是明显的，因为底物的摄取百分率于25μM时降低(表3A)。然而，对于Δ6-去饱和酶，在葡萄糖存在时，转化率保持不变，而形成的产物百分率降低。
表3A加入的底物对掺入的底物与酵母抽提物中所形成产物的百分率的影响
表3B培养基中的底物浓度对酵母抽提物中脂肪酸底物向产物的百分率转化率的影响
培养基中无葡萄糖+酵母蛋白胨液体培养基(YPD)*18∶1为一种内源酵母脂质sub.为底物浓度ND(未进行)表4显示当使用不同量的游离脂肪酸底物时，来自诱导酵母培养物的、由重组去饱和酶产生的脂肪酸的量。检测脂肪酸的重量，因为当生长条件改变时，诸如在酵母生长和诱导培养基中存在葡萄糖，脂质的总量显著地变化。为了更好地确定该重组去饱和酶产生最大量PUFA产物的条件，检查了各种脂肪酸的量。不存在葡萄糖时，由重组的Δ12-去饱和酶产生的亚油酸的量显著地降低3倍。对于Δ12-去饱和酶，在缺乏葡萄糖的情况下，总酵母脂质的量降低几乎一半。相反，对于Δ6-去饱和酶，在酵母生长培养基中存在葡萄糖时，产生的γ-亚麻酸降低几乎一半，而在存在/缺乏葡萄糖的情况下，产生的酵母脂质的总量没有改变。这表明葡萄糖作为Δ6-去饱和酶活性调节物的可能的作用.
表4以μg计的来自酵母抽提物的所产生的脂肪酸<
培养基中无葡萄糖sub.为底物浓度ND(未进行)*18∶1，该底物是一种内源酵母脂质实施例7PUFA在酵母脂质部分中的分布表5描述了游离脂肪酸的摄取以及在酵母脂质中形成的、在主要脂质部分中分布的其新产物。如上所述制备总脂质抽提物。该脂质抽提物在TLC平板上分离，通过与标准比较，鉴定各个部分。通过刮取收集所述条带，并加入内标。然后如上所述将所述部分皂化和甲基化，进行气相色谱。气相色谱通过与标准比较，计算出脂肪酸的量。磷脂部分含有最高量的Δ6-去饱和酶活性的底物和产物PUFA。看来，磷脂形式的所述底物为所述去饱和酶所能接近的。
表5在各种酵母脂质部分中脂肪酸的分布，以μg计
SC＝酿酒酵母(质粒)实施例8进一步的培养优化以及Δ6和Δ12-去饱和酶的共表达设计实验，从评估酿酒酵母中去饱和酶最适活性的生长和诱导条件。开发出能够产生γ-亚麻酸(GLA)的酿酒酵母菌株(SC334)，以评价在酵母中生产PUFA的可行性。将高山被孢霉的Δ6和Δ12-去饱和酶基因在SC334中共表达。Δ12-去饱和酶的表达将油酸(存在于酵母中)转化为亚油酸。用亚油酸作为Δ6-去饱和酶的底物，以生产GLA。产生的GLA的量的范围为在SC334培养物中所产生的总脂肪酸的5-8％，且亚油酸向γ-亚麻酸的转化率范围为30％-50％。优化诱导温度，也测定改变宿主菌株和上游启动子序列对Δ6和Δ12(分别为MA 524和MA 648)去饱和酶基因表达的影响。质粒的构建以上已经讨论了pCGR5以及pCGR7的克隆。为了构建pCGR9a和pCGR9b，采用以下引物组，扩增Δ6和Δ12-去饱和酶基因。引物pRDS1和3具有Xhol位点，引物pRDS2和4具有Xbal位点(以粗体显示)，这些引物的序列以SEQ ID NO15-18显示。I.Δ6-去饱和酶扩增引物a.pRDS1 TAC CAA CTC GAG AAA ATG GCT GCT GCT CCCAGT GTG AGGb.pRDS2 AAC TGA TCT AGA TTA CTG CGC CTT ACC CATCTT GGA GGCII.Δ12-去饱和酶扩增引物a.pRDS3 TAC CAA CTC GAG AAA ATG GCA CCT CCC AACACT ATC GATb.pRDS4 AAC TGA TCT AGA TTA CTT CTT GAA AAA GACCAC GTC TCC分别用pCGR5和pCGR7构成物作为扩增Δ6和Δ12-去饱和酶基因的模板DNA。用Xbal和XhoI消化扩增的产物，以产生“粘性末端”。该PCR扩增了在pCGR7中克隆的具有Xhol-Xbal末端的Δ6-去饱和酶，其中pCGR7也用Xho-l-Xbal切割。该方法将Δ6-去饱和酶置于Δ12-去饱和酶之后，处于诱导型启动子GALl的控制之下。该构成物命名为pCGR9a。同样，为了pCGR9b，将具有XhoI-XbaI末端的Δ12-去饱和酶克隆入pCGR5的XhoI-XbaI位点。在pCGR9b中，Δ12-去饱和酶在Δ6-去饱和酶基因之后，远离GAL启动子。
为了构建pCGR10，用BamHl消化pRS425，pRS425含有组成型3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子，而用BamHl-Xhol消化pCGR5，以释放Δ6-去饱和酶基因。用克列诺(Klenow)聚合酶将该Δ6-去饱和酶片段和BamHl切割的pRS425补平，以产生平端，并将其连接，分别产生含有有义和反义定向的Δ6-去饱和酶基因的pCGR10a和pCGR10b。为了构建pCGR11和pCGR12，采用EcoRl-XhoI双重消化，分别从pCGR5 andpCGR7分离Δ6和Δ12-去饱和酶基因。将Δ6和Δ12-去饱和酶的EcoRl-Xhol片段克隆入用EcoRl-Xhol消化的pYX242载体中。pYX242载体具有Tpl(一种酵母管家基因)的启动子，该启动子提供组成型表达。酵母的转化和表述将pCGR5、pCGR7、pCGR9a、pCGR9b、pCGR10a、pCGR11和pCGR12的不同组合引入酿酒酵母的各种宿主菌株中。采用PEG/LiAc方案(Methods in Enzymology第194卷(1991)186-187)进行转化。通过在缺乏适当氨基酸的合成培养基上铺平板，选择转化子。可以在缺乏尿嘧啶的培养基上选择pCGR5、pCGR7、pCGR9a和pCGR9b。可以在缺乏亮氨酸的培养基上选择pCGR10、pCGR11和pCGR12构成物。如以上实施例5所述，进行培养物的生长和脂肪酸分析。GLA的生产GLA的生产需要酵母中缺乏的两种酶(Δ6和Δ12-去饱和酶)的表达。为了以最适水平表达这些酶，将以下构成物或构成物的组合引入各种宿主菌株中1)pCGR9a/SC3342)pCGR9b/SC3343)pCGR10a和pCGR7/SC3344)pCGR11和pCGR7/SC3345)pCGR12和pCGR5/SC3346)pCGR10a和pCGR7/DBY7467)pCGR10a和pCGR7/DBY746pCGR9a构成物具有在诱导型GAL启动子控制下的Δ6和Δ12-去饱和酶基因。用该构成物转化的SC334宿主细胞在总脂肪酸中不显示任何GLA的累积(图6A和B，1道)。然而，正如Δ6和Δ12-去饱和酶各自的底物转化为产物所表明的，当Δ6和Δ12-去饱和酶基因分别由GAL启动子控制时，对照构成物能够表达Δ6-和Δ12-去饱和酶。在pCGR9a/SC334中18∶1ω9向18∶2ω6的转化表明，pCGR9a中的Δ12-去饱和酶基因表达，而Δ6-去饱和酶没有表达/活性，因为18∶2ω6没有转化为18∶3ω6(图6A和B，1道)。
pCGR9b构成物也具有GAL启动子控制下的Δ6和Δ12-去饱和酶基因，但与pCGR9a相比，顺序相反。在这种情况下，在pCGR9b/SC334培养物中观察到的GLA非常少(＜1％)。总脂肪酸中18∶2ω6的百分率低(图6A和B，1道)表明，Δ12-去饱和酶的表达也非常低。
为了测试在非依赖性启动子控制下的这两种酶是否提高GLA的产量，将Δ6-去饱和酶基因克隆入pRS425载体中。pCGR10a的构成物具有正向的Δ6-去饱和酶，处于组成型GPD启动子的控制之下。pCGR10b具有相反方向的Δ6-去饱和酶基因，用作阴性对照。与pCGR9a相比，pCGR10a/SC334细胞产生显著较高水平的GLA(总脂肪酸的5％，图6，3道)。Δ6和Δ12-去饱和酶基因均以高水平表达，因为18∶1ω9→18∶2ω6的转化率为65％而18∶2ω6→18∶3ω6的转化率(Δ6-去饱和酶)为30％(图6，3道)。正如所预期的，阴性对照pCGR10b/SC334不显示任何GLA。
为了进一步优化GLA的生产，将Δ6和Δ12基因引入pYX242载体中，分别产生pCGR11和pCGR12。pYX242载体靠TP1启动子而允许组成型表达(Alber，T.和Kawasaki，G.(1982).J. Mol.&amp; Appl.Genetics 1419)。在SC334中引入pCGR11和pCGR7，在SC334的总脂肪酸中产生大约8％的GLA。18∶1ω9→18∶2ω6和18∶2ω6→18∶3ω6的转化率分别为大约50％和44％(图6A和B，lane 4).在SC334中存在pCGR12和pCGR5，在总脂肪酸中产生6.6％的GLA，18∶1ω9→18∶2ω6和18∶2ω6→18∶3ω6的转化率分别大约为50％(图6A和B，5道)。因此，尽管在pCGR11/pCGR7构成物组合中，总脂肪酸中GLA的量较高，但pCGR12/pCGR5组合的底物向产物的转化率更高。
为了确定改变宿主菌株是否提高GLA的产量，将pCGR10a和pCGR7引入宿主菌株BJ1995和DBY746(得自Yeast Genetic StockCentre，1021 Donner Laboratory，Berkeley，CA 94720。菌株DBY746基因型为Matα，his3-Δ1，leu2-3，leu2-112，ura3-32，trp1-289，gal)中。结果示于图7中。将宿主菌株变为BJ1995，不提高GLA的产量，因为GLA的量仅为总脂肪酸的1.31％，并且在BJ1995中，18∶1ω9→18∶2ω6的转化率为大约17％。在DBY746中没有观察到GLA，18∶1ω9→18∶2ω6的转化非常低(在对照中＜1％)，提示Δ12-去饱和酶表达所需的辅因子在DB746中可能失去(图7，2道)。
为了确定温度对GLA生产的影响，于15℃和30℃下培养含有pCGR10a和pCGR7的SC334培养物。发现在于15℃生长和诱导的培养物中GLA的水平高于于30℃下生长的培养物中的水平(4.23％对1.68％)。这是因为在30℃培养物中，18∶2ω6→18∶3ω6的转化率较低(11.6％，相比之下，在15℃下为29％)，尽管18∶1ω9→18∶2ω6的转化率较高(65％，相比之下，于30℃下为60％)(图8)。这些结果提示，Δ12-和Δ6-去饱和酶的最适表达温度可能不同。
在该项研究中检查的各种参数中，生长温度、酵母宿主菌株和培养基组分对去饱和酶的表达具有最显著的影响，而加入底物所选的时间(timing)和诱导物的浓度对去饱和酶表达的影响不显著。
这些数据表明，可以从高山被孢霉中分离出编码去饱和酶的两种DNA，所述去饱和酶可以将LA转化为GLA、或将油酸转化为LA，并且可以在异源系统中单独或组合地表达，以用来生产多不饱和长链脂肪酸。示例为通过在酵母中表达Δ12-和Δ6-去饱和酶，由油酸生产GLA。
实施例9鉴定高山被孢霉Δ5和Δ6去饱和酶的同源物用Ma29的氨基酸100-446作为询问物(query)，通过NCBI对所表达的序列标记数据库进行TBLASTN检索，鉴定出一个编码推定的Δ5去饱和酶的核酸序列。用Ma29序列的截短部分，以避免挑出基于该去饱和酶N-末端细胞色素b5部分的同源物。来自盘基网柄菌的est的推导氨基酸序列(登记号为C25549)显示出与Ma29非常显著的同源，与Ma524的同源性较低，但仍显著同源。DNA序列以SEQ ID NO19显示。氨基酸序列以SEQ ID NO20显示。
实施例10鉴定其它产生PUFA的生物中的高山被孢霉Δ5和Δ6同源物为了寻找参与PUFA生产的去饱和酶，由从Phaeodactylumtricornutum分离的总RNA构建了一个cDNA文库。按照生产商的说明，使用市售的试剂盒(GIBCO-BRL)，在pSPORT1(GIBCO-BRL)中构建一个基于质粒的cDNA文库。对随机的cDNA克隆测序，通过对所述数据库进行BLAST检索，并与Ma29和Ma524的序列比较，鉴定出编码推定Δ5或Δ6去饱和酶的核酸序列。
从Phaeodactylum文库中鉴定出一个克隆，它与Ma29和Ma524同源；将其称为144-011-B12。该DNA序列以SEQ ID NO21显示。该氨基酸序列以SEQ ID NO22显示。
实施例11在其它产生PUFA的生物中鉴定高山被孢霉Δ5和Δ6的同源物为了寻找参与PUFA生产的去饱和酶，由从Schizochytrium物种分离的总RNA构建了一个cDNA文库。按照生产商的说明，使用市售的试剂盒(GIBCO-BRL)，在pSPORT1(GIBCO-BRL)中构建了一个基于质粒的cDNA文库。对随机的cDNA克隆测序，通过对所述数据库进行BLAST检索，并与Ma29和Ma524的序列比较，鉴定出编码推定Δ5或Δ6去饱和酶的核酸序列。
从Schizochytrium文库中鉴定出一个克隆，它与Ma29和Ma524同源；将其称为81-23-C7。该克隆含有一个～1kb的插入片段。用通用的正向和反向测序引物，从该克隆的每个末端获得部分序列。来自正向引物的DNA序列以SEQ ID NO23显示。其肽序列以SEQ ID NO24显示。来自反向引物的DNA序列以SEQ ID NO25显示。来自反向引物的氨基酸序列以SEQ ID NO26显示。
实施例12人去饱和酶的基因序列根据人cDNA序列与高山被孢霉去饱和酶基因序列之间的同源性，分离出潜在参与长链多不饱和脂肪酸生物合成的人去饱和酶基因序列。发现已知在膜结合去饱和酶中保守的三种保守“组氨酸框”。正如某些其它膜结合去饱和酶一样，发现最后一个HXXHH组氨酸框为QXXHH。所述推定的人去饱和酶的氨基酸序列表现出与高山被孢霉Δ5、Δ6、Δ9和Δ12去饱和酶的同源性。
用高山被孢霉Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶的cDNA序列，检索IncytePharmaceuticals，Inc.(Palo Alto，California 94304)的LifeSeq数据库。将该Δ5去饱和酶序列分为多个片段1)氨基酸号1-150，2)氨基酸号151-300和3)氨基酸号301-446。将该Δ6去饱和酶序列分为3个片段1)氨基酸号1-150，2)氨基酸号151-300以及3)氨基酸号301-457。采用＂tblastn＂算法，对该数据库检索所述多肽片段。该算法将一个蛋白询问物序列对在所有6个可读框(两条链)中动态翻译的(dynamicallytranslated)核苷酸序列数据库进行比较。
高山被孢霉Δ5和Δ6的多肽片段2和3与表6中概述的CloneID序列具有同源性。所述CloneID代表Incyte LifeSeq数据库的一个单个序列。在综述了＂tblastn＂结果后，对于不同的CloneID数，用严格性＞＝50以及产物计分＜＝100的假设设定，检索克隆信息。克隆信息结果显示的信息包括ClusterID、CloneID、Library、HitID、Hit Description。选择时，ClusterID数显示出属于该ClusterID的所有克隆的克隆信息。装配命令将所有包含该ClusterID的CloneID装配。对于GCG(Genetics ComputerGroup，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，Wisconsin 53705)装配，使用以下假设设定；字的大小7最小重叠14严格性0.8最小一致性14最大间隙10间隙加权值8长度加权值2GCG装配结果显示出在该CloneID内的序列信息基础上产生的重叠群。一个重叠群为基于这些序列中同源性区域的DNA序列的序列对比。在一个重叠群内的序列对比的DNA序列基础上，产生一个新序列(共有序列)。鉴定出含有该CloneID的重叠群，在所述CloneID序列对比(参见SEQ ID NO27-SEQ ID NO32)的基础上，编辑该共有序列的不确定位点，以产生最佳的可能序列。对于列于表6中的所有6个CloneID重复该程序。这产生5个独特的重叠群。将这5个重叠群编辑的共有序列输入Sequencher软件程序(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，Michigan 48 105)中。装配这些共有序列。重叠群2511785与重叠群3506132重叠，这一新的重叠群称为2535(SEQ ID NO33)。将来自Sequencher程序的重叠群拷贝到GCG的序列分析软件包中。
将每个重叠群在所有6个可读框中翻译为蛋白序列。采用FastA检索(一种对询问序列和一组相同类型(核酸或蛋白)序列之间的相似性的Pearson和Lipman检索)，将高山被孢霉Δ5(MA29)和Δ6(MA524)的序列与每个所翻译的重叠群进行比较。这些序列间的同源性提示每个重叠群的可读框。利用在高山被孢霉Δ5和Δ6与重叠群2535和3854933中的同源性，产生最后一个重叠群，称为253538a。图13为最后一个重叠群253538a和MA29的FastA匹配。图14为最后一个重叠群253538a和MA524的FastA匹配。在SEQ ID NO27-SEQ ID NO33中提出了各个重叠群的DNA序列。在SEQ ID NO34-SEQ ID NO40中显示各个肽序列。
虽然通过合并重叠群2535和重叠群3854933这两个重叠群产生可读框，但重叠群2535显示出，在该重叠群开始处有一段与重叠群3854933不匹配的独特序列。因此，可能的是，同人类基因一样，这些重叠群产生自非依赖性的去饱和酶。
重叠群253538a含有一个编码432个氨基酸的可读框。它起始于Gln(CAG)，结束于终止密码子(TGA)。重叠群253538a与高山被孢霉Δ5和Δ6序列均对齐，提示它可能为所述两种去饱和酶以及相互之间享有同源性的其它已知去饱和酶中的任一种。在表18中列出了各个重叠群，以及可以利用中间重叠群2535和最后的重叠群253538a，来分离人去饱和酶的完整基因。
人去饱和酶的用途利用前述实施例中所述的方法，可以将这些人类序列在酵母和植物中表达。对于在转基因动物的哺乳动物细胞中进行表达，这些基因可以提供优越的密码子偏倚。
另外，可以用这些序列从其它生物分离相关的去饱和酶基因。
表6
实施例13I.婴儿配制食品A.补充铁的Isomil大豆配制食品。
用法作为婴儿、儿童和对牛乳有变态反应或过敏性的成年人的饮料。用于患有应避免乳糖病症患者的摄食物(feeding)所述病症为乳糖酶缺乏、不耐受乳糖和半乳糖血。
特征*大豆蛋白分离物，以避免牛乳蛋白变态反应或过敏的病症*无乳糖配方，以避免与乳糖有关的腹泻*重量摩尔渗透压浓度低(240mOsm/kg水)，以降低渗透性腹泻的风险。
*双重碳水化合物(玉米糖浆和蔗糖)，设计以增强碳水化合物的吸收，并降低超过受损消化道吸收能力的风险。
*每100卡1.8mg铁(作为硫酸亚铁)，有助于预防缺铁。
*推荐水平的生物素和矿物质。
*植物油，提供推荐水平的必需脂肪酸。
*乳白色，稠度似乳，有愉快的香味。
成分(Pareve、i)85％水、4.9％玉米糖浆、2.6％糖(蔗糖)、2.1％豆油、1.9％大豆蛋白分离物、1.4％椰子油、0.15％柠檬酸钙、0.11％磷酸钙(calcium phosphate tribasic)、柠檬酸钾、磷酸二氢钾、氯化钾、甘油一酯和甘油二酯、大豆卵磷脂、角叉藻聚糖、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、氯化镁、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化胆碱、牛磺酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-乙酸生育酚、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐(thiamine chloride hydrochloride)、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、维生素K1、生物素、亚硒酸钠、维生素D3and维生素B12。
B.用于腹泻的IsomilDF大豆配制食品用法作为短期摄食物，用于婴儿和刚学步小孩腹泻的食疗(dietary management)。
特征*第一种婴儿配制食品，含有加入的腹泻治疗专用的食用纤维素，所述食用纤维素来自大豆纤维。
*临床表现为，减少婴儿在中等或严重腹泻期间便溏、大便清稀的时间。
*营养完全，符合婴儿的营养需要。
*添加L-甲硫氨酸的大豆蛋白分离物，符合或超过婴儿对所有必需氨基酸的需求。
*无乳糖配方，以避免与乳糖相关的腹泻。
*重量摩尔渗透压浓度低(240mOsm/kg水)，以降低渗透性腹泻的风险。
*双重碳水化合物(玉米糖浆和蔗糖)，设计以增强碳水化合物的吸收，并降低超过受损消化道吸收能力的风险。
*符合或超过美国儿科学学会营养委员会(the Committee onNutrition of the American Academy of Pediatrics)推荐的和婴儿配制食品法案(the Infant Formula Act)需要的维生素和矿物质水平。
*每100卡1.8mg铁(作为硫酸亚铁)，有助于预防缺铁。
*植物油，提供推荐水平的必需脂肪酸。
成分(Pareve、i)86％水、4.8％玉米糖浆、2.5％糖(蔗糖)、2.1％豆油、2.0％大豆蛋白分离物、1.4％椰子油、0.77％大豆纤维、0.12％柠檬酸钙、0.11％磷酸钙、0.10％柠檬酸钾、氯化钾、磷酸二氢钾、甘油一酯和甘油二酯、大豆卵磷脂、角叉藻聚糖、氯化镁、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化胆碱、牛磺酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-乙酸生育酚、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、维生素K1、生物素、亚硒酸钠、维生素D3and 维生素B12。
C.补充铁的IsomilSF无蔗糖大豆配制食品用法作为对牛乳蛋白有变态反应或过敏或对蔗糖不耐受的婴儿、儿童和成年人的饮料。用于患有应避免乳糖和蔗糖病征的患者的摄食物。
特征*大豆蛋白分离物，以避免牛乳蛋白变态反应或过敏性的病症*无乳糖配方，避免与乳糖相关的腹泻(碳水化合物源为Polycose葡萄糖聚合物)。
*无蔗糖，用于不能耐受蔗糖的患者。
*重量摩尔渗透压浓度低(180mOsm/kg水)，以降低渗透性腹泻的风险。
*每100卡1.8mg铁(作为硫酸亚铁)，有助于预防缺铁。
*推荐水平的维生素和矿物质。
*植物油，提供推荐水平的必需脂肪酸。
*乳白色，稠度似乳和愉快的香味。
成分(Pareve、i)75％水、11.8％水解玉米淀粉、4.1％豆油、4.1％大豆蛋白分离物、2.8％椰子油、1.0％改性玉米淀粉、0.38％磷酸钙、0.17％柠檬酸钾、0.13％氯化钾、甘油一酯和甘油二酯、大豆卵磷脂、氯化镁、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、碳酸钙、氯化钠、氯化胆碱、角叉藻聚糖、牛磺酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-乙酸生育酚、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、维生素K1、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和维生素B12.
D.补充铁的Isomil20即食大豆配制食品20Cal/fl oz。
用法当需要大豆摄食物时。
成分(Pareve、i)85％水、4.9％玉米糖浆、2.6％糖(蔗糖)、2.1％豆油、1.9％大豆蛋白分离物、1.4％椰子油、0.15％柠檬酸钙、0.11％磷酸钙、柠檬酸钾、磷酸二氢钾、氯化钾、甘油一酯和二酯、大豆卵磷脂、角叉藻聚糖、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、氯化镁、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化胆碱、牛磺酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-乙酸生育酚、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、维生素K1、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和维生素B12。
E.Similac婴儿配制食品用法当需要婴儿配制食品时如果在1岁前决定中断母乳喂养，如果需要补充母乳培养，或如果不采用母乳喂养而进行的常规喂养食品。
特征*对良好生长合适质量的蛋白；经过热变性，这降低与乳相关的肠失血的风险。
*来自掺混植物油(双均化的)的脂肪，提供容易吸收的必需的亚油酸。
*作为乳糖的碳水化合物，其比例类似于人乳的比例。
*肾溶质负荷低，以最大限度地减少对正发育器官的压力。
*粉末、浓缩液和即食形式。
成分(i-D)水、脱脂乳(nonfat milk)、乳糖、豆油、椰子油、甘油一酯和二酯、大豆卵磷脂、抗坏血酸、角叉藻聚糖、氯化胆碱、牛磺酸、m-肌醇、α-乙酸生育酚、硫酸锌、烟酰胺、硫酸亚铁、泛酸钙、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、维生素K1、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和维生素B12。
F.补充铁的SimilacNeoCare早产婴儿配制食品用法用于早产婴儿出院后的特殊营养需求。Similac NeoCare是一种营养完全的配制食品，开发用来为早产婴儿提供必需的额外的热量、蛋白、维生素和矿物质，以促进赶上生长并支持发育。
特征*降低对热量和维生素补充的需要。比标准的足月婴儿配制食品的热量(20Cal/fl oz)多(22Cal/fl oz)。
*高吸收的混合脂，具有中链(medium-chain)甘油三酯(MCT油)，有助于符合早产婴儿特殊的消化需求。
*每100卡高水平的蛋白、维生素和矿物质，以延长住院起始的营养支持。
*更多的钙和磷，以改善骨的矿质化。
成分i-D玉米糖浆固体、脱脂乳、乳糖、乳清蛋白浓缩物、豆油、高油酸红花油、分级椰子油(中链甘油三酯)、椰子油、柠檬酸钾、磷酸钙、碳酸钙、抗坏血酸、氯化镁、氯化钾、氯化钠、牛磺酸、硫酸亚铁、m-肌醇、氯化胆碱、ascorbyl palmitate、L-肉碱、α-乙酸生育酚、硫酸锌、烟酰胺、混合生育酚、柠檬酸钠、泛酸钙、硫酸铜、氯化硫胺素盐酸盐、棕榈酸维生素A、β-胡萝卜素、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、维生素K1、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和维生素B12。
G.现成可用的Similac天然护理低铁人乳增强剂、24Cal/fl oz。
用法设计用来与人乳混合，或与人乳交替给出生体重低的婴儿喂食。
成分i-D水、脱脂乳、水解玉米淀粉、乳糖、分级椰子油(中链甘油三酯)、乳清蛋白浓缩物、soil oil、椰子油、磷酸钙、柠檬酸钾、氯化镁、柠檬酸钠、抗坏血酸、碳酸钙、甘油一酯和二酯、大豆卵磷脂、角叉藻聚糖、氯化胆碱、m-肌醇、牛磺酸、烟酰胺、L-肉碱、α乙酸生育酚、硫酸锌、氯化钾、泛酸钙、硫酸亚铁、硫酸铜、核黄素、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇、生物素、叶酸、硫酸锰、维生素K1、维生素D3、亚硒酸钠和维生素B12。
本发明的各种PUFA可以替代和/或加入上述婴儿配制食品和本领域技术人员已知的其它婴儿配制食品。II.营养制剂A.ENSURE用法ENSURE是一种低残留物的液体食品，设计主要作为口服营养增补剂，与膳食一起使用或在餐间使用，或作为膳食替代物适量使用。ENSURE是无乳糖和无谷蛋白的食品，适用于改善的膳食，包括低胆固醇膳食。虽然它主要为口服增补剂，但它可以管饲。患者病征*用于保持改善的膳食的患者*用于处于营养风险的老年患者*用于无意识体重减轻的患者*用于由疾病或外科手术复原的患者*用于需要低残留物膳食的患者成分i-D水、糖(蔗糖)、麦芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸钙和酪蛋白酸钠、高油酸红花油、大豆蛋白分离物、豆油、Canola油、柠檬酸钾、磷酸钙、柠檬酸钠、氯化镁、磷酸氢镁、人工香料、氯化钠、大豆卵磷脂、氯化胆碱、抗坏血酸、角叉藻聚糖、硫酸锌、硫酸亚铁、α-乙酸生育酚、Gellan Gum、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、钼酸钠、氯化铬、生物素、碘化钾、硒酸钠。
B.ENSURE排(Bar)用法ENSURE排是完全、平衡的营养品，用于与膳食一起或在餐间增补使用。它们提供美味的富含营养的食品，来替代其它小吃。ENSURE排含有＜lg乳糖/排，巧克力勿奇糖小饼(Chocolate FudgeBrownie)的食用香料无谷蛋白。(蜂蜜全麦粉酥(Honey Graham Crunch)的食用香料含有谷蛋白)。患者病征*用于需要额外热量、蛋白质、维生素和矿物质的患者*对没有摄入足够热量和营养物的人尤其有用*用于具有嚼咽能力的人*对花生过敏或对坚果有任何类型过敏的人不要使用成分
蜂蜜全麦粉酥--高果糖玉米糖浆、大豆蛋白分离物、红糖、蜂蜜、麦芽糖糊精(玉米)、脆米(Crisp Rice)(精白米、糖[蔗糖]、盐[氯化钠]和麦芽)、燕麦麸皮(Oat Bran)、部分氢化棉籽油和豆油、大豆多糖、甘油、乳清蛋白浓缩物、聚葡萄糖、蔗糖、酪蛋白酸钙、可可粉、人工香料、Canola油、高油酸红花油、脱酯奶粉、乳清粉、大豆卵磷脂和玉米油。在加工坚果的设备中生产。维生素和矿物质磷酸钙、磷酸氢二钾、氧化镁、盐(氯化钠)、氯化钾、抗坏血酸、正磷酸铁、α-乙酸生育酚、烟酰胺、氧化锌、泛酸钙、葡萄糖酸铜、硫酸锰、核黄素、β-胡萝卜素、盐酸吡哆醇、单硝酸硫胺、叶酸、生物素、氯化铬、碘化钾、硒酸钠、钼酸钠、维生素K1、维生素D3和维生素B12。蛋白质蜂蜜全麦粉酥-蛋白源为大豆蛋白分离物和乳蛋白的混合物。
大豆蛋白分离物 74％乳蛋白 26％脂肪蜂蜜全麦粉酥-脂肪源为部分氢化棉籽油和豆油、canola油、高油酸红花油和玉米油以及大豆卵磷脂的混合物.
部分氢化棉籽油和豆油76％Canola油8％高油酸红花油8％玉米油 4％大豆卵磷脂 4％碳水化合物蜂蜜全麦粉酥-碳水化合物源为高果糖玉米糖浆，红糖，麦芽糖糊精，蜂蜜，脆米，甘油，大豆多糖和燕麦麸皮的组合物。
高果糖玉米糖浆 24％
红糖21％麦芽糖糊精 12％蜂蜜11％脆米9％甘油9％大豆多糖7％燕麦麸皮7％\C.ENSURE高蛋白(ENSUREHIGH PROTEIN)用法ENSUKE高蛋白是一种浓缩的高蛋白液体食品，设计用于在其膳食中需要额外热量、蛋白、维生素和矿物质的人。它可以用作口服营养增补剂，与膳食一起使用或餐间使用，以作为膳食替代品适量使用。ENSURE高蛋白无乳糖和无谷蛋白，适合从一般外科手术或髋部骨折复原的人以及处于压力性溃疡风险的人使用。患者病征*用于需要额外热量、蛋白、维生素和矿物质的患者，诸如从一般外科手术或髋部骨折复原的患者、处于压力性溃疡风险的患者、以及保持低胆固醇膳食的患者特征-*饱和脂肪低*每份饮食含有6g总脂肪和＜5mg的胆固醇*味浓、奶油味*出色的蛋白、钙和其它必需维生素和矿物质源*用于低胆固醇饮食*无乳糖，容易消化成分香草Supreme(Vanilla Supreme)-i-D水、糖(蔗糖)、麦芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸钙和酪蛋白酸钠、高油酸红花油、大豆蛋白分离物、豆油、Canola油、柠檬酸钾、磷酸钙、柠檬酸钠、氯化镁、磷酸氢镁、人工香料、氯化钠、大豆卵磷脂、氯化胆碱、抗坏血酸、角叉藻聚糖、硫酸锌、硫酸亚铁(Ferrous Suffate)、α-乙酸生育酚、Gellan Gum、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸(Folio Acid)、钼酸钠、氯化铬、生物素、碘化钾、硒酸钠、维生素K1、维生素D3和维生素B12。蛋白质该蛋白源为酪蛋白和大豆这两种具有高生物学价值的蛋白的混合物。
酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙 85％大豆蛋白分离物 15％脂肪该脂肪源为三种油的混合物高油酸红花油、carnola油或豆油。
高油酸红花油40％Canola油30％豆油30％ENSURE高蛋白中的脂肪水平符合美国心脏联合会(AmericanHeart Association)(AHA)的指南。ENSURE高蛋白中的6克脂肪代表总热量的24％，2.6％的所述脂肪来自饱和脂肪酸，7.9％来自多不饱和脂肪酸。这些数值在AHA指南的范围内，该范围为≤30％的总热量来自脂肪，＜10％的热量来自饱和脂肪酸，≤10％的总热量来自多不饱和脂肪酸。碳水化合物ENSURE高蛋白含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。适度甜度和多种香味(香草至尊(supreme)，巧克力王(chocolate royal)，野浆果(wildberry)及香蕉)，加上山胡桃、樱桃、草莓、柠檬、橙中的VARI-FLAVORSOFlavor Pacs，有助于预防香味疲劳，并有助于使患者顺从。香草香精和其它非巧克力风味蔗糖60％麦芽糖糊精 40％巧克力蔗糖70％麦芽糖糊精 30％D.ENSURE清淡食品(ENSURELIGHT)用法ENSURE清淡食品是一种低脂肪液体食品，设计用作餐时或进餐之间口服的营养增补剂。ENSURE清淡食品无乳糖和无谷蛋白，适用于改善的饮食，包括低胆固醇饮食。患者病征*用于在增补剂中需要额外营养的正常体重或超重的患者，所述增补剂含有的脂肪比ENSURE低50％，热量少20％*用于饮食不当(don’t eat right)并需要额外营养的健康成年人特征*脂肪和饱和脂肪低*每份饮食含有3g总脂肪和＜5mg胆固醇*味浓(rich)，奶油味*出色的钙和其它必需维生素和矿物质源*低胆固醇饮食*无乳糖，容易消化成分法国香草(French Vanilla)i-D水、麦芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、酪蛋白酸钙、高油酸红花油、Canola油、氯化镁、柠檬酸钠、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、磷酸氢镁、天然和人工香料、磷酸钙、纤维素胶、氯化胆碱、大豆卵磷脂、角叉藻聚糖、盐(氯化钠)、抗坏血酸、纤维素胶、硫酸亚铁、α-乙酸生育酚、硫酸锌、烟酰胺、硫酸锰、泛酸钙、硫酸铜、氯化硫胺素盐酸盐、棕榈酸维生素A、盐酸吡哆醇、核黄素、氯化铬、叶酸、钼酸钠、生物素、碘化钾、硒酸钠、维生素K1、维生素D3和维生素B12。蛋白质该蛋白源为酪蛋白酸钙。
酪蛋白酸钙 100％脂肪该脂肪源为两种油的混合物高油酸红花油和canola油。
高油酸红花油 70％Canola油 30％ENSURE清淡食品中的脂肪水平符合美国心脏联合会(AHA)的指南。ENSURE清淡食品中的3克脂肪代表13.5％的总热量，1.4％的所述脂肪来自饱和脂肪酸，而2.6％来自多不饱和脂肪酸。这些数值在AHA指南的范围内，该范围为≤30％的总热量来自脂肪，＜10％的热量来自饱和脂肪酸，且≤10％的总热量来自多不饱和脂肪酸。碳水化合物ENSURE清淡食品含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。所述巧克力食用香料也含有玉米糖浆。适度甜度和香味多种(法国香草，巧克力至尊，草莓swirl)加上山胡桃、樱桃、草莓、柠檬、橙中的VARI-FLAVORSFlavor Pacs，有助于预防香味疲劳，并有助于使患者顺从。香草香精和其它非巧克力风味蔗糖51％麦芽糖糊精 49％巧克力蔗糖47.0％玉米糖浆26.5％麦芽糖糊精 26.5％维生素和矿物质对于24种关键维生素和矿物质，一份8-fl-oz的ENSURE清淡食品提供至少25％的RDIs。咖啡因巧克力食用香料含有2.1mg咖啡因/8 fl oz。
E.ENSURE PLUS用法ENSURE PLUS是一种高热量、低残留物的液体食品，在当需要额外的热量和营养物、但蛋白浓度正常时使用。设计它主要用作口服营养增补剂，以在用餐时或进餐之间使用，或作为饮食替代品适量使用。ENSURE PLUS无乳糖和无谷蛋白的。虽然它主要是口服营养增补剂，但可以用于管饲。患者病征*用于在有限体积内需要额外热量和营养物、但蛋白浓度正常的患者*用于需要获得或维持健康体重的患者特征*味浓，奶油味*良好的必需维生素和矿物质源成分香草香精i-D水、玉米糖浆、麦芽糖糊精(玉米)、玉米油、酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙、糖(蔗糖)、大豆蛋白分离物、氯化镁、柠檬酸钾、磷酸钙、大豆卵磷脂、天然和人工香料、柠檬酸钠、氯化钾、氯化胆碱、抗坏血酸、角叉藻聚糖、硫酸锌、硫酸亚铁、α-乙酸生育酚、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、氯化硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇、核黄素、棕榈酸维生素A、叶酸、生物素、氯化铬、钼酸钠、碘化钾、亚硒酸钠、维生素K1，维生素B12和维生素D3。蛋白质该蛋白源为酪蛋白和大豆这两种具有高生物价值的蛋白质的混合物。
酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙 84％大豆蛋白分离物 16％脂肪该脂肪源为玉米油。
玉米油 100％碳水化合物ENSURE PLUS含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。适度甜度和香味的品种(法国香草、巧克力、草莓、咖啡、奶油山核桃及甜酒蛋白)加上山胡桃、樱桃、草莓、柠檬、橙的VARI-FLAVORSFlavor Pacs，有助于预防香味疲劳，并有助于使患者顺从。香草、草莓、奶油山核桃和咖啡食用香料玉米糖浆39％麦芽糖糊精 38％蔗糖23％巧克力和甜酒蛋白食用香料玉米糖浆36％麦芽糖糊精 34％蔗糖30％维生素和矿物质对于25种关键维生素和矿物质，一份8-fl-oz的ENSUREPLUS提供至少15％的RDIs。咖啡因巧克力食用香料含有3.1mg咖啡因/8 fl oz。咖啡香料含有微量的咖啡因。
F.ENSURE PLUSHN用法ENSURE PLUS HN一种营养完全、高热量、高氮的液体食品，设计它用于具有高热量和高蛋白需要或体积耐受有限的人。它可以用于口服增补，或用于通过管饲的总营养支持。ENSURE PLUSHN无乳糖和无谷蛋白。患者病征*用于热量和蛋白需要增加的患者，诸如在手术或受伤后*用于体积耐受有限和早饱满感的患者特征*用于增补的营养或总营养*用于口服或管饲*1.5CaVmL*高氮*热量密集成分香草香精i-D水、麦芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙、玉米油、糖(蔗糖)、大豆蛋白分离物、氯化镁、柠檬酸钾、磷酸钙、大豆卵磷脂、天然和人工香料、柠檬酸钠、氯化胆碱、抗坏血酸、牛磺酸、L-肉碱、硫酸锌、硫酸亚铁、α-乙酸生育酚、烟酰胺、角叉藻聚糖、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、氯化硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇、核黄素、棕榈酸维生素A、叶酸、生物素、氯化铬、钼酸钠、碘化钾、亚硒酸钠、维生素K1、维生素B12和维生素D3。
G.ENSURE粉用法ENSURE粉(用水重建)是一种低残留物的液体食品，设计它主要用来作为进餐时或进餐之间使用的口服营养增补剂。ENSUREPOWDER无乳糖和无谷蛋白，适用于改善的饮食，包括低胆固醇饮食。患者病征*用于保持改善饮食的患者*用于有营养风险的老年患者*用于由疾病/手术复原的患者*用于需要低残留物饮食的患者特征*方便，易于混合*饱和脂肪含量低*每份饮食含有9g总脂肪和＜5mg的胆固醇*维生素和矿物质含量高*用于低胆固醇饮食*无乳糖，容易消化成分i-D玉米糖浆、麦芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、玉米油、酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙、大豆蛋白分离物、人工香料、柠檬酸钾、氯化镁、柠檬酸钠、磷酸钙、氯化钾、大豆卵磷脂、抗坏血酸、氯化胆碱、硫酸锌、硫酸亚铁、α-乙酸生育酚、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、氯化硫胺素盐酸盐、硫酸铜、盐酸吡哆醇、核黄素、棕榈酸维生素A、叶酸、生物素、钼酸钠、氯化铬、碘化钾、硒酸钠、维生素K1、维生素D3和维生素B12。蛋白质该蛋白源为酪蛋白和大豆这两种具有高生物价值的蛋白质的混合物。
酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙84％大豆蛋白分离物16％脂肪该脂肪源为玉米油。
玉米油100％碳水化合物ENSURE粉含有玉米糖浆、麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。ENSURE粉的适度甜度加上山胡桃、樱桃、草莓、柠檬和橙的VARI-FLAVORSFlavor Pacs，有助于预防香味疲劳，并有助于使患者顺从。香草玉米糖浆35％麦芽糖糊精 35％蔗糖30％H.ENSURE布丁用法ENSURE布丁是一种营养密集的增补剂，以非液体形式提供平衡的营养，可进餐时或进餐之间使用。它适合于稠度改善的饮食(例如软饮食、泥酱饮食、或全液体)，或适用于吞咽损害的人。ENSURE布丁无谷蛋白。患者病征*用于保持稠度改善的饮食(例如软饮食、泥酱饮食、或全液体)的患者*用于吞咽损害的患者特征*味浓，奶油味，味道好*良好的必需维生素和矿物质源，方便，不需要冷藏*无谷蛋白每5 oz的营养分布型热量250，蛋白质10.9％，总脂肪34.9％，碳水化合物54.2％成分香草香精i-D脱脂乳、水、糖(蔗糖)、部分氢化豆油、改性食品淀粉、硫酸镁、Sodium Stearoyl Lactylate、磷酸氢二钠、人工香料、抗坏血酸、硫酸锌、硫酸亚铁、α-乙酸生育酚、氯化胆碱、烟酰胺、硫酸锰、泛酸钙、FD&amp;C Yellow#5、柠檬酸钾、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇、核黄素、FD&amp;C Yellow#6、叶酸、生物素、维生素K1、维生素D3和维生素B12。蛋白质该蛋白质源为脱脂乳。
脱脂乳 100％脂肪该脂肪源为氢化豆油。
氢化豆油100％碳水化合物ENSURE布丁含有蔗糖和改性食品淀粉的组合物。适度的甜度和香味的品种(香草香精、巧克力、黄油硬糖和木薯淀粉)有助于预防香味劳。每份该制品含有9.2克乳糖。香草香精和其它非巧克力风味蔗糖56％乳糖27％改性食品淀粉17％巧克力蔗糖58％乳糖26％改性食品淀粉16％I.具有纤维的ENSURE用法具有纤维的ENSURE是一种含纤维、营养完全的液体食品，设计用于可以从食物纤维和营养物的增加而获益的人。具有纤维的ENSURE适于不需要低残留物饮食的人。它可以口服或管饲，可以用作常规饮食的营养增补剂，或作为饮食替代品适量使用。具有纤维的ENSURE无乳糖和无谷蛋白，适用于改善的饮食，包括低胆固醇饮食。患者病征*用于可以从食物纤维和营养物的增加而获益的患者特征*新的高级配制食品-饱和脂肪含量低，维生素和矿物质含量较高*每份饮食含有6g总脂肪和＜5mg胆固醇*味浓，奶油味*良好的纤维源*出色的维生素和矿物质源*用于低胆固醇饮食*无乳糖和无谷蛋白成分香草香精i-D水、麦芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙、燕麦纤维、高油酸红花油、Canola油、大豆蛋白分离物、玉米油、大豆纤维、磷酸钙、氯化镁、柠檬酸钾、纤维素胶、大豆卵磷脂、磷酸氢二钾、柠檬酸钠、天然和人工香料、氯化胆碱、磷酸镁、抗坏血酸、纤维素胶、氯化钾、角叉藻聚糖、硫酸亚铁、α-乙酸生育酚、硫酸锌、烟酰胺、硫酸锰、泛酸钙、硫酸铜、棕榈酸维生素A、氯化硫胺素盐酸盐、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、氯化铬、生物素、钼酸钠、碘化钾、硒酸钠、维生素K1、维生素D3和维生素B12。蛋白质该蛋白源为酪蛋白和大豆这两种具有高生物价值的蛋白质的混合物。
酪蛋白酸钠和酪蛋白酸钙80％大豆蛋白分离物20％脂肪该脂肪源为三种油的混合物高油酸红花油、canola油或豆油。
高油酸红花油 40％Canola油 40％玉米油20％具有纤维的ENSURE中的脂肪水平符合美国心脏联合会(AHA)的指南。具有纤维的ENSURE中的6克脂肪代表22％总热量，2.01％的脂肪来自饱和脂肪酸，而6.7％来自多不饱和脂肪酸。这些数值在AHA指南的范围内，该范围为≤30％的总热量来自脂肪，＜10％的热量来自饱和脂肪酸，≤10％的总热量来自多不饱和脂肪酸。碳水化合物具有纤维的ENSURE含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。适度甜度和香味的品种(法国香草、巧克力和奶油山核桃)加上山胡桃、樱桃、草莓、柠檬、橙中的VARI-FLAVORSFlavor Pacs，有助于预防香味疲劳，并有助于使患者顺从。香草香精和其它非巧克力香味麦芽糖糊精 66％蔗糖25％燕麦纤维7％大豆纤维2％巧克力麦芽糖糊精 55％蔗糖36％燕麦纤维7％大豆纤维2％纤维用于具有纤维的ENSURE的纤维混合物由燕麦纤维和大豆多糖组成。该混合物每8-fl-oz一罐产生大约4克总饮食纤维。不溶性纤维与可溶性纤维之比为955。
以上所述和本领域技术人员已知的各种营养增补剂，可以用本发明的PUFA替代和/或补充。
J.Oxepa营养制品Oxepa是一种低碳水化合物、热量密集的肠营养制品，设计用于有ARDS风险的患者的食疗。它具有独特的成分组合物，包括申报专利的油混合物，它含有二十碳五烯酸(来自鱼油的EPA)、γ-亚麻酸(来自琉璃苣油的GLA)和提高水平的抗氧化剂。热量分布*热量密度高，为1.5Cal/mL(355Cal/8 fl oz)，以将符合能量需要所需的体积减至最小。*Oxepa中的热量分布示于表7。
脂肪*每8-fl oz一份的Oxepa含有22.2g脂肪(93.7g/L)。*该脂肪源为以下油的混合物31.8％Canola油、25％中链甘油三酯(MCT)、20％琉璃苣油、20％鱼油和3.2％大豆卵磷脂。Oxepa典型的脂肪酸分布型示于表8。*Oxepa提供平衡量的多不饱和、单不饱和和饱和脂肪酸，如表10所示。*中链甘油三酯(MCT)—所述脂肪混合物的25％—有助于胃排空，因为它们被肠道吸收，而不被胆汁酸乳化。
Oxepa营养制品的各种脂肪酸组分可以用本发明的PUFA替代和/或补充。
*脂肪酸等于大约95％总脂肪。
碳水化合物*每8-fl-oz一份饮食的碳水化合物含量为25.0g(105.5g/L)。*该碳水化合物源为45％麦芽糖糊精(一种复杂的碳水化合物)和55％蔗糖(一种简单糖)，这两种糖均容易被消化和吸收。*Oxepa的高脂肪和低碳水化合物的含量，被设计用于最大限度的减少二氧化碳(CO2)的产生。高CO2水平可能使断奶小儿成为依赖于呼吸器的患者。碳水化合物水平低也可以对已经形成应急诱导的血糖过高的患者有用。*Oxepa无乳糖。
饮食碳水化合物、来自蛋白质的氨基酸和脂肪的甘油部分，在机体内可以转化为葡萄糖。在该过程中，满足了葡萄糖依赖性组织(诸如中枢神经系统和红细胞)的碳水化合物需求。然而，无碳水化合物的饮食可以导致酮病、组织蛋白过度的分解代谢以及流体和电解质的丧失。如果热量摄入合适，则通过每日摄入50-100克的可消化碳水化合物，可以预防这些效应。如果满足能量需求，则Oxepa中的碳水化合物水平也足以将糖异生降至最低水平。蛋白质*每8-fl-oz一份的Oxepa含有14.8g的蛋白质(62.5g/L)。*总热量/氮之比(150∶1)符合stressed患者的需要。*Oxepa提供足够的蛋白质，促进合成代谢并维持瘦人的质量(leanbody mass)，而不引起呼吸问题。高蛋白质摄入是呼吸能力不全患者所关注的问题。虽然蛋白质对CO2的产生几乎没有作用，但高蛋白质饮食会增加呼吸器的驱动力。*Oxepa蛋白质源为86.8％酪蛋白酸钠和13.2％酪蛋白酸钙。*如表11所证明，Oxepa中的蛋白系统的氨基酸分布型符合或超过国家科学院设定的高质量蛋白质的标准。*Oxepa无谷蛋白。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均代表本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请均通过引用结合到本文中，其程度如同每个单独的出版物和专利申请具体和单独指出通过引用结合到本文中一样。
现在完全描述了本发明，对本领域技术人员显而易见的是，可以进行许多改变和修改，而不偏离所附权利要求书的精神和范围。
序列表(1)一般资料(i)申请人KNUTZON，DEBORAHMURKERJI，PRADIPHUANG，YUNG-SHENGTHURMOND，JENNIFERCHAUDHARY，SUNITALEONARD，AMANDA(ii)发明名称合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物(iii)序列数40(iv)通信地址(A)收信人LIMBACH AND LIMBACH LLP(B)街道2001 FERRY BUILDING(C)城市SAN FRANCISCO(D)州CA(E)国家美国(F)邮政编码94111(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Microsoft Word(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)代理律师/代理人资料(A)姓名WARD，MICHAEL R.
(B)注册号38,651(C)参考/档案号CGAB-210(ix)电信信息(A)电话(415)433-4150(B)传真(415)433-8716(C)电报N/A(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征(A)长度1617个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO1CGACACTCCT TCCTTCTTCT CACCCGTCCT AGTCCCCTTC AACCCCCCTC TTTGACAAAG 60ACAACAAACC ATGGCTGCTG CTCCCAGTGT GAGGACGTTT ACTCGGGCCG AGGTTTTGAA 120TGCCGAGGCT CTGAATGAGG GCAAGAAGGA TGCCGAGGCA CCCTTCTTGA TGATCATCGA 180CAACAAGGTG TACGATGTCC GCGAGTTCGT CCCTGATCAT CCCGGTGGAA GTGTGATTCT 240CACGCACGTT GGCAAGGACG GCACTGACGT CTTTGACACT TTTCACCCCG AGGCTGCTTG 300GGAGACTCTT GCCAACTTTT ACGTTGGTGA TATTGACGAG AGCGACCGCG ATATCAAGAA 360TGATGACTTT GCGGCCGAGG TCCGCAAGCT GCGTACCTTG TTCCAGTCTC TTGGTTACTA 420CGATTCTTCC AAGGCATACT ACGCCTTCAA GGTCTCGTTC AACCTCTGCA TCTGGGGTTT 480GTCGACGGTC ATTGTGGCCA AGTGGGGCCA GACCTCGACC CTCGCCAACG TGCTCTCGGC 540TGCGCTTTTG GGTCTGTTCT GGCAGCAGTG CGGATGGTTG GCTCACGACT TTTTGCATCA 600CCAGGTCTTC CAGGACCGTT TCTGGGGTGA TCTTTTCGGC GCCTTCTTGG GAGGTGTCTG 660CCAGGGCTTC TCGTCCTCGT GGTGGAAGGA CAAGCACAAC ACTCACCACG CCGCCCCCAA 720CGTCCACGGC GAGGATCCCG ACATTGACAC CCACCCTCTG TTGACCTGGA GTGAGCATGC 780GTTGGAGATG TTCTCGGATG 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NO2的信息(i)序列特征(A)长度457个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Val Leu1 5 10 15Asn Ala Glu Ala Leu Asn Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala Pro Phe20 25 30Leu Met Ile Ile Asp Asn Lys Val Tyr Asp Val Arg Glu Phe Val Pro35 40 45Asp His Pro Gly Gly Ser Val Ile Leu Thr His Val Gly Lys Asp Gly50 55 60Thr Asp Val Phe Asp Thr Phe His Pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu65 70 75 80Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp Ile Asp Glu Ser Asp Arg Asp Ile Lys85 90 95Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln100 105 110Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val115 120 125Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Val Ile Val Ala Lys130 135 140Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu145 150 155 160Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His165 170 175His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe180 185 190Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser 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GCGCCTCC1488(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度399个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Ala Pro Pro Asn Thr Ile Asp Ala Gly Leu Thr Gln Arg His Ile1 5 10 15Ser Thr Ser Ala Pro Asn Ser Ala Lys Pro Ala Phe Glu Arg Asn Tyr20 25 30Gln Leu Pro Glu Phe Thr Ile Lys Glu Ile Arg Glu Cys Ile Pro Ala35 40 45His Cys Phe Glu Arg Ser Gly Leu Arg Gly Leu Cys His Val Ala Ile50 55 60Asp Leu Thr Trp Ala Ser Leu Leu Phe Leu Ala Ala Thr Gln Ile Asp65 70 75 80Lys Phe Glu Asn Pro Leu Ile Arg Tyr Leu Ala Trp Pro Val Tyr Trp85 90 95Ile Met Gln Gly Ile Val Cys Thr Gly Val Trp Val Leu Ala His Glu100 105 110Cys Gly His Gln Ser Phe Ser Thr Ser Lys Thr Leu Asn Asn Thr Val115 120 125Gly Trp Ile Leu His Ser Met Leu Leu Val Pro Tyr His Ser Trp Arg130 135 140Ile Ser His Ser Lys His His Lys Ala Thr Gly His Met Thr Lys Asp145 150 155 160Gln Val Phe Val Pro Lys Thr Arg Ser Gln Val Gly Leu Pro Pro Lys165 170 175Glu Asn Ala Ala Ala Ala Val Gln Glu Glu Asp Met Ser Val His Leu180 185 190Asp Glu Glu Ala Pro Ile Val Thr Leu Phe Trp Met Val Ile Gln Phe195 200 205Leu Phe Gly 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Phe Gln Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp1 5 10 15Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val Ser Phe Asn Leu Cys Ile20 25 30Trp Gly Leu Ser Thr Val Ile Val Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Thr35 40 45Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu Gly Leu Phe Trp Gln Gln50 55 60Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His His Gln Val Phe Gln Asp65 70 75 80Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe Leu Gly Gly Val Cys Gln85 90 95Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys His Asn Thr His His Ala100 105 110Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp Ile Asp Thr His Pro Leu115 120 125Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met Phe Ser Asp Val Pro Asp130 135 140Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe Met Val Leu Asn Gln Thr145 150 155 160Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala Arg Leu Ser Trp Cys Leu165 170 175Gln Ser Ile Leu Phe Val Leu Pro Asn Gly Gln Ala His Lys Pro Ser180 185 190Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu Gln Leu Ser Leu Ala Met195 200 205His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe Leu Phe Ile Lys Asp Pro210 215 220Val Asn Met Leu Val Tyr Phe Leu Val Ser Gln Ala Val Cys Gly Asn225 220 235 240Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His Asn Gly Met Pro Val Ile245 250 255Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe Phe Thr Lys Gln Ile Ile260 265 270Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe Ala Asn Trp Phe Thr Gly275 280 285Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Ser Met Pro Arg290 295 300His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val Glu Thr Leu Cys Lys Lys305 310 315 320Tyr Asn Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met Ile Glu Gly Thr Ala Glu325 330 335Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys Ala Ala Ser Lys Met Gly340 345 350Lys Ala Gln355(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度104个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Val Thr Leu Tyr Thr Leu Ala Phe Val Ala Ala Asn Ser Leu Gly Val1 5 10 15Leu Tyr Gly Val Leu Ala Cys Pro Ser Val Xaa Pro His Gln Ile Ala20 25 30Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu Trp Ile Gln Ser Ala Tyr Ile Gly Xaa35 40 45Asp Ser Gly His Tyr Val Ile Met Ser Asn Lys Ser Asn Asn Xaa Phe50 55 60Ala Gln Leu Leu Ser Gly Asn Cys Leu Thr Gly Ile Ile Ala Trp Trp65 70 75 80Lys Trp Thr His Asn Ala His His Leu Ala Cys Asn Ser Leu Asp Tyr85 90 95Gly Pro Asn Leu Gln His Ile Pro100(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度252个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Gly Val Leu Tyr Gly Val Leu Ala Cys Thr Ser Val Phe Ala His Gln1 5 10 15Ile Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu Leu Trp Ile Gln Ser Ala Tyr Ile20 25 30Gly His Asp Ser Gly His Tyr Val Ile Met Ser Asn Lys Ser Tyr Asn35 40 45Arg Phe Ala Gln Leu Leu Ser Gly Asn Cys Leu Thr Gly Ile Ser Ile50 55 60Ala Trp Trp Lys Trp Thr His Asn Ala His His Leu Ala Cys Asn Ser65 70 75 80Leu Asp Tyr Asp Pro Asp Leu Gln His Ile Pro Val Phe Ala Val Ser85 90 95Thr Lys Phe Phe Ser Ser Leu Thr Ser Arg Phe Tyr Asp Arg Lys Leu100 105 110Thr Phe Gly Pro Val Ala Arg Phe Leu Val Ser Tyr Gln His Phe Thr115 120 125Tyr Tyr Pro Val Asn Cys Phe Gly Arg Ile Asn Leu Phe Ile Gln Thr130 135 140Phe Leu Leu Leu Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Asp Arg Ala Leu Asn145 150 155 160Phe Ala Gly Ile Leu Val Phe Trp Thr Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser165 170 175Cys Leu Pro Asn Trp Pro Glu Arg Phe Phe Phe Val Phe Thr Ser Phe180 185 190Thr Val Thr Ala Leu Gln His Ile Gln Phe Thr Leu Asn His Phe Ala195 200 205Ala Asp Val Tyr Val Gly Pro Pro Thr Gly Ser Asp Trp Phe Glu Lys210 215 220Gln Ala Ala Gly Thr Ile Asp Ile Ser Cys Arg Ser Tyr Met Asp Trp225 230 235 240Phe Phe Gly Gly Leu Gln Phe Gln Leu Glu His His245 250(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度125个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Gly Xaa Xaa Asn Phe Ala Gly Ile Leu Val Phe Trp Thr Trp Phe Pro1 5 10 15Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro Asn Trp Pro Glu Arg Phe Xaa Phe Val20 25 30Phe Thr Gly Phe Thr Val Thr Ala Leu Gln His Ile Gln Phe Thr Leu35 40 45Asn His Phe Ala Ala Asp Val Tyr Val Gly Pro Pro Thr Gly Ser Asp50 55 60Trp Phe Glu Lys Gln Ala Ala Gly Thr Ile Asp Ile Ser Cys Arg Ser65 70 75 80Tyr Met Asp Trp Phe Phe Cys Gly Leu Gln Phe Gln Leu Glu His His85 90 95Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg Cys His Leu Arg Lys Val Ser Pro Val100 105 110Gly Gln Arg Gly Phe Gln Arg Lys Xaa Asn Leu Ser Xaa115 120 125(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度131个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Pro Ala Thr Glu Val Gly Gly Leu Ala Trp Met Ile Thr Phe Tyr Val1 5 10 15Arg Phe Phe Leu Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Leu Lys Ala Phe Leu20 25 30Gly Leu Phe Phe Ile Val Arg Phe Leu Glu Ser Asn Trp Phe Val Trp35 40 45Val Thr Gln Met Asn His Ile Pro Met His Ile Asp His Asp Arg Asn50 55 60Met Asp Trp Val Ser Thr Gln Leu Gln Ala Thr Cys Asn Val His Lys65 70 75 80Ser Ala Phe Asn Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu85 90 95His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Tyr His Xaa Val Ala100 105 110Pro Leu Val Gln Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Ser115 120 125Lys Pro Leu130(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度87个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Cys Ser Pro Lys Ser Ser Pro Thr Arg Asn Met Thr Pro Ser Pro Phe1 5 10 15Ile Asp Trp Leu Trp Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu20 25 30Phe Pro Thr Met Pro Arg Cys Asn Leu Asn Arg Cys Met Lys Tyr Val35 40 45Lys Glu Trp Cys Ala Glu Asn Asn Leu Pro Tyr Leu Val Asp Asp Tyr50 55 60Phe Val Gly Tyr Asn Leu Asn Leu Gln Gln Leu Lys Asn Met Ala Glu65 70 75 80Leu Val Gln Ala Lys Ala Ala85(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征
(A)长度143个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Arg His Glu Ala Ala Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Tyr Met Leu Val1 5 10 15Cys Met Gln Trp Thr Asp Leu Leu Trp Ala Ala Ser Phe Tyr Ser Arg20 25 30Phe Phe Leu Ser Tyr Ser Pro Phe Tyr Gly Ala Thr Gly Thr Leu Leu35 40 45Leu Phe Val Ala Val Arg Val Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Ile50 55 60Thr Gln Met Asn His Ile Pro Lys Glu Ile Gly His Glu Lys His Arg65 70 75 80Asp Trp Ala Ser Ser Gln Leu Ala Ala Thr Cys Asn Val Glu Pro Ser85 90 95Leu Phe Ile Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His100 105 110His Leu Phe Pro Thr Met Thr Arg His Asn Tyr Arg Xaa Val Ala Pro115 120 125Leu Val Lys Ala Phe Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu Val130 135 140(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸
(xi)序列描述SEQ ID NO12CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT 35(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO13CUACUACUAC UAGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG 33(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO14CAUCAUCAUC AUATGATGCT CAAGCTGAAA CTG 33(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO15TACCAACTCG AGAAAATGGC TGCTGCTCCC AGTGTGAGG 39(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO16AACTGATCTA GATTACTGCG CCTTACCCAT CTTGGAGGC 39(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO17TACCAACTCG AGAAAATGGC ACCTCCCAAC ACTATCGAT 39(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征
(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO18AACTGATCTA GATTACTTCT TGAAAAAGAC CACGTCTCC 39(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度746核酸(B)类型核酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO19CGTATGTCAC TCCATTCCAA ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACAC ATTTACGCTC60CACTCCTCTA TGGTATTTAC ACACTCAAAT ATCGTACTCA AGATTGGGAA GCTTTTGTAA 120AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC AAATTTCGAT AAGGCCGCTT 180ACGTCATTGG TAAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT CCTTCCACTC CGTTATCATA 240GCTTTACAGA TTTAATTTGT TATTTCCTCA TTGCTGAATT CGTCTTTGGT TGGTATCTCA 300CAATTAATTT CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA 360GACCAGATGA ACCATCTCAA ATCAATGAAG ATTGGGCAAT CCTTCAACTT AAAACTACTC 420AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG TGGTTCTTTA AATCATCAAG 480TTGTTCATCA TTTATTCCCA TCAATTGCTC AAGATTTCTA CCCACAACTT GTACCAATTG 540TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA CATAACATTA CTTACCACAT TAAACCAAAC TTCACTGAAG 600CTATTATGTC ACACATTAAT TACCTTTACA AAATGGGTAA TGATCCAGAT TATGTTAAAA 660AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA AAACCAATTA TTTACTTTTG 720ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA 746(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度227个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Tyr Val Thr Pro Phe Gln Thr Arg Ser Trp Tyr His Lys Tyr Gln1 5 10 15His Ile Tyr Ala Pro Leu Leu Tyr Gly Ile Tyr Thr Leu Lys Tyr20 25 30Arg Thr Gln Asp Trp Glu Ala Phe Val Lys Asp Gly Lys Asn Gly35 40 45Ala Ile Arg Val Ser Val Ala Thr Asn Phe Asp Lys Ala Ala Tyr50 55 60Val Ile Gly Lys Leu Ser Phe Val Phe Phe Arg Phe Ile Leu Pro65 70 75Leu Arg Tyr His Ser Phe Thr Asp Leu Ile Cys Tyr Phe Leu Ile80 85 90Ala Glu Phe Val Phe Gly Trp Tyr Leu Thr Ile Asn Phe Gln Val95 100 105Ser His Val Ala Glu Asp Leu Lys Phe Phe Ala Thr Pro Glu Arg110 115 120Pro Asp Glu Pro Ser Gln Ile Asn Glu Asp Trp Ala Ile Leu Gln125 130 135Leu Lys Thr Thr Gln Asp Tyr Gly His Gly Ser Leu Leu Cys Thr140 145 150Phe Phe Ser Gly Ser Leu Asn His Gln Val Val His His Leu Phe155 160 165Pro Ser Ile Ala Gln Asp Phe Tyr Pro Gln Leu Val Pro Ile Val170 175 180Lys Glu Val Cys Lys Glu His Asn Ile Thr Tyr His Ile Lys Pro185 190 195Asn Phe Thr Glu Ala Ile Met Ser His Ile Asn Tyr Leu Tyr Lys200 205 210Met Gly Asn Asp Pro Asp Tyr Val Lys Lys Pro Leu Ala Ser Lys215 220 225Asp Asp ***(2)SEQ ID NO 21的信息(i)序列特征(A)长度494核酸(B)类型核酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO21TTTTGGAAGG NTCCAAGTTN ACCACGGANT NGGCAAGTTN ACGGGGCGGA AANCGGTTTT60CCCCCCAAGC CTTTTGTCGA CTGGTTCTGT GGTGGCTTCC AGTACCAAGT CGACCACCAC 120TTATTCCCCA GCCTGCCCCG ACACAATCTG GCCAAGACAC ACGCACTGGT CGAATCGTTC 180TGCAAGGAGT GGGGTGTCCA GTACCACGAA GCCGACCTCG TGGACGGGAC CATGGAAGTC 240TTGCACCATT TGGGCAGCGT GGCCGGCGAA TTCGTCGTGG ATTTTGTACG CGACGGACCC 300GCCATGTAAT CGTCGTTCGT GACGATGCAA GGGTTCACGC ACATCTACAC ACACTCACTC 360ACACAACTAG TGTAACTCGT ATAGAATTCG GTGTCGACCT GGACCTTGTT TGACTGGTTG 420GGGATAGGGT AGGTAGGCGG ACGCGTGGGT CGNCCCCGGG AATTCTGTGA CCGGTACCTG 480GCCCGCGTNA AAGT 494(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度87个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Phe Trp Lys Xxx Pro Ser Xxx Pro Arg Xxx Xxx Gln Val Xxx Gly1 5 10 15Ala Glu Xxx Gly Phe Pro Pro Lys Pro Phe Val Asp Trp Phe Cys20 25 30Gly Gly Phe Gln Tyr Gln Val Asp His His Leu Phe Pro Ser Leu35 40 45Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Thr His Ala Leu Val Glu Ser Phe50 55 60Cys Lys Glu Trp Gly Val Gln Tyr His Glu Ala Asp Leu Val Asp65 70 75Gly Thr Met Glu Val Leu His His Leu Gly Ser Val Ala Gly Glu65 70 75Phe Val Val Asp Phe Val Arg Asp Gly Pro Ala Met80 85(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度520核酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO23GGATGGAGTT CGTCTGGATC GCTGTGCGCT ACGCGACGTG GTTTAAGCGT CATGGGTGCG 60CTTGGGTACA CGCCGGGGCA GTCGTTGGGC ATGTACTTGT GCGCCTTTGG TCTCGGCTGC120ATTTACATTT TTCTGCAGTT CGCCGTAAGT CACACCCATT TGCCCGTGAG CAACCCGGAG18OGATCAGCTGC ATTGGCTCGA GTACGCGCGG ACCACACTGT GAACATCAGC ACCAAGTCGT240GGTTTGTCAC ATGGTGGATG TCGAACCTCA ACTTTCAGAT CGAGCACCAC CTTTTCCCCA300CGGCGCCCCA GTTCCGTTTC AAGGAGATCA GCCCGCGCGT CGAGGCCCTC TTCAAGCGCC360ACGGTCTCCC TTACTACGAC ATGCCCTACA CGAGCGCCGT CTCCACCACC TTTGCCAACC420TCTACTCCGT CGGCCATTCC GTCGGCGACG CCAAGCGCGA CTAGCCTCTT TTCCTAGACC480TTAATTCCCC ACCCCACCCC ATGTTCTGTC TTCCTCCCGC520(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度153个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Glu Phe Val Trp Ile Ala Val Arg Tyr Ala Thr Trp Phe Lys1 5 10 15Arg His Gly Cys Ala Trp Val His Ala Gly Ala Val Val Gly His20 25 30Val Leu Val Arg Leu Trp Ser Arg Leu His Leu His Phe Ser Ala35 40 45Val Arg Arg Lys Ser His Pro Phe Ala Arg Glu Gln Pro Gly Gly50 55 60Ser Ala Ala Leu Ala Arg Val Arg Ala Asp His Thr Val Asn Ile65 70 75Ser Thr Lys Ser Trp Phe Val Thr Trp Trp Met Ser Asn Leu Asn80 85 90Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Ala Pro Gln Phe Arg
95 100 105Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu Phe Lys Arg His110 115 120Gly Leu Pro Tyr Tyr Asp Met Pro Tyr Thr Ser Ala Val Ser Thr125 130 135Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly Asp Ala140 145 150Lys Arg Asp(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度420核酸(B)类型核酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO25ACGCGTCCGC CCACGCGTCC GCCGCGAGCA ACTCATCAAG GAAGGCTACT TTGACCCCTC 60GCTCCCGCAC ATGACGTACC GCGTGGTCGA GATTGTTGTT CTCTTCGTGC TTTCCTTTTG120GCTGATGGGT CAGTCTTCAC CCCTCGCGCT CGCTCTCGGC ATTGTCGTCA GCGGCATCTC180TCAGGGTCGC TGCGGCTGGG TAATGCATGA GATGGGCCAT GGGTCGTTCA CTGGTGTCAT240TTGGCTTGAC GACCGGTTGT GCGAGTTCTT TTACGGCGTT GGTTGTGGCA TGAGCGGTCA300TTACTGGAAA AACCAGCACA GCAAACACCA CGCAGCGCCA AACCGGCTCG AGCACGATGT360AGATCTCAAC ACCTTGCCAT TGGTGGCCTT CAACGAGCGC GTCGTGCGCA AGGTCCGACC420(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度125个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO26Arg Val Arg Pro Arg Val Arg Arg Glu Gln Leu Ile Lys Glu Gly1 5 10 15Tyr Phe Asp Pro Ser Leu Pro His Met Thr Tyr Arg Val Val Glu20 25 30Ile Val Val Leu Phe Val Leu Ser Phe Trp Leu Met Gly Gln Ser35 40 45Ser Pro Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Val Val Ser Gly Ile Ser50 55 60Gln Gly Arg Cys Gly Trp Val Met His Glu Met Gly His Gly Ser65 70 75Phe Thr Gly Val Ile Trp Leu Asp Asp Arg Leu Cys Glu Phe Phe65 70 75Tyr Gly Val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln80 85 90His Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val95 100 105Asp Leu Asn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val110 115 120Arg Lys Val Arg Pro125(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度1219个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(编辑的重叠群2692004)(xi)序列描述SEQ ID NO27GCACGCCGAC CGGCGCCGGG AGATCCTGGC AAAGTATCCA GAGATAAAGT CCTTGATGAA60ACCTGATCCC AATTTGATAT GGATTATAAT TATGATGGTT CTCACCCAGT TGGGTGCATT 120TTACATAGTA AAAGACTTGG ACTGGAAATG GGTCATATTT GGGGCCTATG CGTTTGGCAG 180TTGCATTAAC CACTCAATGA CTCTGGCTAT TCATGAGATT GCCCACAATG CTGCCTTTGG 240CAACTGCAAA GCAATGTGGA ATCGCTGGTT TGGAATGTTT GCTAATCTTC CTATTGGGAT 300TCCATATTCA ATTTCCTTTA AGAGGTATCA CATGGATCAT CATCGGTACC TTGGAGCTGA 360TGGCGTCGAT GTAGATATTC CTACCGATTT TGAGGGCTGG TTCTTCTGTA CCGCTTTCAG 420AAAGTTTATA TGGGTTATTC TTCAGCCTCT CTTTTATGCC TTTCGACCTC TGTTCATCAA 480CCCCAAACCA ATTACGTATC TGGAAGTTAT CAATACCGTG GCACAGGTCA CTTTTGACAT 540TTTAATTTAT TACTTTTTGG GAATTAAATC CTTAGTCTAC ATGTTGGCAG CATCTTTACT 600TGGCCTGGGT TTGCACCCAA TTTCTGGACA TTTTATAGCT GAGCATTACA TGTTCTTAAA 660GGGTCATGAA ACTTACTCAT ATTATGGGCC TCTGAATTTA CTTACCTTCA ATGTGGGTTA 720TCATAATGAA CATCATGATT TCCCCAACAT TCCTGGAAAA AGTCTTCCAC TGGTGAGGAA 780AATAGCAGCT GAATACTATG ACAACCTCCC TCACTACAAT TCCTGGATAA AAGTACTGTA 840TGATTTTGTG ATGGATGATA CAATAAGTCC CTACTCAAGA ATGAAGAGGC ACCAAAAAGG 900AGAGATGGTG CTGGAGTAAA TATCATTAGT GCCAAAGGGA TTCTTCTCCA AAACTTTAGA 960TGATAAAATG GAATTTTTGC ATTATTAAAC TTGAGACCAG TGATGCTCAG AAGCTCCCCT 1020GGCACAATTT CAGAGTAAGA GCTCGGTGAT ACCAAGAAGT GAATCTGGCT TTTAAACAGT 1080CAGCCTGACT CTGTACTGCT CAGTTTCACT CACAGGAAAC TTGTGACTTG TGTATTATCG 1140TCATTGAGGA TGTTTCACTC ATGTCTGTCA TTTTATAAGC ATATCATTTA AAAAGCTTCT 1200AAAAAGCTAT TTCGCCAGG 1219(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度655个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(编辑的重叠群2153526)(xi)序列描述SEQ ID NO28TTACCTTCTA CGTCCGCTTC TTCCTCACTT ATGTGCCACT ATTGGGGCTG AAAGCTTCCT 60GGGCCTTTTC TTCATAGTCA GGTTCCTGGA AAGCAACTGG TTTGTGTGGG TGACACAGAT 120GAACCATATT CCCATGCACA TTGATCATGA CCGGAACATG GACTGGGTTT CCACCCAGCT 180CCAGGCCACA TGCAATGTCC ACAAGTCTGC CTTCAATGAC TGGTTCAGTG GACACCTCAA 240CTTCCAGATT GAGCACCATC TTTTTCCCAC GATGCCTCGA CACAATTACC ACAAAGTGGC 300TCCCCTGGTG CAGTCCTTGT GTGCCAAGCA TGGCATAGAG TACCAGTCCA AGCCCCTGCT 360GTCAGCCTTC GCCGACATCA TCCACTCACT AAAGGAGTCA GGGCAGCTCT GGCTAGATGC 420CTATCTTCAC CAATAACAAC AGCCACCCTG CCCAGTCTGG AAGAAGAGGA GGAAGACTCT 480GGAGCCAAGG CAGAGGGGAG CTTGAGGGAC AATGCCACTA TAGTTTAATA CTCAGAGGGG 540GTTGGGTTTG GGGACATAAA GCCTCTGACT CAAACTCCTC CCTTTTATCT TCTAGCCACA 600GTTCTAAGAC CCAAAGTGGG GGGTGGACAC AGAAGTCCCT AGGAGGGAAG GAGCT 655(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度304个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(编辑的重叠群3506132)(xi)序列描述SEQ ID NO29GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA CGGCCTTTGT CCTTGCTACC 60TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCAACAT GATTATGGCC ACCTGTCTGT CTACAGAAAA 120CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC ACTTAAAGGG TGCCTCTGCC 180AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC CTAACATCTT CCACAAGGAT 240CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT GGCAGCCCAT CGAGTACGGC 300AAGA304(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度918个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(编辑的重叠群3854933)(xi)序列描述SEQ ID NO30CAGGGACCTA CCCCGCGCTA CTTCACCTGG GACGAGGTGG CCCAGCGCTC AGGGTGCGAG60GAGCGGTGGC TAGTGATCGA CCGTAAGGTG TACAACATCA GCGAGTTCAC CCGCCGGCAT 120CCAGGGGGCT CCCGGGTCAT CAGCCACTAC GCCGGGCAGG ATGCCACGGA TCCCTTTGTG 180GCCTTCCACA TCAACAAGGG CCTTGTGAAG AAGTATATGA ACTCTCTCCT GATTGGAGAA 240CTGTCTCCAG AGCAGCCCAG CTTTGAGCCC ACCAAGAATA AAGAGCTGAC AGATGAGTTC 300CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA AGGCCAACCA TGTCTTCTTC 360CTGCTGTACC TGCTGCACAT CTTGCTGCTG GATGGTGCAG CCTGGCTCAC CCTTTGGGTC 420TTTGGGACGT CCTTTTTGCC CTTCCTCCTC TGTGCGGTGC TGCTCAGTGC AGTTCAGGCC 480CAGGCTGGCT GGCTGCAGCA TGACTTTGGG CACCTGTCGG TCTTCAGCAC CTCAAAGTGG 540AACCATCTGC TACATCATTT TGTGATTGGC CACCTGAAGG GGGCCCCCGC CAGTTGGTGG 600AACCACATGC ACTTCCAGCA CCATGCCAAG CCCAACTGCT TCCGCAAAGA CCCAGACATC 660AACATGCATC CCTTCTTCTT TGCCTTGGGG AAGATCCTCT CTGTGGAGCT TGGGAAACAG 720AAGAAAAAAT ATATGCCGTA CAACCACCAG CACARATACT TCTTCCTAAT TGGGCCCCCA 780GCCTTGCTGC CTCTCTACTT CCAGTGGTAT ATTTTCTATT TTGTTATCCA GCGAAAGAAG 840TGGGTGGACT TGGCCTGGAT CAGCAAACAG GAATACGATG AAGCCGGGCT TCCATTGTCC 900ACCGCAAATG CTTCTAAA 918(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度1686个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型其它核酸(编辑的重叠群2511785)(xi)序列描述SEQ ID NO31GCCACTTAAA GGGTGCCTCT GCCAACTGGT GGAATCATCG CCACTTCCAG CACCACGCCA 60AGCCTAACAT CTTCCACAAG GATCCCGATG TGAACATGCT GCACGTGTTT GTTCTGGGCG120AATGGCAGCC CATCGAGTAC GGCAAGAAGA AGCTGAAATA CCTGCCCTAC AATCACCAGC180ACGAATACTT CTTCCTGATT GGGCCGCCGC TGCTCATCCC CATGTATTTC CAGTACCAGA240TCATCATGAC CATGATCGTC CATAAGAACT GGGTGGACCT GGCCTGGGCC GTCAGCTACT300ACATCCGGTT CTTCATCACC TACATCCCTT TCTACGGCAT CCTGGGAGCC CTCCTTTTCC360TCAACTTCAT CAGGTTCCTG GAGAGCCACT GGTTTGTGTG GGTCACACAG ATGAATCACA420TCGTCATGGA GATTGACCAG GAGGCCTACC GTGACTGGTT CAGTAGCCAG CTGACAGCCA480CCTGCAACGT GGAGCAGTCC TTCTTCAACG ACTGGTTCAG TGGACACCTT AACTTCCAGA540TTGAGCACCA CCTCTTCCCC ACCATGCCCC GGCACAACTT ACACAAGATC GCCCCGCTGG600TGAAGTCTCT ATGTGCCAAG CATGGCATTG AATACCAGGA GAAGCCGCTA CTGAGGGCCC660TGCTGGACAT CATCAGGTCC CTGAAGAAGT CTGGGAAGCT GTGGCTGGAC GCCTACCTTC720ACAAATGAAG CCACAGCCCC CGGGACACCG TGGGGAAGGG GTGCAGGTGG GGTGATGGCC780AGAGGAATGA TGGGCTTTTG TTCTGAGGGG TGTCCGAGAG GCTGGTGTAT GCACTGCTCA840CGGACCCCAT GTTGGATCTT TCTCCCTTTC TCCTCTCCTT TTTCTCTTCA CATCTCCCCC900ATAGCACCCT GCCCTCATGG GACCTGCCCT CCCTCAGCCG TCAGCCATCA GCCATGGCCC960TCCCAGTGCC TCCTAGCCCC TTCTTCCAAG GAGCAGAGAG GTGGCCACCG GGGGTGGCTC 1020TGTCCTACCT CCACTCTCTG CCCCTAAAGA TGGGAGGAGA CCAGCGGTCC ATGGGTCTGG 1080CCTGTGAGTC TCCCCTTGCA GCCTGGTCAC TAGGCATCAC CCCCGCTTTG GTTCTTCAGA 1140TGCTCTTGGG GTTCATAGGG GCAGGTCCTA GTCGGGCAGG GCCCCTGACC CTCCCGGCCT 1200GGCTTCACTC TCCCTGACGG CTGCCATTGG TCCACCCTTT CATAGAGAGG CCTGCTTTGT 1260TACAAAGCTC GGGTCTCCCT CCTGCAGCTC GGTTAAGTAC CCGAGGCCTC TCTTAAGATG 1320TCCAGGGCCC CAGGCCCGCG GGCACAGCCA GCCCAAACCT TGGGCCCTGG AAGAGTCCTC 1380CACCCCATCA CTAGAGTGCT CTGACCCTGG GCTTTCACGG GCCCCATTCC ACCGCCTCCC 1440CAACTTGAGC CTGTGACCTT GGGACCAAAG GGGGAGTCCC TCGTCTCTTG TGACTCAGCA 15O0GAGGCAGTGG CCACGTTCAG GGAGGGGCCG GCTGGCCTGG AGGCTCAGCC CACCCTCCAG 1560CTTTTCCTCA GGGTGTCCTG AGGTCCAAGA TTCTGGAGCA ATCTGACCCT TCTCCAAAGG 162OCTCTGTTATC AGCTGGGCAG TGCCAGCCAA TCCCTGGCCA TTTGGCCCCA GGGGACGTGG 1680GCCCTG 1686(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度1843个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(重叠群2535)(xi)序列描述SEQ ID NO32GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA CGGCCTTTGT CCTTGCTACC60TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCAACAT GATTATGGCC ACCTGTCTGT CTACAGAAAA 120CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC ACTTAAAGGG TGCCTCTGCC 180AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC CTAACATCTT CCACAAGGAT 240CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT GGCAGCCCAT CGAGTACGGC 300AAGAAGAAGC TGAAATACCT GCCCTACAAT CACCAGCACG AATACTTCTT CCTGATTGGG 360CCGCCGCTGC TCATCCCCAT GTATTTCCAG TACCAGATCA TCATGACCAT GATCGTCCAT 420AAGAACTGGG TGGACCTGGC CTGGGCCGTC AGCTACTACA TCCGGTTCTT CATCACCTAC 480ATCCCTTTCT ACGGCATCCT GGGAGCCCTC CTTTTCCTCA ACTTCATCAG GTTCCTGGAG 540AGCCACTGGT TTGTGTGGGT CACACAGATG AATCACATCG TCATGGAGAT TGACCAGGAG 600GCCTACCGTG ACTGGTTCAG TAGCCAGCTG ACAGCCACCT GCAACGTGGA GCAGTCCTTC 660TTCAACGACT GGTTCAGTGG ACACCTTAAC TTCCAGATTG AGCACCACCT CTTCCCCACC 720ATGCCCCGGC ACAACTTACA CAAGATCGCC CCGCTGGTGA AGTCTCTATG TGCCAAGCAT 780GGCATTGAAT ACCAGGAGAA GCCGCTACTG AGGGCCCTGC TGGACATCAT CAGGTCCCTG 840AAGAAGTCTG GGAAGCTGTG GCTGGACGCC TACCTTCACA AATGAAGCCA CAGCCCCCGG 900GACACCGTGG GGAAGGGGTG CAGGTGGGGT GATGGCCAGA GGAATGATGG GCTTTTGTTC 960TGAGGGGTGT CCGAGAGGCT GGTGTATGCA CTGCTCACGG ACCCCATGTT GGATCTTTCT 1020CCCTTTCTCC TCTCCTTTTT CTCTTCACAT CTCCCCCATA GCACCCTGCC CTCATGGGAC 1080CTGCCCTCCC TCAGCCGTCA GCCATCAGCC ATGGCCCTCC CAGTGCCTCC TAGCCCCTTC 1140TTCCAAGGAG CAGAGAGGTG GCCACCGGGG GTGGCTCTGT CCTACCTCCA CTCTCTGCCC 1200CTAAAGATGG GAGGAGACCA GCGGTCCATG GGTCTGGCCT GTGAGTCTCC CCTTGCAGCC 1260TGGTCACTAG GCATCACCCC CGCTTTGGTT CTTCAGATGC TCTTGGGGTT CATAGGGGCA 1320GGTCCTAGTC GGGCAGGGCC CCTGACCCTC CCGGCCTGGC TTCACTCTCC CTGACGGCTG 1380CCATTGGTCC ACCCTTTCAT AGAGAGGCCT GCTTTGTTAC AAAGCTCGGG TCTCCCTCCT 1440GCAGCTCGGT TAAGTACCCG AGGCCTCTCT TAAGATGTCC AGGGCCCCAG GCCCGCGGGC 1500ACAGCCAGCC CAAACCTTGG GCCCTGGAAG AGTCCTCCAC CCCATCACTA GAGTGCTCTG 1560ACCCTGGGCT TTCACGGGCC CCATTCCACC GCCTCCCCAA CTTGAGCCTG TGACCTTGGG 1620ACCAAAGGGG GAGTCCCTCG TCTCTTGTGA CTCAGCAGAG GCAGTGGCCA CGTTCAGGGA 1680GGGGCCGGCT GGCCTGGAGG CTCAGCCCAC CCTCCAGCTT TTCCTCAGGG TGTCCTGAGG 1740TCCAAGATTC TGGAGCAATC TGACCCTTCT CCAAAGGCTC TGTTATCAGC TGGGCAGTGC 1800CAGCCAATCC CTGGCCATTT GGCCCCAGGG GACGTGGGCC CTG 1843(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度2257个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(编辑的重叠群253538a)(xi)序列描述SEQ ID NO33CAGGGACCTA CCCCGCGCTA CTTCACCTGG GACGAGGTGG CCCAGCGCTC AGGGTGCGAG60GAGCGGTGGC TAGTGATCGA CCGTAAGGTG TACAACATCA GCGAGTTCAC CCGCCGGCAT 120CCAGGGGGCT CCCGGGTCAT CAGCCACTAC GCCGGGCAGG ATGCCACGGA TCCCTTTGTG 180GCCTTCCACA TCAACAAGGG CCTTGTGAAG AAGTATATGA ACTCTCTCCT GATTGGAGAA 240CTGTCTCCAG AGCAGCCCAG CTTTGAGCCC ACCAAGAATA AAGAGCTGAC AGATGAGTTC 300CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA AGGCCAACCA TGTCTTCTTC 360CTGCTGTACC TGCTGCACAT CTTGCTGCTG GATGGTGCAG CCTGGCTCAC CCTTTGGGTC 420TTTGGGACGT CCTTTTTGCC CTTCCTCCTC TGTGCGGTGC TGCTCAGTGC AGTTCAGCAG 480GCCCAAGCTG GATGGCTGCA ACATGATTAT GGCCACCTGT CTGTCTACAG AAAACCCAAG 540TGGAACCACC TTGTCCACAA ATTCGTCATT GGCCACTTAA AGGGTGCCTC TGCCAACTGG 600TGGAATCATC GCCACTTCCA GCACCACGCC AAGCCTAACA TCTTCCACAA GGATCCCGAT 660GTGAACATGC TGCACGTGTT TGTTCTGGGC GAATGGCAGC CCATCGAGTA CGGCAAGAAG 720AAGCTGAAAT ACCTGCCCTA CAATCACCAG CACGAATACT TCTTCCTGAT TGGGCCGCCG 780CTGCTCATCC CCATGTATTT CCAGTACCAG 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Asp Trp Val Ser Thr Gln Leu50 55 60Gln Ala Thr Cys Asn Val His Lys Ser Ala Phe Asn Asp Trp Phe65 70 75Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr80 85 90Met Pro Arg His Asn Tyr His Lys Val Ala Pro Leu Val Gln Ser95 100 105Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Ser Lys Pro Leu Leu110 115 120Ser Ala Phe Ala Asp Ile Ile His Ser Leu Lys Glu Ser Gly Gln125 130 135Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Gln *** Gln Gln Pro Pro Cys140 145 150Pro Val Trp Lys Lys Arg Arg Lys Thr Leu Glu Pro Arg Gln Arg155 160 165Gly Ala *** Gly Thr Met Pro Leu *** Phe Asn Thr Gln Arg Gly170 175 180Leu Gly Leu Gly Thr *** Ser Leu *** Leu Lys Leu Leu Pro Phe
185 190 195Ile Phe *** Pro Gln Phe *** Asp Pro Lys Trp Gly Val Asp Thr200 205 210Glu Val Pro Arg Arg Glu Gly Ala215(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度86个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型氨基酸(重叠群3506132的翻译)(xi)序列描述SEQ ID NO36Val Phe Tyr Phe Gly Asn Gly Trp Ile Pro Thr Leu Ile Thr Ala1 5 10 15Phe Val Leu Ala Thr Ser Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu Gln His20 25 30Asp Tyr Gly His Leu Ser Val Tyr Arg Lys Pro Lys Trp Asn His35 40 45Leu Val His Lys Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala50 55 60Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gln His His Ala Lys Pro Asn65 70 75Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu Tyr Gly Lys Xxx80 85(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)长度306个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型氨基酸(重叠群3854933的翻译)(xi)序列描述SEQ ID NO37Gln Gly Pro Thr Pro Arg Tyr Phe Thr Trp Asp Glu Val Ala Gln1 5 10 15Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu Val Ile Asp Arg Lys Val20 25 3OTyr Asn Ile Ser Glu Phe Thr Arg Arg His Pro Gly Gly Ser Arg35 40 45Val Ile Ser His Tyr Ala Gly Gln Asp Ala Thr Asp Pro Phe Val50 55 60Ala Phe His Ile Asn Lys Gly Leu Val Lys Lys Tyr Met Asn Ser65 70 75Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gln Pro Ser Phe Glu Pro80 85 90Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe Arg Glu Leu Arg Ala95 100 105Thr Val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His Val Phe Phe110 115 120Leu Leu Tyr Leu Leu His Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp125 130 135Leu Thr Leu Trp Val Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe Leu Leu140 145 150Cys Ala Val Leu Leu Ser Ala Val Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu155 160 165Gln His Asp Phe Gly His Leu Ser Val Phe Ser Thr Ser Lys Trp170 175 180Asn His Leu Leu His His Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala185 190 195Pro Ala Ser Trp Trp Asn His Met His Phe Gln His His Ala Lys200 205 210Pro Asn Cys Phe Arg Lys Asp Pro Asp Ile Asn Met His Pro Phe215 220 225Phe Phe Ala Leu Gly Lys Ile Leu Ser Val Glu Leu Gly Lys Gln230 235 240Lys Lys Lys Tyr Met Pro Tyr Asn His Gln His Xxx Tyr Phe Phe245 250 255Leu Ile Gly Pro Pro Ala Leu Leu Pro Leu Tyr Phe Gln Trp Tyr260 265 270Ile Phe Tyr Phe Val Ile Gln Arg Lys Lys Trp Val Asp Leu Ala275 280 285Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ala Gly Leu Pro Leu Ser290 295 300Thr Ala Asn Ala Ser Lys305(2)SEQ ID NO38的信息
(i)序列特征(A)长度566个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型氨基酸(重叠群2511785的翻译)(xi)序列描述SEQ ID NO38His Leu Lys Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe1 5 10 15Gln His His Ala Lys Pro Asn Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val20 25 30Asn Met Leu His Val Phe Val Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu35 40 45Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gln His50 55 60Glu Tyr Phe Phe Leu Ile Gly Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr65 70 75Phe Gln Tyr Gln Ile Ile Met Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp80 85 90Val Asp Leu Ala Trp Ala Val Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile95 100 105Thr Tyr Ile Pro Phe Tyr Gly Ile Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu110 115 120Asn Phe Ile Arg Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr125 130 135Gln Met Asn His Ile Val Met Glu Ile Asp Gln Glu Ala Tyr Arg140 145 150Asp Trp Phe Ser Ser Gln Leu Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gln155 160 165Ser Phe Phe Asn Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile170 175 180Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu His Lys185 190 195Ile Ala Pro Leu Val Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu200 205 210Tyr Gln Glu Lys Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp Ile Ile Arg215 220 225Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His230 235 240Lys *** Ser His Ser Pro Arg Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg245 250 255Trp Gly Asp Gly Gln Arg Asn Asp Gly Leu Leu Phe *** Gly Val260 265 270Ser Glu Arg Leu Val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp
275 280 285Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His290 295 300Ser Thr Leu Pro Ser Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gln Pro305 310 315Ser Ala Met Ala Leu Pro Val Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gln Gly320 325 330Ala Glu Arg Trp Pro Pro Gly Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser335 340 345Leu Pro Leu Lys Met Gly Gly Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala350 355 360Cys Glu Ser Pro Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly Ile Thr Pro Ala365 370 375Leu Val Leu Gln Met Leu Leu Gly Phe Ile Gly Ala Gly Pro Ser380 385 390Arg Ala Gly Pro Leu Thr Leu Pro Ala Trp Leu His Ser Pro ***400 405 410Arg Leu Pro Leu Val His Pro Phe Ile Glu Arg Pro Ala Leu Leu415 420 425Gln Ser Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly430 435 440Leu Ser *** Asp Val Gln Gly Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser445 450 455Pro Asn Leu Gly Pro Trp Lys Ser Pro Pro Pro His His *** Ser460 465 470Ala Leu Thr Leu Gly Phe His Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro475 480 485Thr *** Ala Cys Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Val Pro Arg Leu490 495 500Leu *** Leu Ser Arg Gly Ser Gly His Val Gln Gly Gly Ala Gly505 510 515Trp Pro Gly Gly Ser Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gln Gly Val520 525 530Leu Arg Ser Lys Ile Leu Glu Gln Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala535 540 545Leu Leu Ser Ala Gly Gln Cys Gln Pro Ile Pro Gly His Leu Ala550 555 560Pro Gly Asp Val Gly Pro Xxx565(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)长度619个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型氨基酸(重叠群2535的翻译)(xi)序列描述SEQ ID NO39Val Phe Tyr Phe Gly Ash Gly Trp Ile Pro Thr Leu Ile Thr Ala1 5 10 15Phe Val Leu Ala Thr Ser Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu Gln His20 25 30Asp Tyr Gly His Leu Ser Val Tyr Arg Lys Pro Lys Trp Asn His35 40 45Leu Val His Lys Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala50 55 60Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gln His His Ala Lys Pro Asn65 70 75Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val Asn Met Leu His Val Phe Val80 85 90Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys95 100 105Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gln His Glu Tyr Phe Phe Leu Ile Gly110 115 120Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr Phe Gln Tyr Gln Ile Ile Met125 130 135Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp Val Asp Leu Ala Trp Ala Val140 145 150Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile Thr Tyr Ile Pro Phe Tyr Gly155 160 165Ile Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu Asn Phe Ile Arg Phe Leu Glu170 175 180Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr Gln Met Asn His Ile Val Met185 190 195Glu Ile Asp Gln Glu Ala Tyr Arg Asp Trp Phe Ser Ser Gln Leu200 205 210Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gln Ser Phe Phe Asn Asp Trp Phe215 220 225Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr230 235 240Met Pro Arg His Asn Leu His Lys Ile Ala Pro Leu Val Lys Ser245 250 255Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Glu Lys Pro Leu Leu260 265 270Arg Ala Leu Leu Asp Ile Ile Arg Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys275 280 285Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys *** Ser His Ser Pro Arg290 295 300Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly Gln Arg Asn
305 310 315Asp Gly Leu Leu Phe *** Gly Val Ser Glu Arg Leu Val Tyr Ala320 325 330Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser335 340 345Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His Ser Thr Leu Pro Ser Trp Asp350 355 360Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gln Pro Ser Ala Met Ala Leu Pro Val365 370 375Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gln Gly Ala Glu Arg Trp Pro Pro Gly380 385 390Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu Pro Leu Lys Met Gly Gly400 405 410Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser Pro Leu Ala Ala415 420 425Trp Ser Leu Gly Ile Thr Pro Ala Leu Val Leu Gln Met Leu Leu430 435 440Gly Phe Ile Gly Ala Gly Pro Ser Arg Ala Gly Pro Leu Thr Leu445 450 455Pro Ala Trp Leu His Ser Pro *** Arg Leu Pro Leu Val His Pro460 465 470Phe Ile Glu Arg Pro Ala Leu Leu Gln Ser Ser Gly Leu Pro Pro475 480 485Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser *** Asp Val Gln Gly490 495 500Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Lys505 510 515Ser Pro Pro Pro His His *** Ser Ala Leu Thr Leu Gly Phe His520 525 530Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro Thr *** Ala Cys Asp Leu Gly535 540 545Thr Lys Gly Gly Val Pro Arg Leu Leu *** Leu Ser Arg Gly Ser550 555 560Gly His Val Gln Gly Gly Ala Gly Trp Pro Gly Gly Ser Ala His565 570 575Pro Pro Ala Phe Pro Gln Gly Val Leu Arg Ser Lys Ile Leu Glu580 585 590Gln Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala Gly Gln Cys595 600 605Gln Pro Ile Pro Gly His Leu Ala Pro Gly Asp Val Gly Pro Xxx610 615 620(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)长度757个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型氨基酸(重叠群253538a的翻译)(xi)序列描述SEQ ID NO40Gln Gly Pro Thr Pro Arg Tyr Phe Thr Trp Asp Glu Val Ala Gln1 5 10 15Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu Val Ile Asp Arg Lys Val20 25 30Tyr Asn Ile Ser Glu Phe Thr Arg Arg His Pro Gly Gly Ser Arg35 40 45Val Ile Ser His Tyr Ala Gly Gln Asp Ala Thr Asp Pro Phe Val50 55 60Ala Phe His Ile Asn Lys Gly Leu Val Lys Lys Tyr Met Asn Ser65 70 75Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gln Pro Ser Phe Glu Pro80 85 90Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe Arg Glu Leu Arg Ala95 100 105Thr Val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His Val Phe Phe110 115 120Leu Leu Tyr Leu Leu His Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp125 130 135Leu Thr Leu Trp Val Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe Leu Leu140 145 150Cys Ala Val Leu Leu Ser Ala Val Gln Gln Ala Gln Ala Gly Trp155 160 165Leu Gln His Asp Tyr Gly His Leu Ser Val Tyr Arg Lys Pro Lys170 175 180Trp Asn His Leu Val His Lys Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly185 190 195Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gln His His Ala200 205 210Lys Pro Asn Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val Asn Met Leu His215 220 225Val Phe Val Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu Tyr Gly Lys Lys230 235 240Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gln His Glu Tyr Phe Phe245 250 255Leu Ile Gly Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr Phe Gln Tyr Gln260 265 270Ile Ile Met Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp Val Asp Leu Ala275 280 285Trp Ala Val Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile Thr Tyr Ile Pro
290 295 300Phe Tyr Gly Ile Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu Asn Phe Ile Arg305 310 315Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr Gln Met Asn His320 325 330Ile Val Met Glu Ile Asp Gln Glu Ala Tyr Arg Asp Trp Phe Ser335 340 345Ser Gln Leu Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gln Ser Phe Phe Asn350 355 360Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu365 370 375Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu His Lys Ile Ala Pro Leu380 385 390Val Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Glu Lys400 405 410Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp Ile Ile Arg Ser Leu Lys Lys415 420 425Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys *** Ser His430 435 440Ser Pro Arg Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly445 450 455Gln Arg Asn Asp Gly Leu Leu Phe *** Gly Val Ser Glu Arg Leu460 465 470Val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp Leu Ser Pro Phe475 480 485Leu Leu Ser Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His Ser Thr Leu Pro490 495 500Ser Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gln Pro Ser Ala Met Ala505 510 515Leu Pro Val Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gln Gly Ala Glu Arg Trp520 525 530Pro Pro Gly Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu Pro Leu Lys535 540 545Met Gly Gly Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser Pro550 555 560Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly Ile Thr Pro Ala Leu Val Leu Gln565 570 575Met Leu Leu Gly Phe Ile Gly Ala Gly Pro Ser Arg Ala Gly Pro580 585 590Leu Thr Leu Pro Ala Trp Leu His Ser Pro *** Arg Leu Pro Leu595 600 605Val His Pro Phe Ile Glu Arg Pro Ala Leu Leu Gln Ser Ser Gly610 615 620Leu Pro Pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser *** Asp625 630 635Val Gln Gly Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser Pro Ash Leu Gly640 645 650Pro Trp Lys Ser Pro Pro Pro His His *** Ser Ala Leu Thr Leu
655 660 665Gly Phe His Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro Thr *** Ala Cys670 675 680Asp Leu Gly Thr Lys GIy Gly Val Pro Arg Leu Leu *** Leu Ser685 690 695Arg Gly Ser Gly His Val Gln Gly Gly Ala Gly Trp Pro Gly Gly700 705 710Ser Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gln Gly Val Leu Arg Ser Lys715 720 725Ile Leu Glu Gln Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala730 735 740Gly Gln Cys Gln Pro Ile Pro Gly His Leu Ala Pro Gly Asp Val745 750 755Gly Pro Xxx
权利要求
1.分离的核酸，它包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中描述的核苷酸序列。
2.按照权利要求1的核苷酸序列编码的多肽。
3.纯化或分离的多肽，它包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中描述的氨基酸序列。
4.分离的核酸，它编码其氨基酸序列描述于SEO ID NO2或SEO ID NO4的多肽。
5.分离的核酸，它包含的核苷酸序列编码一种多肽，所述多肽于距所述多肽羧基端的碳6或碳12位将脂肪酸分子去饱和，其中所述核苷酸序列的平均A/T含量低于大约60％。
6.按照权利要求5的分离的核酸，其中所述核酸得自真菌。
7.按照权利要求6的分离的核酸，其中所述真菌为被孢霉属。
8.按照权利要求7的分离的核酸，其中所述真菌为高山被孢霉菌种。
9.分离的核酸，其中所述核酸的核苷酸序列描述于SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中。
10.分离的或纯化的多肽，所述多肽于距所述多肽羧基端的碳6或碳12位将脂肪酸分子去饱和，其中所述多肽为真核多肽，或得自真核多肽。
11.按照权利要求10的分离的或纯化的真核多肽，其中所述真核多肽得自真菌。
12.核酸，它包含一种真菌核苷酸序列，它与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中的至少50个核苷酸的序列大致相同，或与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中的至少50个核苷酸的序列互补。
13.分离的核酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的同源性至少约为50％。
14.分离的核酸，其核苷酸序列与编码SEQ ID NO2或SEQ IDNO4中所述的氨基酸序列的序列至少约50％同源。
15.权利要求14的核酸，其中SEQ ID NO2中描述的所述氨基酸序列选自氨基酸残基50-53、39-43、172-176、204-213和390-402。
16.核酸构成物，它包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中描述的核苷酸序列，所述序列与一种异源序列连接。
17.核酸构成物，它包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中描述的核苷酸序列，所述序列与在微生物细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接。
18.按照权利要求17的核酸构成物，其中所述微生物细胞为酵母细胞。
19.按照权利要求17的核酸构成物，其中所述核苷酸序列得自真菌。
20.按照权利要求19的核酸构成物，其中，所述真菌为被孢霉属。
21.按照权利要求20的核酸构成物，其中，所述真菌为高山被孢霉菌种。
22.核酸构成物，它包含一种真菌核苷酸序列，它编码的多肽包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中描述的氨基酸序列，或与其互补，其中所述核酸与在微生物细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接，其中所述核苷酸序列编码功能活性的多肽，所述多肽于距脂肪酸分子羧基端的碳6或碳12位将脂肪酸分子去饱和。
23.核酸构成物，它包含A/T含量低于大约60％的核苷酸序列，所述序列编码功能活性的Δ6-去饱和酶，所述酶的氨基酸序列对应于SEQ ID NO2中描述的全部或部分氨基酸序列，或与其互补，其中所述核苷酸序列与在酵母细胞中发挥作用的转录控制序列操作性地连接。
24.核酸构成物，它包含编码功能活性的Δ12-去饱和酶的真菌核苷酸序列，所述去饱和酶的氨基酸序列对应于SEQ ID NO4中描述的全部或部分氨基酸序列，或与其互补，其中所述核苷酸序列与在酵母中发挥作用的转录控制序列操作性地连接。
25.重组酵母细胞，它包含按照权利要求23或权利要求24的核酸构成物。
26.按照权利要求25的重组酵母细胞，其中所述酵母细胞为酵母属细胞。
27.重组酵母细胞，它包含至少一个拷贝的载体，所述载体包含编码多肽的真菌核苷酸序列，所述多肽将18∶2脂肪酸转化为18∶3脂肪酸或将18∶3脂肪酸转化为18∶4脂肪酸，其中所述酵母细胞或所述酵母细胞的祖先用所述载体转化，以产生所述重组酵母细胞，并且其中所述核苷酸序列与在所述重组酵母细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接。
28.按照权利要求27的重组酵母细胞，其中所述真菌核苷酸序列为被孢霉属核苷酸序列。
29.按照权利要求28的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞为酵母属细胞。
30.按照权利要求27的微生物细胞，其中所述表达控制序列在所述表达载体中提供。
31.在酵母培养物中生产GLA的方法，所述方法包括在一定条件下，培养具有许多重组酵母细胞的酵母培养物，其中所述酵母细胞或所述酵母细胞的祖先用包含真菌DNA的载体转化，所述DNA编码的多肽将LA转化为GLA，其中所述DNA与在所述酵母细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接，由此表达所述DNA，由此在所述酵母培养物中由LA生产GLA。
32.按照权利要求31的方法，其中所述真菌DNA为被孢霉属DNA，而所述多肽为Δ6去饱和酶。
33.按照权利要求32的方法，其中被孢霉属为高山被孢霉菌种。
34.按照权利要求31的方法，其中所述LA由外部供应。
35.按照权利要求31的方法，其中所述条件为可诱导的。
36.在酵母培养物中生产硬脂四烯酸的方法，所述方法包括在一定条件下，培养具有许多重组酵母细胞的酵母培养物，其中所述酵母细胞或所述酵母细胞的祖先用包含真菌DNA的载体转化，所述DNA编码的多肽将α-亚麻酸转化为硬脂四烯酸，其中所述DNA与在所述酵母细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接，由此表达所述DNA，由此在所述酵母培养物中由α-亚麻酸生产硬脂四烯酸。
37.按照权利要求36的方法，其中所述真菌DNA为被孢霉属DNA，而所述多肽为Δ6去饱和酶。
38.按照权利要求37的方法，其中被孢霉属为高山被孢霉菌种。
39.按照权利要求36的方法，其中所述α-亚麻酸由外部供应。
40.按照权利要求36的方法，其中所述条件为可诱导的。
41.在酵母培养物中生产亚油酸的方法，所述方法包括在一定条件下，培养具有许多重组酵母细胞的酵母培养物，其中所述酵母细胞或所述酵母细胞的祖先用包含真菌DNA的载体转化，所述DNA编码的多肽将油酸转化为亚油酸，其中所述DNA与在所述酵母细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接，由此表达所述DNA，由此在所述酵母培养物中由油酸生产亚油酸。
42.按照权利要求41的方法，其中所述真菌DNA为被孢霉属DNA，而所述多肽为Δ12去饱和酶。
43.按照权利要求42的方法，其中被孢霉属为高山被孢霉菌种。
44.按照权利要求41的方法，其中所述条件为可诱导的。
45.分离或纯化的多肽，它于所述多肽羧基端的碳12位将脂肪酸分子去饱和，其中所述多肽为真菌多肽，或得自真菌多肽。
46.按照权利要求46的分离或纯化的多肽，其中所述多肽为高山被孢霉的Δ12去饱和酶。
47.分离或纯化的多肽，它于所述多肽羧基端的碳6位将脂肪酸分子去饱和，其中所述多肽为真菌多肽，或得自真菌多肽。
48.按照权利要求48的分离或纯化的多肽，其中所述多肽为Δ6去饱和酶。
49.编码按照权利要求47或权利要求49的多肽的分离的核酸。
50.按照权利要求23的核酸构成物，其中于SEQ.ID.NO2中描述的氨基酸序列的所述部分包括氨基酸1-457。
51.宿主细胞，它包含按照权利要求22-24中任一项的核酸构成物。
52.宿主细胞，它包含包含核酸的载体，所述核酸编码得自高山被孢霉的脂肪酸去饱和酶，其中所述去饱和酶的氨基酸序列由SEQ ID NO2描述，并且其中所述核苷酸序列与一个启动子操作性地连接。
53.按照权利要求52的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核细胞。
54.按照权利要求53的宿主细胞，其中所述真核细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、鸟类细胞和藻类细胞。
55.按照权利要求54的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真菌细胞。
56.权利要求21的宿主细胞，其中所述启动子由外部供应给所述宿主细胞。
57.在真核细胞培养物中生产硬脂四烯酸的方法，所述方法包括在一定条件下，培养具有许多重组真核细胞的真核细胞培养物，其中所述重组真核细胞或所述重组真核细胞的祖先用包含真菌DNA的载体转化，所述DNA编码的多肽将α-亚麻酸转化为硬脂四烯酸，其中所述DNA与在所述重组真核细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接，由此表达所述DNA，由此在所述真核细胞培养物中由α-亚麻酸生产硬脂四烯酸。
58.在真核细胞培养物中生产亚油酸的方法，所述方法包括在一定条件下，培养具有许多重组真核细胞的真核细胞培养物，其中所述重组真核细胞或所述重组真核细胞的祖先用包含真菌DNA的载体转化，所述DNA编码的多肽将油酸转化为亚油酸，其中所述DNA与在所述重组真核细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接，由此表达所述DNA，由此在所述真核细胞培养物中由油酸生产亚油酸。
59.按照权利要求57或权利要求58的方法，其中所述真核细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、鸟类细胞和藻类细胞。
60.按照权利要求59的方法，其中所述真菌细胞为酵母属的酵母细胞。
61.重组酵母细胞，它包含(1)按照权利要求23或24的至少一种核酸构成物；或(2)至少一种按照权利要求23的核酸构成物和至少一种按照权利要求24的核酸构成物。
62.重组酵母细胞，它包含至少一种核酸构成物，它包含的核苷酸序列编码功能活性的Δ6去饱和酶，所述去饱和酶的氨基酸序列对应于SEQ ID NO2中描述的全部或部分氨基酸序列，或与其互补；和至少一种核酸构成物，它包含的核苷酸序列编码功能活性的Δ12去饱和酶，所述去饱和酶的氨基酸序列对应于SEQ ID NO4中描述的全部或部分氨基酸序列，或与其互补，其中所述核酸构成物与在酵母细胞中发挥作用的转录控制序列操作性地连接。
63.制备GLA的方法，所述方法包括在一定条件下培养按照权利要求62的重组酵母细胞，由此表达所述核苷酸序列，由此在所述酵母细胞中生产GLA。
64.生产GLA的方法，所述方法包括在一定条件下培养按照权利要求61的重组酵母细胞，由此表达所述核酸构成物中的核苷酸序列，由此在所述酵母细胞中生产GLA。
65.得到改变的长链多不饱和脂肪酸生物合成的方法，包括以下步骤在一定条件下，培育其细胞含有一种或多种得自真菌或藻类的转基因的植物，所述转基因编码的转基因表达产物于选自脂肪酸分子羧基端的碳6和碳12位的碳上，将所述脂肪酸分子去饱和，其中所述一种或多种转基因与一种表达控制序列操作性地连接，由此表达所述一种或多种转基因，由此改变所述细胞中长链多不饱和脂肪酸的生物合成。
66.按照权利要求65的方法，其中所述长链多不饱和脂肪酸选自18∶1ω9、LA、GLA、SDA和ALA。
67.按照权利要求65的方法生产的微生物油或其部分。
68.治疗或预防营养不良的方法，包括给予需要所述治疗或预防的患者足够量的权利要求67的所述微生物油，以实现所述治疗或预防。
69.药用组合物，包含权利要求67的所述微生物油或其部分和药用可接受的载体。
70.权利要求69的药用组合物，其中所述药用组合物为固体或液体形式。
71.权利要求70的药用组合物，其中所述药用组合物为胶囊或片剂形式。
72.权利要求69的药用组合物，还包含至少一种选自以下的营养物维生素、矿物质、碳水化合物、糖、氨基酸、游离脂肪酸、磷脂、抗氧化剂和酚类化合物。
73.营养配制食品，包含权利要求67的所述微生物油或其部分。
74.权利要求73的营养配制食品，其中所述营养配制食品选自婴儿配制食品、食物增补剂和食物替代品。
75.权利要求74营养配制食品，其中所述婴儿配制食品、食物增补剂和食物替代品为固体或液体形式。
76.婴儿配制食品，包含权利要求67的所述微生物油或其部分。
77.权利要求76的婴儿配制食品，还包含至少一种选自以下的常量营养物椰子油、豆油、Canola油、甘油一酯和甘油二酯、葡萄糖、食用乳糖、电透析乳清、电透析脱脂乳、乳清、大豆蛋白和其它蛋白水解物。
78.权利要求77的婴儿配制食品，还包括至少一种维生素，选自维生素A、C、D、E和复合维生素B；和至少一种矿物质，选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁。
79.食物增补剂，包含权利要求67的所述微生物油或其部分。
80.权利要求79的食物增补剂，还包含至少一种选自以下的常量营养物椰子油、豆油、Canola油、甘油一酯和甘油二酯、萄萄糖、食用乳糖、电透析乳清、电透析脱脂乳、乳清、大豆蛋白和其它蛋白水解物。
81.权利要求80的食物增补剂，还包括至少一种维生素，选自维生素A、C、D、E和复合维生素B；和至少一种矿物质，选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁。
82.权利要求79或权利要求81的食物增补剂，其中将所述食物增补剂给予人类或动物。
83.食物替代品，包含权利要求67的所述微生物油或其部分。
84.权利要求83的食物替代品，还包含至少一种选自以下的常量营养物椰子油、豆油、Canola油、甘油一酯和甘油二酯、葡萄糖、食用乳糖、电透析乳清、电透析脱脂乳、乳清、大豆蛋白和其它蛋白水解物。
85.权利要求84的食物替代品，还包括至少一种维生素，选自维生素A、C、D、E和复合维生素B；和至少一种矿物质，选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁。
86.权利要求83或权利要求85的食物替代品，其中将所述食物替代品给予人类或动物。
87.患有由多不饱和脂肪酸摄入不足或产生不足的患者的治疗方法，它包括给予所述患者权利要求83的所述食物替代品或权利要求79的所述食物增补剂，其给予量足以实现所述治疗。
88.权利要求87的方法，其中将所述食物替代品或所述食物增补剂经肠道或胃肠外给予。
89.化妆品，包含权利要求67的所述微生物油或其部分。
90.权利要求88的化妆品，其中局部使用所述化妆品。
91.权利要求69的药用组合物，其中将药用组合物给予人类或动物。
92.动物饲料，包含权利要求67的所述微生物油或其部分。
93.权利要求20的方法，其中所述真菌为被孢霉属菌种。
94.权利要求93的方法，其中所述真菌为高山被孢霉。
95.选自SEQ ID NO34-SEQ ID NO40的一段分离的肽序列。
96.选自以下的分离的一段肽序列SEQ ID NO20、SEQ IDNO22、SEQ ID NO25和SEQ ID NO26。
97.在真核细胞培养物中生产γ-亚麻酸的方法，所述方法包括在一定条件下，培养具有许多重组真核细胞的真核细胞培养物，其中所述重组真核细胞或所述重组真核细胞的祖先用包含真菌DNA的载体转化，所述DNA编码的多肽将亚油酸转化为γ-亚麻酸，其中所述DNA与在所述重组真核细胞中发挥作用的表达控制序列操作性地连接，由此表达所述DNA，由此在所述真核细胞培养物中由亚油酸生产γ-亚麻酸。
98.按照权利要求97的方法，其中所述真核细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、鸟类细胞和藻类细胞。
全文摘要
本发明涉及脂肪酸去饱和酶,所述酶能够催化将油酸转化为亚油酸、将亚油酸转化为γ－亚麻酸,或将α－亚麻酸转化为硬脂四烯酸。描述了编码去饱和酶的核酸序列、与其杂交的核酸序列、包含去饱和酶基因的DNA构成物以及去饱和酶表达水平提高的重组宿主微生物或动物。公开了将脂肪酸去饱和的方法和通过表达提高水平的去饱和酶生产去饱和的脂肪酸的方法。提供了已经用重组宿主微生物或动物产生的去饱和酶去饱和的脂肪酸和含有这些脂肪酸的油。也描述了含有脂肪酸的药用组合物、婴儿配制食品或食物增补剂。其中所述脂肪酸已经用重组宿主微生物或动物产生的去饱和酶去饱和。
文档编号A61K8/36GK1252099SQ98803940
公开日2000年5月3日 申请日期1998年4月10日 优先权日1997年4月11日
发明者D·克努特宗, P·穆克尔吉, Y·S·黄, J·图尔蒙德, S·乔德哈赖, A·E·Y·勒安纳德 申请人:加利福尼亚基因公司, 艾博特公司