无前导序列蛋白输出的抑制剂的制作方法

专利名称：无前导序列蛋白输出的抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及无前导序列蛋白输出的抑制剂，并且更具体地，涉及鉴定抑制无前导序列蛋白向细胞外空间输出的化合物的方法。
背景技术：
许多蛋白通过与细胞表面受体结合而介导的信号传导，对细胞生长，分化和炎症发挥作用。然而其它一些蛋白，如起动或者在血凝块形成中的必需因子，在血液中是酶促发挥作用。尽管这些作用一般是正常过程的一部分，在某些情况下，最好对这些蛋白的作用和随后的信号的效应加以限制或抑制。例如，由一种生长因子如作用于黑素瘤细胞的bFGF促进的肿瘤生长是有害的，并经常导致死亡。
抑制特定的蛋白的方法主要集中于干扰蛋白-底物或蛋白-受体的相互作用。典型地，这需要应用竞争性结合蛋白的抗体或其它分子，通过应用用于受体结合的竞争剂或对蛋白的蛋白酶消化。一种替代的方法，不是一般采用的，是通过抑制蛋白在转录或翻译水平上的表达来降低其水平。由于抑制一种或几种蛋白的特定表达的固有问题，抑制蛋白的转录和翻译降低蛋白水平的方法难以实现。
某些蛋白，如生长因子，炎症介质，血液凝固介质通过非经典分泌途径输出的发现使这些蛋白的特异性抑制剂得以发展。这些蛋白由于它们缺少调节通过经典高尔基/内质网途径的分泌的疏水前导序列而得以鉴定。
本发明提供这些无前导序列蛋白输出的抑制剂，以控制不希望的增生和炎症，以及其它相关的优点。
发明概述本发明一般提供抑制从表达蛋白的细胞输出无前导序列蛋白的方法。一方面，提供的用于抑制来自细胞的无前导序列蛋白输出的方法包括，用有效量的、抑制无前导序列蛋白和转运分子结合的抑制剂作用于输出无前导序列蛋白的细胞。某些具体的实施方案中，无前导序列蛋白是FGF-1，FGF-2，IL-1α，IL-1β，CNTF或HIV-tat。其它优选的实施方案中，转运分子是Na+/K+ATP酶，Na+/K+ATP酶α亚单位或含N+/K+ATP酶α亚单位的复合物。其它更优选的实施方案中，转运分子选自离子通道Ca2+ATP酶，H+/K+ATP酶，Na+通道，Cl-通道和K+通道。
另一方面，提供了用于抑制细胞FGF-2输出的方法，包括将有效量的，抑制FGF-2和转运分子结合的抑制剂作用于输出FGF-2的细胞，因此抑制FGF-2的输出。优选的实施方案中，转运分子是Na+/K+ATP酶，Na+/K+ATP酶α亚单位或含有Na+/K+ATP酶α亚单位的复合物。
又一方面，提供了细胞的无前导序列蛋白输出的抑制剂。抑制剂应(a)抑制无前导序列蛋白的输出；(b)不抑制含无前导序列蛋白的分泌；和(c)抑制无前导序列蛋白与转运分子之间的结合。
相关的方面中，提供了治疗血管发生和再狭窄的方法。这些方法中，用治疗有效量的无前导序列蛋白的抑制剂作用于上皮细胞或平滑肌细胞。
另外，提供了检测无前导序列蛋白的方法，包括(a)转染或转化低多重性表达cDNA融合蛋白的cDNA表达文库进入宿主细胞；(b)检测细胞上清液中cDNA融合蛋白；和(c)确定此cDNA是无前导序列蛋白。优选的实施方案中，cDNA融合蛋白与报告分子或标签序列融合。
还提供了用于检测无前导序列蛋白转运分子的方法，包括(a)将细胞提取液或含有转运分子的细胞膜与无前导序列的融合蛋白和标签相互作用以形成与转运分子相结合的融合蛋白复合物；(b)分离复合物；和(c)检测复合物中的转运分子。优选的实施方案中，标签是谷胱苷肽-S-转移酶或其与谷胱苷肽结合的片段。
参考随后详细的描述和附图，本发明的这些或其它方面将变得明确。下面所述的是对某些步骤或组合物(如质粒)更详细的描述的多种参考。所有这些参考根据其完整性合并在一起。
附图简述和序列列表

图1表示强心甙对FGF-2输出的抑制作用的4种形式。A.Na+/K+ATP酶是FGF-2质膜转位装置(PMTA/输出者)的一种成分；B.对于其它用于FGF-2输出的蛋白功能上需要由Na+/K+ATP酶形成的跨膜电位梯度；C.强心甙与用于FGF-2输出的一种未鉴定蛋白的相互作用；D.强心甙和与质膜转位装置的另外一种成分相互作用的Na+/K+ATP酶的相互作用。
图2是SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳的免疫沉淀的放射自显影图。A.表达FGF-2和Na+/K+ATP酶的质粒共转染之后不同时间的带有抗FGF-2抗体的细胞(C)和培养液(M)的免疫沉淀组分。(S)含分子量标准。双箭头所指的是大鼠Na+/K+ATP酶α1亚单位大小的110KDa的蛋白、B，FGF-2质粒单独转染后的免疫沉淀。
图3是SDS-PAGE上电泳的免疫沉淀的放射自显影图。A，表达FGF-2和Na+/K+ATP酶的质粒共转染之后的带有抗FGF-2抗体的细胞(C)和培养基组分不同时间的免疫沉淀；培养液中含1mM乌本苷，箭头所指的是大鼠Na+/K+ATP酶α1亚单位大小的110KDa蛋白。B，共转染和含有或不含有乌本苷培养之后的免疫沉淀。
图4是转染进入COS细胞中之后，用抗Na+/K+ATP酶α1抗体免疫沉淀的放射自显影图。预部的表表示转染的基因。
图5是非转染的(泳道1)和PCMV/乌本苷转染的细胞的总COS细胞提取物的Western印迹杂交。图在所用的抗体是抗Na+/K+ATP酶α1抗体，图右所用的抗体是抗Na+/K+ATP酶β1抗体。
图6是用抗Na+/K+ATP酶或者抗hCG抗体的免疫沉淀的放射自显影图。顶部的表表示转染的基因。
图7是COS细胞转染之后，用抗FGF-2免疫血清免疫沉淀的放射自显影图。顶部的表表示转染的基因。标记“S”的泳道含分子量标准。FPT是FGF-2和新霉素磷酸转移酶之间的嵌含体。
图8是COS细胞转染之后用抗新霉素磷酸转移酶抗体免疫沉淀的放射自显影图。顶部的表表示转染的基因。标记有“S”的泳道含分子量标准。FPT是FGF-2和新霉素磷酸转移酶的嵌合体。
图9是COS细胞转染之后用抗Na+/K+ATP酶抗体免疫沉淀的放射自显影图。顶部的表表示转染的基因。标记“S”的泳道含分子量标准。FPT是FGF-2和新霉素磷酸转移酶的嵌合体。
图10是COS细胞转染之后用抗Na+/K+ATP酶抗体或抗FGF-2抗体免疫沉淀的放射自显影图。顶部的表表示转染的基因。FVS是疱疹性口腔炎病毒跨膜区和FGF-2的嵌合体。
图11是COS细胞转染之后用抗FGF-2抗体免疫沉淀的放射自显影图。顶部的表表示转染的基因。FVS是疱疹性口腔炎病毒跨膜区和FGF-2的嵌合体。
图12是用编码IL-1的质粒转染COS细胞之后，用抗IL-1抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图13是用表达FGF2和大鼠Na+/K+ATP酶α2亚单位的质粒转染COS细胞之后，用抗FGF2抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图14是用表达FGF2和大鼠Na+/K+ATP酶α3亚单位的质粒转染COS细胞之后，用抗FGF2抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图15是用表达FGF2和大鼠α2亚单位或FGF2和大鼠α3亚单位的质粒转染COS细胞之后用抗FGF2抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图16是用表达FGF2和大鼠α2亚单位或FGF2和大鼠α3亚单位的质粒转染COS细胞之后用抗α2或抗-α3亚单位抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图17是用表达IL-1的质粒转染COS细胞之后用抗IL-1抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图18是用表达IL-1的质粒转染COS细胞和乌本苷处理之后用抗IL-1抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图19是用表达IL-1的质粒转染COS细胞之后用抗IL-1抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图20是用表达IL-1的质粒转染COS细胞和乌本苷处理之后用抗IL-1抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图21是用表达IL-1的质粒转染COS细胞和用或者没用乌苯苷处理之后，用抗IL-1抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图22是与FGF-2/GST嵌合蛋白(GST-FGF)结合的代谢法标记的COS细胞蛋白的放射自显影图。GST-4T是谷胱苷肽，珠没有任何GST基本蛋白。
图23是用表达VSV N蛋白的质粒转染COS细胞之后用抗-VSV抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图24是用表达VSV N蛋白转染COS细胞和乌本苷处理之后用抗VSV抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图25是用表达VSV N蛋白的质粒转染COS细胞和用2-脱氧葡萄糖及NaN3处理之后，用抗-VSV抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图26是用表达VSV N蛋白的质粒转染COS细胞并用布雷菲尔德菌素A处理之后，用抗VSV抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图27是用表达VSV N蛋白和FGF2的质粒转染COS细胞之后用抗-FGF2抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图28是用表达VSV N蛋白和FGF-2的转染COS细胞及乌本苷处理之后，用抗FGF2抗体免疫沉淀的放射自显影图。
图29A-29C提供了作为FGF-2输出抑制剂的小分子结构。
SEQ ID NO1是FGF-2的cDNA序列。
SEQ ID NO2是FGF-2 18KD型的cDNA序列SEQ ID NO3是FGF-2 18KD型的氨基酸序列。
SEQ ID NO4是hCG的cDNA序列。
SEQ ID NO5是hCG的氨基酸序列。
SEQ ID NO6是IL-1α前体型的cDNA序列。
SEQ ID NO7是IL-1α前体型的氨基酸序列。
SEQ ID NO8是IL-1α成熟型的cDNA序列。
SEQ ID NO9是IL-1α成熟型的氨基酸序列。
SEQ ID NO10是IL-1β前体型的cDNA序列。
SEQ ID NO11是IL-1β前体型的氨基酸序列。
SEQ ID NO12是IL-1β成熟型的cDNA序列。
SEQ ID NO13是IL-1β成熟型的氨基酸序列。
SEQ ID NO14是FGF1的核苷酸序列。
SEQ ID NO15是FGF1的氨基酸序列。
SEQ ID NO16是HIV Tat72的核苷酸序列。
SEQ ID NO17是HIV Tat72的氨基酸序列。
SEQ ID NO18是HIV Tat85的核苷酸序列。
SEQ ID NO19是HIV Tat85的氨基酸序列。
SEQ ID NO20是用于FGF-2 18KDa同工型的正向扩增引物。
SEQ ID NO21是用于FGF-2 18KDa同工型的逆向扩增引物。
SEQ ID NO22是野生型FGF-1的正向扩增引物。
SEQ ID NO23是野生型FGF-1的反向扩增引物。
SEQ ID NO24是用于野生型FGF-1的正向引物再创的N-端氨基酸序列。
SEQ ID NO25是将HA附加表位加到FGF-1上的反向扩增引物。
SEQ ID NO26是将flg附加表位加到FGF-1上的反向扩增引物。
SEQ ID NO27是用于HIV Tat72或Tat85的正向扩增引物。
SEQ ID NO28是用于野生型Tat85的反向扩增引物。
SEQ ID NO29是编码C-端HA附加表位的反向引物。
SEQ ID NO30是用于Tat72的反向引物。
SEQ ID NO31是编码C-端flg附加表位的反向引物。
SEQ ID NO32是用于Tat72和C末端HA附加表物的反向引物。
SEQ ID NO33是用于IL-1α的正向引物。
SEQ ID N034是用于IL-1α的反向引物。
SEQ ID NO35是flg附加表位SEQ ID NO36是流感血细胞凝集素附加表位。
发明详述在此提供了某些定义以帮助理解本发明。
“无前导序列蛋白”指存在于细胞外环境但缺乏规范的前导序列的蛋白或多肽。前导序列调节向内质网的转移作用并且被信号识别蛋白(SRP)所识别。细胞外环境中的蛋白包括发现位于细胞外空间的分泌蛋白以及膜结合蛋白但不是完整的膜蛋白。原型的前导序列有一个带正电氨基端区域，一个中央疏水区，和一个更极性的羧基端区(见von Heijne，生物膜杂志，115195-201，1990)。无前导序列蛋白包括FGF-1，FGF-2，白细胞介素-1α，白细胞介素-1β，输精管蛋白，血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，睫状神经营养因子(CNTF)，胸腺素，甲状旁腺素，14.5KDa凝集素(L14)，转谷氨酰胺酶，硫氧还蛋白样蛋白，坐骨神经生长促进活性因子，XIIIa因子，乳房源性生长抑制因子，galectin，硫氰酸酶，和HIV tat。本发明范围内，无前导序列蛋白包括天然发生的蛋白以及基因工程的缺少前导序列但是输出的蛋白。术语“信号序列”、“前导肽”、及“前导序列”在此通用。
蛋白的“输出”指通过不是前导列序列的一种机制将翻译的细胞产物转运到细胞外空间或细胞膜的代谢主动过程。无前导序列蛋白如上面所指出的，无前导序列蛋白是那些缺少具有调节通过SRP将蛋白转移到内质网(ER)功能的信号序列的而进入细胞外环境，包括在细胞膜上或细胞膜中的蛋白。特有地，这些无前导序列蛋白起初得以鉴定是因为它们的初级翻译产物缺乏通常位于初级翻译产物N-末端的规范的疏水前导或信号序列。前导序列通过ER/Golgi用于转运过程。规范的前导序列有三个不同的区域约1-5个残基长的带正电氨基端区，约7-15个残基长的中央疏水区、约3-7个残基长的更极性的羧基端区(von Heijne，同上)。疏水中央区是关键的。
根据它们位于细胞外环境，通过非ER/Golgi的机制转运，及缺乏前导序列，已鉴定出几种无前导序列蛋白。这些蛋白包括IL-1α(SEQ IDNOs6，7和8，9；前体，成熟型)，IL-1β(SEQ ID NOs10，11，12，和13；前体，成熟型)，FGF-1，FGF-2(SEQ ID NO1-3；cDNA，18KD型)，HIVtat，PD-ECGF(血小板源性内皮细胞生长因子)，CNTF(睫状神经营养因子)，坐骨神经生长促性活性因子，输精管蛋白，转谷氨酰胺酶，L-14凝集素，XIIIa因子，硫氧还蛋白样蛋白(ADF)，胸腺素，甲状旁腺素，乳房源性生长抑制因子，galectin，HIV tat和硫氰酸酶。
其它输出的无前导序列蛋白可通过两部分测定来鉴定(1)在细胞外空间，包括细胞膜上鉴定这些蛋白，和(2)布雷菲尔德抗性输出。为鉴定候选的无前导序列蛋白的初步评定可通过对初级翻译产物的氨基酸序列的检查来实现。将其氨基端序列与其它已知前导序列比较或者如此处所描述的原型模式(Von Heijne，同上)序列鉴定提供了将潜在的无前导序列蛋白分类的方法。如上面所讨论的，前导序列约15-25氨基酸长并含有至少7-15个疏水残基如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸的中央区。缺少这种序列的蛋白的任何初级翻译序列是候选的输出的无前导序列蛋白。
如上面所指出的，鉴定一种蛋白为无前导序列蛋白取决于两部分测定，即在细胞外环境中发现蛋白和抗布雷菲尔德菌素测定。
进行的第一部分测定是在细胞外检测蛋白。对于这种测定，需要表达非前导序列的检测细胞。检测细胞既可天然地产生蛋白也可优选地从转染的表达载体中产生蛋白。检测细胞优选地正常表达蛋白，以致于转染仅仅增加表达的水平。因此们用于FGF-2表达时，优选COS细胞用于转染，且用于IL-1表达时，优选p388D1。当测定病毒来源蛋白如HIVtat时，如果检测细胞没有天然地产生蛋白，可用合适的载体方便地转染这些细胞，以便这些检测细胞表达本领域技术人员所期望的蛋白。
表达之后，蛋白的检测可采用多种众所周知的方法和步骤的任一种。这些方法包括用抗体染色结合流式细胞术，聚焦显微镜术，图象分析，细胞培养液免疫沉淀，细胞培养液的Western印迹杂交，ELISA，1-或2-D凝胶分析，HPLC，或生物测定。用于最初筛选的方便的测定是ELISA法。任何侯选蛋白应用另外一种测定方法来证实，优选代谢法标记后细胞培养液的免疫沉淀。简言之，表达侯选的无前导序列蛋白的细胞在无蛋氨酸和/或半胱氨酸的培养液中用35S-蛋氨酸和/或35S-半胱氨酸脉冲标记15分钟，并且在含有过量蛋氨酸和/或半胱氨酸的培养液中进行追踪。离心收集并澄清培养液组分于微量离心管。将含有1％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐(DOC)，20mM Tris pH7.5，5mM EDTA，2mM EGTA，10nM PMSF，10ng/ml抑酶肽，10ng/ml亮抑酶肽和10ng/ml抑胃酶肽的裂解缓冲液加到澄清的培养液中。加入侯选的无前导序列蛋白的抗体，低温孵育，随后，加入沉淀用的二抗或免疫球蛋白结合蛋白如蛋白A-Sepharose或GammaBindTM-Sepharose进行进一步孵育。同时，作为对照，共转染编码胞质蛋白的载体并用此胞质蛋白的抗体进行免疫沉淀。免疫免疫复合物并用冰冷的裂解液冲洗。复合物进一步用冰冷的IP缓冲液(0.15M NaCl，10mM磷酸钠，pH7.2，1％DOC，1％NP-40，0.1％SDS)冲洗。直接用SDS-凝胶样品缓冲液洗脱免疫复合物并在SDS-PAGE中进行电泳。丙烯酰胺的百分率将取决于无前导序列蛋白的分子量。处理凝胶进行荧光自显影、干燥并暴露于X-线胶片。也检验与对照的胞质蛋白相比在培养液中高水平表示的蛋白的布雷菲尔德抗性输出。
在表达无前导序列蛋白的细胞中测定抗布雷菲尔德性。简言之，用指导无前导序列蛋白表达的表达载体转染细胞。约2天以后，转染的细胞在无蛋氨酸和半胱氨酸的培养液中，用35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸代谢法脉冲标记15分钟或更长。去除标记，在含有5-15μg/ml布雷菲尔德菌素A的培养液中进一步孵育细胞。为定量FGF-2的输出，在追踪培养液中加入25μg/ml的肝素。无前导序列蛋白输出无统计学明显下降表明此蛋白输出是抗布雷菲尔德菌素A的。另外，其它打断高尔基体调节的分泌的化合物可用来替代布雷菲尔德菌素。
也可在表达文库中鉴定输出的无前导序列蛋白。此方法中，在载体中构建来自组织或细胞来源的cDNA文库以便产生带有报告分子的蛋白或标签肽的融合蛋白。报告分子或标签可以是可在条件培养液中方便地和敏感地测定的并且不干扰融合蛋白输出的任何蛋白。例如，可用β-半乳糖苷和FLAG肽。进一步，多种标签可用于通过三明治测定技术进行检测。总的说来，对于宿主细胞、载体要用强启动子以驱动cDNA-融合基因的表达和合适的复制起点。文库转染进入宿主细胞(如COS细胞)可采用这里描述的任何方法或其它已知方法。任何能非经典输出且与载体相容的宿主细胞都可应用。宿主细胞包括动物细胞，如COS、CHO、酵母菌和其他。为方便特定的cDNAs的修复，低多重性转染文库，如每个细胞10个重组载体。测定细胞上清液中报告分子或标签的存在。另外，评定抗布雷菲尔德性输出以证实输出是通过非高尔基体/内质网途径的。分离表达带有抗布雷菲尔德性输出的蛋白的细胞，扩增或分离并繁殖载体。然后，此载体再次低多重性转染进入宿主细胞并重复筛选过程。每一轮转染和筛选应增加输出的cDNA。阳性cDNAs可被特征化，如用于DNA序列，组织表达方式等。转运分子本发明提供无前导序列蛋白的抑制剂，其中抑制剂干扰无前导序列蛋白与转运分子的结合。转运分子可以是单个蛋白、蛋白复合物或更大的复合物的一部分。例如，如此处所描述的，多单位Na+/K+ATP酶α亚单位是与无前导序列蛋白结合的一种分子。
如此处所示，Na+/K+ATP酶调节无前导序列蛋白的转运。这种ATP酶是真核细胞的完整的膜蛋白并且以ATP作为驱动力负责钠、钾离子的跨膜转运。Na+/K+ATP酶由α、β和δ亚单位组成。哺乳动物中，至少有4种已知同功能的α亚单位和三种已知的同工型的β亚单位。α1亚单位相当普遍地表达，几乎所有的实验大鼠组织都已检测出(Shyjan和Levenson，生物化学，284531，1989)。如此处所示FGF-2和IL-1与α1亚单位的相互作用(见实施例)可通过用抗FGF2或抗IL-1和抗α1亚单位抗体共同免疫沉淀这两种蛋白来观察到。而且，输出对于强心甙处理象乌本苷处理一样敏感。这种相互作用可通过展示与对照转染的细胞相比，显著减慢FGF-2输出的速率的α1亚单位共同超表达得以证实。另外，通过与α亚单位的同工型α2和α3亚单位相互作用的共同免疫沉淀表示了FGF-2和IL-1。而且，α2和α3亚单位的过量表达也减慢了FGF-2的输出速度。
其它离子通道可能发挥转运分子或转运复合物的一部分的作用。众所周知的离子通道包括，除了Na+/K+ATP酶，有Ca2+ATP酶，H+/K+ATP酶，Na+通道，C1-通道和K+通道。转运无前导序列蛋白时这些通道的参与作用可通过用通道活性的抑制剂处理输出一种或多种无前导序列的蛋白的细胞来评定。下面列了一些已知的这些通道的抑制剂。

这些抑制剂可测定它们抑制输出任一无前导序列蛋白如FGF-2、IL-1和HIV tat的输出的能力。例举的测定中，输出无前导序列蛋白的细胞系(如，THP-1输出IL-1β)接种于48孔组织培养板中。当蛋白的输出受诱导之后(如，通过加入LPS以输出IL-1β)或当细胞恢复后，将一系列离子通道抑制剂加入各个孔中作用约4-24小时。孵育末期，去除细胞上清液并采用在此描述的测定方法测定无前导序列蛋白。降低输出量的离子通道抑制剂证明该离子通道为候选的转运分子。
其它无前导序列蛋白转运分子可通过几种方法来鉴定，包括与前导序列蛋白结合之后分离。简言之，代谢法标记表达和输出无前导序列蛋白的细胞一段短的时间。选择性追踪标记并且细胞和培养液组分用抗前导序列蛋白抗体来免疫沉淀。抗体可以是单克隆，抗体单克隆抗体混合物，或者多克隆抗体。收集免疫复合物并用PAGE分级分离。被抗前导序列蛋白抗体沉淀而不被对照抗体沉淀的标记的蛋白得以分离并进行分析及随后的鉴定。总的说来，此蛋白将受试于部分氨基酸序列分析并且，或者生产出与已知蛋白相匹配的序列，或者用标准的重组DNA技术和克隆方法(如，文库上简并探针的杂交，产生抗体并免疫筛选表达文库，或者序列扩增)分离出含有这种序列的克隆。特定的相互作用的证实可采用几种方法中的一种，包括转运分子或分子突变体的过量表达、表明有输出改变、用抗转运分子抗体共同免疫沉淀转运分子和无前导序列蛋白。Western印迹杂交测定体外相互作用等或其他方法。
可选择地，其它转运分子可采用其它方法鉴定，如酵母菌两-杂种系统或转染无前导序列融合蛋白随后分离融合蛋白。简言之，在两杂种系统中，构建DNA结合区-无前导序列蛋白的融合(如，GAL4-FGF-2融合)并转染进入含有与可选择的标志基因连接的GAL4结合位点的细胞中。与GAL4激活区融合的cDNAs文库也被构建并且共转染。当cDNA-GAL4激活区融合中的cDNA编码与FGF-2相互作用的蛋白时，可选择的标志被表达。随后，含cDNA的细胞生长，构建体被分离并且特征化。如上面所描述的，证实特定的相互作用。
鉴定转运蛋白的另外一种方法中，构建了含有无前导序列蛋白或其片段和被抗体或其它分子(如谷胱苷肽)结合的标签肽序列(如谷胱苷肽-S-转移酶)。编码融合蛋白的载体被转化进入细菌。纯化融合蛋白。例如，pGEX-4T-3(Pharmacla，Uppsala，Sweden)中的GST(谷胱苷肽-S-转移酶)FGF-2融合蛋白被IPTG诱导并用谷胱苷肽珠纯化(见Kaelin等，细胞64521，1991)。代谢法标记表达转运蛋白的细胞。细胞提取物与GST-FGF2带电荷的谷胱苷肽-Sepharose珠孵育。可选择地，融合蛋白可被免疫沉淀等。洗去未结合蛋白，洗脱结合蛋白。例如，结合蛋白可进一步用凝胶电泳分级分离。然后结合蛋白进一步用于与抗体反应，氨基酸序列分析，及如此处所描述的体外检测。编码结合蛋白的克隆可采用多种标准方法中的任何一种方法分离，包括表达文库的免疫筛选、根据部分氨基酸序列的探针杂交、和其它已知的方法。
另外一种方法中，验明了输出途径的膜成分。简言之，根据熟知的方法(如，Biomembranes，《酶学方法》172卷；Klein等，生长因子13219，1996)制备了膜制剂。为降低无前导序列蛋白与蛋白聚糖的非特异性结合，细胞可生长在含25mM氯化钠的培养液中(Guimond等，生物化学杂志，26823906，1993)。将分离的膜与无前导序列蛋白如FGF-2孵育并使之溶解。FGF-2/膜成分的复合物用抗-FGF-2抗体沉淀。任选地，在免疫沉淀之前，膜可被交联，比如用可逆的交联剂。通过SDS-PAGE分析特征化膜成分可决定膜成分的大小。蛋白可以通过放射自显影(如果细胞或膜是放射性标记的)或者染色(如，考马斯亮蓝，银染)观察到。分离的蛋白成分可进行氨基酸序列分析以促进分子克隆。
还有另一种鉴定和分离转运蛋白的方法是根据与其它有机体如酵母菌和细菌的输出蛋白的同源性或序列相似性。例如，已知酵母菌中的输出蛋白(NCE2，Cleves和Kelly、细胞生物学杂志，1331017，1996，GenBank Accession No.U 41659；NCE3，Cleves和Kelly，ibid.，GenBankAccession No.U 52369；和NCE1，C1eves和Kelly，ibid.GenBankAccession No.U 41658)酵母菌基因与哺乳动物cDNA文库的非严格杂交可用于鉴定相似的基因序列(见Ausubel等分子生物学现行实验方法.Greene Publishing，NY，1995)。根据与无前导序列蛋白相互作用或者赋予细胞转运能力或者通过此处所描述的其它方法，这些序列可表现为同源基因。
除了酵母菌输出蛋白，大肠杆菌、耶尔森氏菌属、和志贺氏菌属中转运无前导序列蛋白的分泌系统可Salmond和Reeves，TIB 187-12，1993)可根据序列相似性用于筛选。大肠杆菌中至少已鉴定出七种负责输出的蛋白(Jarvls等，美国国家科学院院报927996，1995；Bost和Belin，欧洲分子生物学组织杂志144412，1995)。来自基因库的DNA探针与来自其它属的病原体的基因组DNA杂交(McDaniel等，美国国家科学院院报921664，1995)。来自这些基因的和来自耶尔森代葡属的Ysc基因及来自志贺氏葡属的Mxi和Spa基因可用于检测其它种的包括哺乳动物中的同系物。
其它优选的实施方案中，测定转运蛋白的亚功能区用于鉴定与无前导序列蛋白相互作用的抑制剂。对于那些跨膜结合的转运蛋白，构建了胞质和固定的亚功能区。也可应用其它方法改变蛋白进入不同的亚细胞组分中。仅通过实施例的方式，在表达载体中构建了缺乏跨膜区的α1亚单位。共转染FGF-2构建体并且评定了FGF-2和此α1片段之间的相互作用。可选择地，α1片段可被固定在膜里。因为一般α1不插入到缺乏β1亚单位的动物细胞(脊椎动物)的细胞膜内，构建了使α1到细胞表面的融合蛋白构建体。简言之，融合蛋白，包括另一种蛋白的跨膜区；如VSV-G，融合到α1的N-末端和α1不同的缺乏和截断。为协助膜内α1的检测，一种容易测定的蛋白的细胞外区域如hCG(人绒毛膜促性腺激素)，应和与VSV-G跨膜区邻近的构建体融合。一旦基因产物被便利地测定(如通过抗体，染色，酶测定)其它报告分子基因可互换。hCG可用抗体染色检测。当证实α1插入膜后，评估FGF-2和α1之间的相互作用并且用此处描述的方法测定FGF-2的输出。抑制剂侯选抑制剂可从多种来源如细菌、真菌、植物、寄生虫、化学制剂库，随机肽等中分离或获得。潜在抑制剂包括已知的抑制血管生成、炎症或者无前导序列蛋白的其它特定功能的化合物。例如，血管生成抑制剂包括阿霉素、吡喃葡糖苷、ansacrino、喜树碱、ε-(4-羟基-1-萘基)-2-proponoic酸衍生物，2，5-二-test-丁基对苯二酚、氨氯吡嗉咪和衍生物、金精三羧酸、卡托普利、dioxopiperazines、甲基强的松龙、苏拉明、和朱诺环素。炎症的抑制剂包括8-羟基喹啉、氯化胆碱、cyclopiazonic acid、吲哚洛芬、莫能星、烟碱、制霉菌素、维拉帕米、和硫胺素。这些和其它抑制剂可是多效的并且本身检验可抑制多种或所有无前导序列蛋白的输出。除了具有已知功能的抑制剂，可从化学制剂库、小分子库、植物、真菌等中用此处所描述的测定方法获得。例如，从小分子和化学制剂文库中鉴定出的抑制剂包括那些此处图29A-29C中鉴定的，和其衍生物和类似物。
在此公开的抑制剂和潜在的有用的抑制剂也包括具有验明的和潜在的抑制效果的分子和化合物的衍生物、类似物和模拟物。例如，已知的抑制血管生成，炎症，或无前导序列蛋白的其它特定功能的化合物的衍生物、类似物和模拟物是本发明范围内的抑制剂或潜在抑制剂。为说明的目的引用更特定的实例，阿霉素、制霉菌素和阿的平的衍生物、类似物和模拟物是本发明范围内的抑制剂和/或潜在的抑制剂。
优选的实施方案中，抑制剂在无前导序列蛋白与其转运蛋白的相互作用中起干扰作用。抑制剂可通过阻止无前导序列蛋白与转运蛋白的结合、引起结合的无前导序列蛋白和转运蛋白的解离或其它机制发挥作用。抑制剂可直接或间接发挥作用。例如，抑制α1、α2、α3与FGF-2或IL-1的结合可降低或消除蛋白的输出。这种抑制剂一般是细胞内发挥作用的。相反，强心甙(即强心甙和糖苷配基衍生物)是细胞外发挥作用并且抑制FGF-2的输出但可能不抑制FGF-2与α1亚单位的相互作用。
抑制剂应具有最低的副作用并且优选无毒的。对于某些应用，优选能穿透细胞的抑制剂。抑制剂应特异性抑制输出并且不仅仅抑制新陈代谢，如NaN3。检测无前导序列蛋白输出的抑制作用的测定无前导序列蛋白输出的抑制剂可通过测定如此处所描述的得以鉴定。简言之，优选的测定中，表达无前导序列蛋白的细胞用候选的抑制剂处理，并且将作为细胞外蛋白检测到的无前导序列蛋白的量与没经处理所检测到的量相比。
在本发明范围内，抑制剂必须满足三条标准(1)抑制无前导序列蛋白的输出；(2)不抑制带有前导序列的分泌蛋白的输出；和(3)不促进胞质蛋白在细胞外环境的表达。一般地，试验的化合物将首先测定其抑制无前导序列蛋白的输出。成功的抑制剂将进一步测定其他期望的特征。应用合适的对照组来区别真阳性和假阳性或阴性。
任何一种在此所描述的测定中，试验细胞应天然地或引入编码此蛋白的重组DNA分子之后表达无前导序列蛋白。本领域熟知的转染和转化的方法并且包括CaPO4-介导的转染、电穿孔、用病毒载体感染、DEAE-葡聚糖介导的转染等。优选无前导序列蛋白的重组表达。作为上面所描述的无前导序列蛋白的一种替代，可应用嵌合的无前导序列蛋白(即，无前导序列蛋白与其它蛋白或蛋白片段的融合)，或者基因工程产生的缺少前导序列的序列。以相同的方式，分泌的蛋白或胞质蛋白可天然地或在编码蛋白的载体转染之后被宿主细胞表达。宿主细胞在得病之后、病毒感染等之后也可表达无前导序列蛋白。已熟知的由于前导序列而被输出的分泌蛋白包括，人绒毛膜促性腺激素ChCGα(SEQ ID NO3)、生长激素、肝细胞生长因子、转铁蛋白、神经生长因子、血管内皮生长因子、卵清蛋白、和胰岛素样生长因子。相似地，已熟知胞质蛋白并包括新霉素磷酸转移酶、B-半乳糖苷酶、肌动蛋白和其它细胞骨架蛋白和酶如蛋白激酶A或C。最有用的胞质或分泌的蛋白是那些用方便的测定方法如ELISA可便利地测定。这三种蛋白(无前导序列、分泌的和胞质蛋白)可通过共转染宿主细胞而天然地共表达，或者单独转染进入单独的宿主细胞。进一步，对于此处所描述的测定，细胞可稳定地被转化或者瞬时表达蛋白。
重组载体中表达的无前导序列蛋白可以是天然的蛋白、变种、包括等位基因或设计用来帮助检测蛋白的融合蛋白。例如，可构建FGF-2和标签肽的融合蛋白。标签肽是短序列的、通常来源于被抗体或其它分子识别的天然蛋白。这样的标签肽有FLAG，Glu-Glu标签(Chiron Corp.Emeryville.CA)KT3标签(Chiron Corp.)，T7基因10标签(Invitrogen，La Jolla，CA)，T7主要衣壳蛋白标签(Novagen，Madison，WI)，和HSV标签(Novagen)。其它，只要含有标签的融合蛋白被输出，可应用相似的系统。除了标签，可用其它类型的蛋白或者肽。例如，谷胱苷肽-S-转移酶或特定酶活性的序列可与无前导序列蛋白融合。这样的酶包括β-半乳糖苷酶、硫氧还蛋白、碱性磷酸酶等。这些酶中每一种酶的活性可容易地测定或者蛋白被可获得的抗体识别。
仅仅通过实施例的方式，描述了含有FGF-2 18KD同工型的构建体。质粒18 dx编码如以前所描述的来源于野生型人FGF-2 cDNA的FGF-2的18KD同工型(Florkiewicz和Sommer，美国国家科学院院报)。18KD同工型是FGF-2序列ATG密码子5’端截短11个碱基。因此，仅18KD型被表达。含有此cDNA的片段被插入pJC119，一种用SV40晚期启动子控制插入基因表达的SV40表达载体(Sprague等，病毒学杂志45773，1983)。明显地，其它表达载体可互换应用且载体的选择部分取决于被转染的宿主细胞。本实施例中，FGF-2 cDNA用SV40表达载体在COS细胞中表达。选择COS细胞是由于它们正常地表达低水平的FGF-2，并且本身具有用于输出这种无前导序列蛋白的合适的细胞机器。
简言之，无前导序列蛋白也可与标签序列融合以帮助检测与无前导序列蛋白相互作用的蛋白的输出或有助于蛋白的鉴定。例如，FLAG肽与HIV tat、FGF-1和FGF-2融合。此肽不干扰FGF-2的输出。GST也与无前导序列蛋白融合，例如，FGF-2和IL-1。
其它上面所描述的无前导序列蛋白可用于这些构建体。编码这些蛋白的DNA分子可通过传统的方法如文库筛选、PCR扩增、或克隆方法获得，或者从ATCC/NIH人和小鼠DNA探针库中获得。这些蛋白的核苷酸序列一般可以从GenBank，EMBL数据库或发表物中获得。
将认识到，根据熟知的原理可方便地替代用于表达的其它细胞类型、载体、启动子和其它元件。最低限度，含有无前导序列蛋白的载体构建体应具有在目标细胞中有活性的启动子序列。任选地，并且优选地，构建体含有增强子、转录终止子、Poly(A)信号序列、细菌或哺乳动物复制起点和可筛选的标志。选择这样的载体适用于转染的细胞的种或组织类型。细胞可以是哺乳动物的、乌的、或其它真核细胞包括酵母菌、或者是起源于原核生物的。
适于实施本发明的哺乳动物细胞包括，尤其是COS(ATCC No.CRL1650)，BHK(ATCC No.CRL6281)。CHO(ATCC No.CCL61).HeLa(ATCC No.CCL2).293(ATCC No.1573).NS-1(ATCC No.TIB18)和Hep G2(ATCC No.HB8065)。
本发明范围内可应用多种启动子。启动子的选择至少部分依赖于用于转染的受体细胞系。按实施例的方式，可采用如上面所描述的启动子如SV40启动子、MoMuLV LTR，RSV LTR、腺病毒启动子和巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子或晚期启动子。可采用可诱导的启动子如TET开/闭系统(Clontech Life Technologies，Palo Alto，CA)和金属硫蛋白基因启动子。只要在目标细胞中被活化，也可用组织特异性或细胞-类型启动子。例如，免疫球蛋白可用于在B淋巴细胞中表达基因。其它组织特异性启动子包括从甲胎蛋白、γ和α晶体蛋白、α-肌动蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原中分离出的，和略氨酸酶启动子。优选的启动子高水平表达无前导序列蛋白。
本领域熟知增强子、转录终止子和可筛选的标志。增强子序列是所用的启动子区域的部分或附加的。可用来源于CMV-IE、RSV LTR、SV40或其它来源的启动子。转录终止子是使RNA聚合酶调节的转录终止的序列。Poly(A)信号可包含在终止序列之中或单独地结合。可筛选标志包括传递给宿主细胞表型，使转化的细胞被识别并且优选地在特定的条件下形成生长优势的任何基因。熟知适用于细菌的可筛选标记并且包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素抗性基因。适用于哺乳动物细胞的可筛选标记有潮霉素、新霉素、补充宿主(如胸腺嘧啶核苷激素和TK-细胞)中缺陷的基因和本领域熟知的其它基因。
一旦试验细胞被构建或获得之后，输出抑制剂可通过细胞筛选测定、或者转运分子和无前导序列蛋白之间结合的体外结合测定得以鉴定。显而易见，这些测定适合于测定含有前导序列蛋白和胞质蛋白的分泌。总的说来这些蛋白的特定的反应物(如抗体)适合用作无前导序列的反应物。
细胞测定中，检测无前导序列蛋白、分泌蛋白、和胞质蛋白的测定包括脉冲追踪术过程中标记的蛋白的免疫沉淀、ELISA、2-D凝胶、蛋白染色(如考马斯亮兰)，HPLC，Western印迹杂交、生物测定、和phagokinetic tracts。所有这些测定中，表达和输出的无前导序列蛋白的试验细胞在有或没有候选抑制剂存在时孵育。
免疫沉淀法是可用于确定抑制作用的测定法。简言之，用35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸在无蛋氨酸和/或半胱氨酸的细胞培养液中标记从导入的载体构建体表达无前导序列蛋白的细胞一段短时间，特有的15分钟或更长。脉冲标记之后，如果无前导序列蛋白是肝素结合的话，用含有过量的未标记的蛋氨酸和半胱氨酸加肝素的培养液冲洗细胞。然后，细胞在相同的追踪培养液中培养不同的时间。加入不同浓度的候选抑制剂。收集并澄清培养上清液。上清液与抗FGF-2免疫血清或单克隆抗体，或者如果存在标签肽时与抗-标签抗体孵育，随后与显色试剂如Staphylococus aureus Cowan染料1，蛋白A-Sepharose，或Gamma-bindTMG-Sepharose孵育。离心沉淀免疫复合物，用含有1％NP-40和0.5％脱氧胆酸盐、EGTA、PMSF、抑酶肽、亮抑酶肽和抑胃酶肽的缓冲液洗沉淀，然后用含有磷酸钠pH7.2，脱氧胆酸盐、NP-40和SDS的缓冲液洗沉淀物。免疫复合物在SDS凝胶样品缓冲液中洗脱并用SDS-PAGE分离。处理凝胶用于荧光自显影、干燥并且使X-线胶卷曝光。
可选择地，ELISA可用于检测和定量细胞上清液中FGF-2或其它无前导序列蛋白、分泌的蛋白或胞质蛋白。高输出量筛选时优选ELISA检测。简言之，当FGF-2是检验的无前导序列蛋白时，96孔板用抗FGF-2抗体或抗标签抗体包被、冲洗以用2％BSA封闭。然后向孔中加入细胞上清液。孵育和冲洗之后，加入二抗(如，抗FGF-2)。此二抗应与标记或检测试剂如酶或生物素偶联。进一步孵育之后，加入显色剂并用ELISA平板读数计测定FGF-2的量。显色剂是与二抗(典型的是抗一同种型抗体)偶联的酶的底物或者是与链霉抗生物素蛋白偶联的酶的底物。本领域熟知的合适的酶包括作用于底物(如，ABTS)导致比色反应的辣根过氧化物酶。将认识到，与其用与酶偶联的二抗，不如将抗FGF-2抗体直接与辣根过氧化物酶，或者其它等同的检测试剂偶联。如果需要，可浓缩细胞上清液以升高检测水平。
ELISA也可便利地适用于筛选多种高输出量的候选抑制剂。简言之，这样的测定可方便地在96孔板上的细胞上进行。如果试验细胞天然地或稳定地表达无前导序列蛋白，细胞种植密度可为20,000个/孔。如果细胞不是天然地表达蛋白，可实现细胞的瞬时表达如通过电穿孔或CaPO4-介导的转染。电穿孔时，分别将100μl细胞混合物(150,000个/ml)和载体DNA(5μg/ml)加入96孔板的各个孔中。用带有96孔电极的仪器(如ECM 600电穿孔系统，BTX，Genetronics，Inc)电穿孔细胞。电穿孔最适宜的条件根据特殊的宿主细胞类型而试验性地决定。电压、电阻和脉冲长度是典型的可变参数。优化电穿孔的准则可从生产家或操作手册如《分子生物学现行实验方法》(Ausubel等编)获得。电穿孔可在不同的细胞类型，包括哺乳动物细胞、酵母菌、细菌等细胞上进行。孵育之后，加入含有或不含有抑制剂的培养液且进一步孵育细胞1～2天。此后，收集培养液并用此处任何一种测定方法测定蛋白。优选地，用ELISA检测蛋白。起初试验的浓度为50μM，如此浓度表现出统计学上有意义的减少输出，进一步检验此候选抑制剂的剂量反应。
可选择地，浓缩的上清液可在SDS-PAGE凝胶上电泳并转移到固体支持物如尼龙或硝酸纤维上。然后通过用含有同位素的或非同位素的报告分子基因的无前导序列蛋白的抗体的免疫印迹法(见Harlow.抗体实验室手册，冷泉港实验室，1988)检测无前导序列蛋白。这些报告分子基因包括但不限于酶、辅助因子、染料、放射性同位素、发光分子、荧光分子和生物素。优选地，报告分子基因是125I或者可通过与2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸孵育被检测到的辣根过氧化物酶。上面所描述的这些检测测定法可便利地适用于含有肽标签的无前导序列蛋白。这种情况下，所用的抗体与肽标签结合。其它测定法包括根据分子大小和电荷的层析，包括HPLC和亲和层析。
可选择地，生物测定可用于定量输出到细胞培养液中的无前导序列蛋白的量。例如，18KD FGF-2的生物活性可通过增殖测定，如掺入氚标记的胸腺嘧啶来测定。简言之，向用含有FGF-2的表达载体转染的细胞中加入候选的抑制剂孵育约30个小时。孵育之后，将细胞转移到低血清浓度的培养液中再孵育16小时。去除培养液并且离心澄清培养液。加入含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。通过与肝素-SepharoseCL-6B结合浓缩FGF-2并用1.5M NaCl洗脱。然后，向培养的静止的3T3细胞或内皮细胞加入不同数量的洗脱物测定FGF-2的生物活性。向培养液中加入氚标记胸苷并且约24小时后测定TCA可沉淀计数。还原活性染料MTT是另一种测定增殖的方法。纯化的重组人FGF-2可用作标准。可用相似的方法评定其它生血管的无前导序列蛋白(如FGF-1、PD-ECGF)。表现出其它功能的无前导序列蛋白可用本领域其它可行的生物测定法测定。
其它体外生血管测定包括胶原凝胶中测定内皮细胞增生(Goto等，实验室检查69508，1993)，测定胶原凝胶中用小室与输出无前导序列蛋白的细胞隔离的共培养的脑毛细血管内皮细胞的增生(Okamure等B.B.R.C 1861471，1992，Abe等，临床检查杂志，9254，1993)，或细胞迁移测定(见，Warren等，临床检查杂志，951789，1995)。
可选择地，或作为候选抑制剂的又一种评定方法，可通过测定无前导序列蛋白和它的转运蛋白之间的结合程度来测定其抑制作用。用侯选抑制剂处理或者转染之后处理内源性表达无前导序列蛋白和转运蛋白的细胞。可用多种不同的方法测定这种结合作用。共同沉淀测定法中，用两者之中任一蛋白的抗体进行沉淀。用凝胶电泳测定沉淀物以中断相互作用。无前导序列蛋白可以是带有标签肽的融合蛋白并且抗标签肽抗体被用于沉淀。如上面所描述的，此测定中可用膜结合的α1亚单位或片段。
鉴定一种输出抑制剂的测定可用分离的转运分子和无前导序列蛋白来进行。可通过重组表达优选地获得分离的成分并用标准的方法学纯化。这种测定中，在有或没有候选抑制剂存在时，连同任何必需的辅助因子混合分离的成分。这种测定可方便地用ELISA或ELISA形成进行。简言之，转运分子附着于96孔板的孔上。带有或不带有候选抑制剂的无前导序列蛋白被加到孔中并孵育。洗掉未结合的蛋白，用此处所描述的标记抗体检测无前导序列蛋白，例如，可采用这种测定的变异方法，例如，成分可附着于Biocore片或相似的固相检测设备上。
抑制性活性可用疾病模型进行体内测定。向细胞外环境输出目标无前导序列蛋白的细胞被引到蛋白活性可被测定的局部环境中。就输出FGF-1、FGF-2、PD-ECGF、IL-1。硫氧还蛋白、MDGI、XIII因子的细胞而言，这些细胞将加速邻近细胞的血管形成或血管生成、炎症、血液凝固或神经胶质增生。例如，就与肿瘤细胞一同接种的输出FGF-1的细胞而言，随后会发生肿瘤的血管形成。相应地，FGF-1输出的抑制剂将抑制肿瘤的生长。本领域的技术人员会认识到蛋白的输出水平可由于应用不同强度的助催化剂而不同。而且，输出蛋白的细胞可被稳定地转化或者瞬时表达蛋白。给药的位点和途径可部分取决于蛋白和它的正常作用位点。
当转运分子是Na+/K+ATP酶时，可进行铷摄取测定以证实抑制剂不影响离子转运。简言之，用表达Na+/K+ATP酶的载体转染的细胞在存在或不存在抑制剂条件下生长。加入放射性铷，孵育一段短时间。冲洗细胞，用碱抽提，中和并计数。与对照组相比，造成无统计学意义的铷摄取降低的抑制剂是本发明范围内有用的。
对于引起细胞游动性的无前导序列蛋白，如FGF-2，应用phagokinetic traet测定来确定输出的无前导序列蛋白的量(Mignatti，细胞生理学杂志，15181-93，1992)。这种测定中，允许细胞在用胶体金包被的显微镜盖玻片上迁移。在暗视野的照明下，金颗粒表现为暗视野上的均一的一层高折射颗粒。当细胞在底物上迁移时，细胞把金颗粒推开并产生一条暗的轨迹。用图象分析仪测定轨迹的长度。多种情况下，细胞迁移直接与细胞所产生的FGF-2的量相关。生物测定的选择将取决于、至少部分取决于试验的无前导序列蛋白。
体内测定可用于证实抑制剂影响无前导序列蛋白的输出。用于测定生血管活性，标准的测定包括鸡尿囊绒膜测定(Aurbach等，生物学进展41391，1974 Taylor和Folkman，自然247307，1982)和肿瘤血管生成的抑制作用。对于一些无前导序列蛋白如在小鼠异源的肿瘤模型中测定肿瘤生长的抑制作用是适合。
诱导炎症的无前导序列蛋白(如IL-1，Dinarello美国血液学协会杂志872095，1996)可在体外或体内测定。简言之，体外测定是通过向鼠T细胞系如DIO或G4.1加入来自输出蛋白的细胞的培养上清液，并且测定细胞因子产量或增生来进行的(Ichinose等，癌的免疫学与免疫疗法，277，1988)。上清液可加到IL-1敏感的放射性标记的肿瘤细胞上并且测定放射活性的释放。可选择地，LPS可被用于诱导IL-1β合成和释放。体内炎症测定包括皮下种植含有输出IL-1的细胞的小室并且评定吞噬细胞和成纤维细胞的浸润(Hurtenbach等，实验病理学杂志，76111，1995；Giller等，免疫学杂志，11331，1995；Xing等，美国呼吸道细胞与分子生物学杂志10148，1994；Dawson等，《药剂与作用》38247，1993)。还有其它的测定包括由于注射引起慢性炎症的试剂而产生的肝和肺的肉芽肿病炎症动物模型(Allen等，临床检查杂志761042，1985；Matheny等，生长因子417，1990，Chensue等，免疫学杂志，1148，1992)。
任何一种这些测定中，如果有抑制剂存在时进行的测定中细胞外检测的蛋白的量与没有抑制剂存在时进行的测定相比有统计学上显著的降低，这种化合物就抑制了输出。优选地，抑制剂至少降低50％的无前导序列蛋白，甚至更优选地80％或更高，并且还优选地，表现剂量依赖方式。另外，应对分泌的蛋白或胞质蛋白的行为没有统计学显著的影响。优选地，对这两种蛋白的行为产生小于10％的增加或降低。
如实施例中和图29A-29C所示的，筛选小分子文库用于抑制FGF-2的输出。许多有抑制作用的化合物以两种不同浓度再次被检验并且检验其对hCG分泌的抑制作用。十种不同的化合物抑制FGF-2，但不明显影响hCG的分泌。给药如上面所描述的，无前导序列蛋白的抑制剂可用于治疗肿瘤、抑制血管形成、抑制炎症、抑制细胞增生包括引起再狭窄平滑肌细胞增生，以及治疗糖尿病并发病。另外，抑制剂可局限病毒、细菌、真菌感染。治疗意味着症状可被减轻或疾病进展或疾病状况被阻止或延迟。将治疗的细胞与治疗有效量的抑制剂相互作用。相互作用可通过体外或体内孵育细胞起效，如体表给药、用特定载体运送，或通过血管给药。
此处的结合物可制成适合于体表、局部、静脉内和全身给药的制剂。也期望制成时间释放制剂。有效浓度的一种或多种结合物与合适的药物载体混合。结合物有效的浓度或量要求给药时释放此浓度和量的结合物可改善症状或治疗疾病。典型地，组合物制成单一给药剂量的制剂。治疗的有效浓度和量可通过在已知的如此处所描述的那些体外和体内系统中试验结合物来经验性确定；然后由此推测用于人或其它动物的剂量。
如此处所描述的侯选的要治疗的肿瘤包括那些带有FGF受体的。这些肿瘤包括但不限于黑素瘤、畸胎样瘤、卵巢癌、膀胱肿瘤或成神经细胞瘤。
适合其它疾病、失调、综合症的治疗。糖尿病并发症如糖尿病视网膜病、再狭窄、多囊肾疾病和动脉粥样硬化也适合采用这种治疗。受糖尿病影响的眼、肾、外周神经中的细胞可用此处所描述的结合物治疗。也可用于治疗病毒、真菌和细菌感染。
适合于施用这里提供的结合物的药物载体包括任何被本领域技术人员所知的适合于给药的特殊形式的载体。另外，抑制剂可是制成的组合物中唯一的药物活性成分或者与其活性成分相结合。
本发明的组合物可制成通过多种不同途径给药的制剂。优选局部给药。抑制剂可与合适的赋形剂如盐、缓冲液、稳定剂等混和。如果是表面给药，如皮肤和粘膜上用药，抑制剂应是凝胶、乳膏和洗液形式。这些溶液，尤其是那些用于眼的，应用合适的盐制成0.01～10％的等渗溶液，pH约5-7(见，如，美国专利号5,116,868)。
用于非肠道的、真皮内的、皮下的或体表给药的溶液或悬液可包括以下成分中的任一种无菌稀释剂，如用于注射的水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗微生物剂如苯甲醇和羟苯甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液；和用于调节毒性的试剂如氯化钠或葡萄糖。非肠道制剂可装于安瓿、一次性注射器或由玻璃、塑料或其它合适的材料制成的多种剂量药水瓶中。
如果是静脉内给药，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲液和含有增稠剂和溶解剂的溶液如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇和其混合物。脂质体悬液也适合作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知的方法制备。
应制备抑制剂含有防止其从体内快速消除的载体，如时间释放制剂或外衣。这些载体包括控制的释放制剂，如但不限于，种植物和微囊运送系统，及生物可降解的、生物适合性聚合物如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和其它。例如，组合物可通过外科纱布用于外科，如商业上可获得的外科外用纱布(见，如美国专利号3,956,044和4,045,238)。
抑制剂可通过任何合适的途径给药，例如经口服、非肠道的、静脉内、皮内、皮下或体表给药的液体、半液体或固体形式的制剂及制成适合于每种给药途径的制剂形式。优选的给药方式根据治疗指征而定。皮肤病学的和眼科的指征应特有地局部给药；而肿瘤、再狭窄、感染应特有地系统给药、皮内或皮下方式给药。
抑制剂以足以发挥治疗有效且无不良副作用的量包含在药学上可接受的载体中。可以理解副作用的效量和程度取决于这些结合物治疗的疾病。例如，当治疗有生命危险的疾病如肿瘤时可溶许某种毒性和不良副作用，当治疗疾较轻后果的小病时就不能容许。组合物中结合物的浓度取决于吸收率、灭活速率和其排泄速率、剂量时间表和给药量及其它本领域技术人员已知的因素。
抑制剂应一次给药，或可分成每隔一定时间给药的多个较小剂量给药。可以理解治疗的准确剂量和持续时间与被治疗的疾病密切相关，并且可用已知的试验手段经验性地确定或者由体内或体外试验资料推测而确定。应注意到的是浓度和剂量的值也可随被减轻的疾病的严重性不同而变化。进一步应被理解的是，对于任何一个特殊的对象，应根据个体需要和给药或监督给药的人的专业判断按时调节特定的剂量制度，而且此处所述的浓度范围仅仅是示范性的且不想限制申请专利的组合物的范围和应用。
下面以说明的方式而不是限定的方式提供了实施例。实施例实施例1构建表达FGF-2的质粒含有FGF-2 18KD同工型的表达载体按下面构建。人FGF-2 18KD同工型的序列由质粒18dx提供(Florkiewicz和Sommer.美国国家科学院院刊863978-3981，1989)。由于位于起动18KD FGF-2同工型的翻译的ATG密码子5’端11个碱基的ApaI位点的上游序列缺失，载体仅表达18KD同工型。简言之，用ApaI直线化质粒p18dx并将含有)XhoI位点的寡核苷酸衔接头与质粒连接。纯化含有FGF-2的XhoI限制性片段并且亚克隆进入pJC119的XhoI位点(Sprague等，同上)。
编码hCG-α的表达载体(Guan等，生物化学杂志2635304-5313，1988)作为对照的通过ER/Golgi运输的蛋白。实施例2细胞培养、转染和代谢法标记从American Type Cultute Collection(ATCC CRL 1650)中获得的COS细胞在含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100nM非必需氨基酸，和50μg/ml庆大霉素的48MEM培养液的48孔板上培养过液。然后用转染缓冲液140mM NaCl，3mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，0.9mM Na2HPO425mMTris，pH7.4中的2μg/ml的CsCl-纯化的质粒DNA转染COS-1细胞。将转染缓冲液中300μl的DNA加入每个孔。37℃孵育细胞30分钟，并且吸去缓冲液。加入含有100μM氯喹的温暖的培养液孵育1.5小时。去除培养基并用完全培养基洗细胞两次。然后孵育细胞40-48小时。用含有可筛选标记的新霉素磷酸转移酶的pMAMneo(Clontech.Palo Alto，CA)共转染质粒18dx。如免疫荧光显微镜测定的，当2μg的p18dx与10μg的pMAMneo共转染时，大于70％的转染细胞表达FGF-2和neo。
当DNA转染40-48小时后，进行上清液免疫沉淀时，COS-1细胞在1ml的无蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM培养液中用100μCi的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸(Trans35S-Label，TCN Biomedicals，Irvine，CA)代谢法标记15分钟。标记之后，用含过量的(10mM)未标记的蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM培养液洗单层细胞一次，1-2分钟。然后将细胞置于2ml培养液中培养指定的时间。含有指定浓度的抑制剂的追踪培养液用于这种指定的培养。
转染后48小时，用ELISA测定上清液时，吸出培养液。用250μl的0.1M碳酸钠，pH11.4洗细胞一次，1～2分钟后立即吸出。也可用高盐浓液替代。去除碳酸盐缓冲液并用含0.5％ FBS加25μg/ml肝素的培养液洗细胞。加入含0.5％FBS和25μg/ml肝素的培养液。然后孵育细胞指定的时间长度。含有抑制剂的追踪培养液用于指定的培养。对于用编码HCG-α或其它非肝素结合蛋白的载体转染的细胞，可省去碳酸盐冲洗和肝素的加入。实施例3 IL-1α输出的诱导P388D1或HTB9(人膀胱癌)细胞以1x106个/48孔种植在每孔0.5ml的含50μg/ml庆大霉素、谷氨酰胺和15％FBS的RPMI 1640培养液中并在37℃、湿润的CO2培养箱中孵育过夜。
加入1μM离子霉素或其它钙离子载体，PMA，或10μg/ml LPS等诱导细胞输出IL-1α。去除培养液。用相同的含0.5％FBS，含有或不含有试验的抑制剂的培养基洗细胞。并在37℃，CO2湿箱中孵育指定的时间长度。在孵育基末，收集细胞培养液，离心，并用(20ml构橡酸盐，pH6.0含2％无蛋白酶HSA，2mM EGTA，亮抑酶肽、抑胃酶肽、抑酶肽各0.5μg/ml，0.2mM PMSF和50μM AEBSF)1∶1稀释。然后，或者立即测定IL-1α或者-20℃冻存。实施例4 FGF-2布雷菲尔德抗性输出布雷菲尔德菌素A抑制蛋白从内质网和高尔基体输出。与之相对比，无前导序列蛋白的输出不被布雷菲尔德菌素A的处理所抑制。由美国典型培养物保藏中心获得COS-1细胞并培养在含10％胎牛血清(GeminiBioproducts，Inc.)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、100单位/ml青霉素、100单位/ml链霉素的Dulbecco’s ModifiedEagle培养液(DMEM，University of California San Diego CoreFacility)中。前面已描述了含有编码多种FGF-2同工型(24，23，22和18KD)的野生型(人)cDNA的质粒SV-40基本的表达载体(Florkiewicz和Sommer，同上)。60mm组织培养皿中约3x105COS-1细胞用与1.0ml的转染缓冲液(140mM NaCl，3 mM KCl，1mM CaCl2，0.5mMMgCl2，0.9mMNa2HOP4，25mM Tris pH7.4。所有都来自Sigma化学试剂公司)混合的10μgCsCl纯化的质粒DNA转染。如免疫荧光显微镜所测定的，在这些用2μg的p18dx加10μg pMAMneo的共同转染条件下，大于70％的转染细胞表达两种蛋白。结果中质粒DNA的比率可无明显变化。DNA转染40-48小时后，COS-1细胞在1.0ml无蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM中用100μCi的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸(Trans35S-标记，ICN Biomedicals，Inc.)代谢法标记15分钟。脉冲标记之后，用含过量(10mM)未标记的蛋氨酸(Sigma化学试剂公司)和半胱氨酸(Sigma化学试剂公司)的DMEM洗细胞单层一次并在1.0ml相同的培养基(追踪)培养指定的时间长度。用布雷菲尔德菌素A，追踪培养液中含15μg/ml的布雷菲尔德菌素A，处理培养物。追踪培养液中也含25μg/ml的肝素(Sigma化学试剂公司)。尽管定性地检测FGF-2输出时肝素不是必需的，但定量地检测FGF-2输出时是必需的。
除了加入免疫血清前将400μl的不含NaCl的400μl裂解缓冲液(l％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐，20mM Tris pH7.5，5mM EDTA，2mM EGTA，0.01mM苯甲基磺酰氟，10ng/ml抑酶肽，10ng/ml亮抑酶肽，10ng/ml抑胃酶肽)加到4℃微量离心15分钟澄清的培养基组分之外，基本上如前所述(Florkiemicz等，1991)制备用于免疫沉淀的细胞和培养液组分。细胞和培养液组分用1∶200稀释的豚鼠抗FGF-2免疫血清(我们实验室制备的)在21℃孵育40分钟，然后加入GammaBind G Sepharose(PharmaciaLKB Biotechnology)再孵育30分钟。沉淀G-Sepharose结合的免疫复合物，用裂解缓冲液洗免疫复合物三次并用冰冷的免疫沉淀清洗缓冲液(0.15M NaCl，0.01M磷酸钠pH7.2，1％脱氧胆酸盐，1％NP-40，0.1％十二烷基硫酸钠)洗四次。免疫复合物直接在SDS-凝胶-样品缓冲液中洗脱并用12％SDS-PAGE分离。处理凝胶用于荧光自显影、干燥并在-70℃使X-线胶片曝光。家兔抗-新霉素磷酸转移酶抗体(5Prime-3Prime，Inc.，Boulder，(O)用于含有NPT的免疫沉淀。
如Florkiewicz等，1995(同上)所示，18KD FGF-2的输出是布雷菲尔德菌素A抗性的且能量依赖的。样品A单独用培养液追踪，样品B用含25μg/ml布雷菲尔德菌素A的培养液追踪，样品C用含50mM 2-脱氧-D-葡萄糖和NaN3的培养液追踪。FGF-2向培养液输出2小时。布雷菲尔德菌素A对于输出没有显著影响。然而，当代谢抑制剂NaN3存在时，输出显著降低。相对比，hCG-α向培养液分泌4小时且是布雷菲尔德敏感和能量依赖的。hCG-α(SEQ ID NO4，5)含有疏水的前导(信号)序列并且是通过内质网和高尔基体分泌的。实施例5免疫沉淀和Western印迹杂交分析除了在微量离心管中离心15分钟澄清之后将400μl的裂解缓冲液(1％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐，20mM Tris pH7.5，5mM EDTA，2mM EGTA，0.01mM苯甲基磺酰氧，10ng/ml抑酶肽，10ng/ml亮抑胃酶肽，10ng/ml抑胃酶肽)加到培养液组分之外，基本上如前所述制备细胞和条件培养液组分(Florkiewicz等，生长因子4265-275，1991；Florkiewicz等，纽约科学院纪事638109-126)。细胞或培养液组分与豚鼠抗FGF-2免疫血清(1∶200)在21℃孵育40分钟。加入GammaBinTMG Sepharose(Pharmacia KLB Bioteehnology，Uppsala，Sweden)，再孵育30分钟。微量离心沉淀免疫复合物，用裂解缓冲液洗3次并用冰冷的免疫沉淀冲洗缓冲液(0.15M NaCl，0.01M磷酸钠pH7.2，1％脱氧胆酸盐，1％NP-40，0.1％十二烷基硫酸钠)洗四次。免疫复合物在SDS凝胶样品缓冲液125mMTris，pH6.8，4％SDS，10％甘油，0.004％溴酚蓝，2mM EGTA中洗脱并且用12％SDS-PAGE分离。处理凝胶用于荧光自显影、干燥且在-70℃使X-线胶片曝光。用家兔抗-新霉素磷酸转移酶(NPT)抗体(5Prime-3Prime.Boulder.CO)沉淀NPT。
为进行Western印迹杂交分析，将蛋白从12％的SDS-PAGE凝胶转移到硝酸纤维素膜(孔的大小为0.45μM)。以0.4 amps在冷的含25mM 3-[二甲基(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙烷基磺酸，pH7.5，25％甲醇溶液中转移90分钟。在室温下用10mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，5mM NaN3，0.35％聚氧化乙烯-脱水山梨醇-月桂酸盐和5％脱脂干牛奶(CarnationCo.，Los Angeles，CA)封闭膜1小时。4℃时，膜与0.3μg/ml单克隆或多克隆抗FGF-2抗体(Transduction Laboratories，Lexingto，KY)在封闭液中孵育16小时。孵育之后，室温下用含150mM NaCl，500mM磷酸钠pH7.4，5mM NaN3，和0.05％聚氧化乙烯-脱水山梨醇-月桂酸盐的缓冲液洗膜10次。然后，将膜置于含1μg/ml家兔抗小鼠IgG(H+L，affinipure，Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA)的封闭缓冲液中室温下孵育30分钟。随后，在1L上面所描述的缓冲液中洗膜，并且与100ml含有15μCi125I-蛋白A(ICN Biochemicals，CostaMesa，CA)的封闭缓冲液孵育1小时，并且用1L缓冲液冲洗。放射自显影显示放射性记号。实施例6 FGF-2的生物测定FGF-2的生物活性可用胸腺嘧啶核苷掺入法测定。如上面所描述的FGF-2转染的细胞孵育30小时。其间，将培养液换成6ml的含0.5％FBS(低血清培养液)的DMEM孵育16小时。去除培养液，4℃，微量离心管中离心15分钟澄清培养液。加入等量的裂解缓冲液和肝素-SepharoseCL-6B，混合物4℃下摇动孵育2小时。沉淀Sepharose并用解缓冲液洗3次，随后用HS-冲洗缓冲液(20mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，2mM EGTA，加蛋白酶抑制剂，0.5M NaCl)洗3次之后，用含有1M NaCl的HS-冲洗缓冲液洗3次。与Sepharose结合的蛋白用含3M NaCl的HS冲洗缓冲液洗脱。
如以前所描述的，DNA合成的刺激作用用静止的Swiss 3T3细胞(克隆NR-6)测定(Witte等，细胞生理学杂志，13786-94，1988；Florkiewiz和Sommer，美国国家科学院院报863978-3981，1989)。简言之，细胞以低密种植，用1ml含0.1％FBS的培养液培养72小时抑制细胞生长。直接向培养液中加入不同量的3M NaCl HS-洗脱物并且20-24小时后测定TCA可沉淀计数的[3H]-胸腺嘧啶核苷的掺入水平。作为对照，1pg～1ng的重组人FGF-2以相似的方式加到细胞上。实施例7用于抑制剂的高输出量筛选测定高输出量筛选测定在48孔形式中进行。此实施例中，表达FGF-2的COS细胞用输出抑制剂来筛选。
在转染的当天，亚融合至融合的细胞在用0.25％胰蛋白酶，37℃下处理5到10分钟后，将细胞移出培养瓶。离心收集脱离的细胞并用PBS洗1次。在DMEM培养液中重悬COS细胞至50,000个/ml。向细胞中加入DEAE-葡聚糖溶液中的质粒DNA(p18dx FGF)，使其终浓度为5μg/ml。这一浓度是根据用1标准方法的优化实验确定的。加入含有FGF-2DNA/DEAE-葡聚糖的溶液，然后37℃孵育30分钟。然后离心细胞并加入含100μM氯喹的培养液。随后去除氯喹，并且细胞以20,000个/孔种植在48孔组织培养板(Corning)上。细胞孵育48小时后，去除培养液并且加入碳酸钠溶液约1分钟。去除碳酸钠溶液，用含有0.5％FGS和25μg/ml肝素的培养液洗细胞。含有乌本苷或其它试验化合物的培养液以指定的浓度加入孔中并且孵育细胞20-24小时。
在加入乌本苷或其它试验化合物约20～24小时之后，用标准的ELISA方法测定细胞上清液中FGF-2的存在。简言之，96孔半区(COSTAR#369096)ELISA)培养板用30μg/ml抗FGF2单克隆抗体在37℃包被2小时。培养上清液样品用含蛋白酶抑制剂的等体积的缓冲液稀释，并把它加到ELISA板上2-6℃孵育过夜。然后洗培养孔孔，加入生物素酰化的抗FGF-2多克隆抗体(R&D系统)，随后加入链霉生物系-HRP和产色底物，根据FGF-2标准曲线来计算FGF2的量。
如图29A-29C所示，10种不同的小分子在1约10-15μM浓度抑制FGF-2的55-74％的输出。实施例8 用抑制剂处理后分泌的或胞质蛋白的检测如上面所描述的，用表达FGF-2，hCG-α或新霉素磷酸转移酶的质粒共转染COS细胞。除了在追踪期，以对数增长的10nM到1mM的浓度加入抑制剂之外，如上面所描述的进行代谢法标记。在追踪期末，收集并按上面所述处理细胞和细胞培养液用于免疫沉淀。
乌本苷和地高辛抑制FGF-2的输出，但不抑制hCG-α。乌本苷抑制50％输出的浓度约为0.1μM而地高辛约为5μM。进一步的实验表明抑制作用是时间依赖的，不影响hCG-α的分泌，并以剂量-依赖方式抑制FGF-2的输出。
试验了十种抑制FGF-2输出的小分子对hCG分泌的抑制作用。没有一种明显抑制hCG的分泌(图29A-29C)实施例9 FGF-2与Na+/K+ATP酶的关系用两个质粒表达载体的共转染COS细胞，其中一个载体编码18KDaFGF-2，另一个编码大鼠Na+/K+ATP酶α1同工型区分此ATP酶是否是转运装置的一种成分。编码大鼠Na+/K+ATP酶α1的质粒(pCMV/乌本苷)可购自PharMingen Inc.(cat #40002p)。转染48小时之后，用35S-蛋氨酸(Met)和半胱氨酸代谢法标记细胞15分钟，用含有过量(10mM)未标记的Cys和Met的培养液冲洗，然后孵育不同的时间长度。用豚鼠多克隆抗FGF-2免疫血清免疫沉淀细胞和相应的培养液成分。免疫复合物直接在Laemmli凝胶样品缓冲液中洗脱并用12％PAGE分级分离。
如所示的，大鼠Na+/K+ATP酶与18KDa FGF-2共同过量表达可干扰FGF-2输出(图2)。比较图2A中的FGF2(箭头)和图2B中的FGF-2。与对照的转染细胞(图B)相比，大鼠Na+/K+ATP酶的α1亚单位的共表达明显减慢FGF-2输出速率(图A)。作为参考，图A中最右端的泳道(S)表示14C-标记的蛋白分子量标准的位置并列出了它们的分子量(kDa)。
然而，FGF-2的输出没有完全被抑制(图3)。要使代谢法脉冲标记的FGF-2均等地分布于细胞和培养液组分之间需要多于12小时(图B)。通过24小时的标记，基本可定量输出。尽管1mM乌本苷可完全抑制来自仅仅FGF-2转染的COS细胞的输出，在标记后24小时，Na+/K+ATP酶α1共转染细胞的培养液可检测到明显数量的FGF-2。因为大鼠Na+/K+ATP酶α1同工型100倍抵抗乌本苷抑制作用，这些资料就进一步暗示有Na+/K+ATP酶的输出。这些资料还表明乌本苷不与作为FGF-2运输者的以前未鉴定细胞表面蛋白结合。如果是这样，那么过量表达就应该对FGF-2的输出无影响和/或对乌本苷的敏感性应该相同。
用FGF-2免疫血清将约110kDa蛋白条带(图2A中双箭头)与FGF-2共同免疫沉淀。在单独转染的或对照的非转染的细胞中没有检测到此条带并且此条带正是大鼠Na+/K+ATP酶α1的大小。用购自UpstateBiothechnology Inc.(cat # 05-369)的抗大鼠Na+/K+ATP酶α1单克隆抗体免疫沉淀代谢法标记的COS细胞提取物检测到相同的110kDa条带和另外一条约150kDa的条带(图4A)。将此凝胶使X-线胶片更长时间曝光时，也可检测出18kDa FGF条带(图4B)。IL-1α也可用来自相似的共转染COS细胞的大鼠Na+/K+ATP酶α1共同免疫沉淀(图4B)。然而，当免疫复合物从共表达的COS细胞用抗FGF免疫血清制备时检测不到150kDa条带。这表明150kDa条带可以是修饰的Na+/K+ATP酶α1或者是包含Na+/K+ATP酶α1的蛋白复合物。综合这些，共免疫沉淀表明FGF-2直接与Na+/K+ATP酶α1相互作用。这种相互作用是特定的，并不是去污剂裂解方法的后果，因为混和单独转染的细胞提取物，孵育49小时然后进行免疫沉淀时，检测不到复合物。
Western印迹杂交用于证实110kDa条带是Na+/K+ATP酶α1(图5)。从60mm培养皿的非转染细胞(泳道1)和pCMV乌本苷转染的COS细胞(泳道2)制备100μl的标准去污剂裂解缓冲液中的总的细胞提取液。60μl的此抽提液与20μl的4X浓缩的Laemmli凝胶加样缓冲液混合并在65℃加热20分钟。用12％PAGE分级分离样品并转移到硝酸纤维素膜支持物上。探针是上面描述的用于免疫沉淀实验的相同的抗大鼠Na+/K+ATP酶α1单克隆抗体。然而，此例中检测到内源性基因表达以及来自转染的基因表达的稳态水平，非转染的和pCMV乌本苷转染的COS细胞都含有约110kDa的免疫反应条带。检测到pCMV乌本苷转染的COS细胞此条带明显增加，也就是说，从那些细胞表达大鼠Na+/K+ATP酶α1。
从共转染的COS细胞共同免疫沉淀大鼠Na+/K+ATP酶α1是FGF-2特定的。图6-10表示了来自过量表达瞬时转染的细胞的一系列对照实验的结果。例如，用编码人绒毛膜促性腺素-α(hCGα)的质粒表达载体，很清楚地将hCG ER/Golgi依赖的分泌和FGF-2输出区分。而且，即使Na+/K+ATP酶α1亚单位和hCG在通过ER和Golgi细胞器转运过程中非常接近，hCG也不与Na+/K+ATP酶α1共同免疫沉淀(图6)。
除FGF-2的大量胞质蛋白已在瞬时转染的COS细胞中过量表达并保留代谢法标记脉冲实验中的相关细胞。这些蛋白包括新霉素磷酸转移酶(NPT)和β半乳糖苷酶(β-gal)。然而，当作为与18kDaFGF-2的嵌合体表达时，这两种蛋白都可被赋予输出表型。将FGF-2 NPT嵌合蛋白命名为FPT且FGF-2β-gal嵌合蛋白命名为F-gal。FPT和F-gal嵌合蛋白的输出可以对FGF-2相似的方式被乌本苷抑制。因此，更具体地试验了FPT嵌合蛋白与来自共转染的COS细胞的Na+/K+ATP酶共同免疫沉淀的能力(图7-9)。资料表明，FPT与Na+/K+ATP酶α1相互作用并被共同免疫沉淀。与之相反，不管用哪种抗体或免疫血清，真正的NPT不与Na+/K+ATP酶α1共同免疫沉淀。F-gal嵌合蛋白有同样的结果。图10和11中，用编码Na+/K+ATP酶α亚单位和FGF-2或用FGF-2加VSVG嵌合蛋白的质粒共转染COS细胞。
除了α1亚单位与FGF-2相互作用，α2和α3同工型也与FGF-2结合。α2和α3同工型在如上面所描述的转染的COS细胞中以4∶1的比率与FGF-2共表达。如图13-16所见，α2和α3干扰FGF-2的输出。同样，也检测到约110kDa的一种蛋白；这是α2和α3亚单位期望的大小。
用抗α2或抗α3抗体从代谢法标记的共同转染的COS细胞制备的免疫复合物显示FGF-2大小的蛋白条带(图16)。实施例10 IL-1输出的乌本苷敏感性含有IL-1α基因的载体被转染进入COS细胞，代谢法标记细胞并用抗IL-1α抗体沉淀蛋白。如图12、17、19和21所见，IL-1α被输出到培养液组分(M)中。这种输出被与5mM乌本苷孵育所抑制(图18，20和21)。与FGF-2输出相比，IL-1的输出率更慢，T12长于24小时。然而，象FGF-2，输出对乌本苷敏感。另外，IL-1α可用抗-α1亚单位抗体从共转染的COS细胞(用IL-1α和Na+/K+ATP酶α1亚单位转染的)中免疫沉淀(图4)。实施例11 铷摄取测定法测定Na+/K+ATP酶的离子转运能力可用铷摄取测定法在存在或不存在抑制剂时测定Na+/K+ATP酶的离子转运能力。
此测定方法中，表达Na+/K+ATP酶的细胞在存在抑制剂下生长。突变的大鼠α2同工型，即所指的大鼠α2*，通过在第一个细胞内功能区边缘的L111R和N122D的取代而被修饰。这使得大鼠α2*对乌本苷具有抵抗性(IC50约为50μM)。定点诱变用于在位置327进一步造成突变。
野生型COS细胞、Hela细胞和大鼠α2*突变体转染的Hela细胞在含10％小牛血清、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素，250ng/ml两性霉素B的DMEM培养液中，37℃、5％CO2下培养。86Rb来自DuPont-NewEngland Nuclear.放射比活性约为2-10mCi/mg。乌本苷和速尿来自Calbiochem或Sigma。
天然的Hela或用大鼠α2*转染的细胞以3x104个/孔的密度种植于24孔组织培养板(1ml/孔)。大鼠α2*转染的细胞在有或无1μM抑制剂下生长以检查表现内源性和转染的离子通道活性的细胞中或者只用那些表现转染的活性的细胞中乌本苷剂量反应。孵育细胞至80％融合，然后用PBS(135mM NaCl，3.5mM KCl.0.5mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM葡萄糖，6.5mM Na2HPO4，1.5mMKH2PO4)冲洗，并进一步用含有指定的抑制浓度的PBS 37℃孵育30分钟。然后加入86Rb约2μCi/ml，37℃孵育10分钟，86Rb的浓度范围典型地为2-15μM。将培养板浸入冰冷的0.9％NaCl和5mM HEPES，pH7.4的溶液中止孵育。然后，用此溶液冲洗8次。总的冲洗时间小于1分钟。用0.5ml 0.2N NaOH抽提细胞1小时，然后在计数前用HCl中和。用86Rb 97％有效率的Packard Tricarb LiquidScintillation Analyzer，Model 2000 CA进行样品计数。实施例12 GST-FGF2融合蛋白的构建和相互作用的蛋白的鉴定此实施例中，构建了谷胱苷肽S-转移酶(GST)与FGF-2的融合基因。然后将融合蛋白进行亲和柱层析以鉴定与FGF-2相互作用的蛋白或蛋白复合物。
制备了编码FGF-2 18kDa同工型(pGEXF18)的表达载体。通过扩增编码18kDa FGF-2的序列和将扩增的片段插入pGEX-4T-3的NotI位点来构建pGEXF18质粒(pharmacia，Uppsala，Sweden)。用于扩增的模板是只编码FGF-2 18kDa同工型的p18dx(见实施例1)。正向扩增引物(SEQ ID NO20)是5′-AAGGACAGAAGCGGCCGCGGGACCATGGCAG-3′，逆向扩增引物(SEQ ID NO21)是5′-AAGGACAGAAGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGCCATTGG-3′扩增条件是94℃ 5分钟，45℃ 5分钟，72℃ 1分钟循环2次；94℃ 1分钟，45℃ 1分钟，72℃ 1分钟循环4次；94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟循环25次；72℃ 10分钟循环1次。
用IPTG(0.2mM)诱导含有GST-FGF-2表达质粒的细菌(例如，DH5α或BL21)3小时。制备提取物并按生产商所描述的用谷胱苷肽-Sepharose纯化GST-FGF-2融合蛋白。用10mM的谷胱苷肽从谷胱苷肽珠洗脱纯化的融合蛋白。
COS细胞(100m培养皿中80％融合)在含有100μCi/ml的35S-trans标记(ICN，Irvine，CA)的无半胱氨酸/蛋氨酸的DMEM培养液中代谢法标记4小时。标记之后，用含有25mM Tris，pH8.0，150mM NaCl的缓冲液洗细胞单层一次。如所描述的(Kaelin等，细胞64521-532，1991)，用2.0ml NETN缓冲液(20mM Tris pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％ NP40)裂解细胞。将细胞提取物4℃微量离心15分钟以澄清不溶物质。其它细胞类型可替代COS细胞，以及其它野生型和突变体GST融合蛋白也可应用。
用含NETN的缓冲液中纯化的GST-FGF融合蛋白(25μg)和0.5％粉末化的牛奶4℃摇动30分钟，使谷胱苷肽-Sepharose珠(100μl)带电荷。代谢法标记的COS细胞的提取物(0.5ml)与25μl的带电荷珠4℃下孵育1小时。离心沉淀带有结合蛋白的Sepharose珠并用冷的NETN缓冲液洗4次。结合的蛋白在SDS-Laemmli凝胶加样缓冲液中洗脱并70℃孵育20分钟。洗脱的蛋白在12％-PAGE上分级分离(图22)。相对应于只结合对照GST的代谢法标记的COS细胞蛋白条带(GST 4T)和对照无关GST融合蛋白(GST R2)的泳道中检测到非特异性背景。然而，至少4种明显的COS细胞蛋白显示与GST FGF-2特异性结合。鉴定的蛋白条带可代表直接的相互作用或相互作用的蛋白复合物。用GST 18kDa FGF-2检测到的COS细胞蛋白条带约为35、45/50、和70kDa。所有实例中检测到的蛋白条带型式是可复制的。另外，此时没有鉴定很大的蛋白或蛋白复合物。实施例13 FGF1融合蛋白的构建构建了几种融合蛋白，其中有，FGF1或者全长或者片段在N末端与GST融合或在C末端与肽标签融合。
FGF-1设计者基因克隆，BBG21(R&D Systems，Minneapolis，MN)不编码全长野生型蛋白。它在野生型初级翻译产物的N-末端缺少14个氨基酸。全长的野生型FGF-1从质粒BBG21(R&D Systems)制备。根据该序列，正向扩增引物(SEQ ID NO22)是5′-CTAGGGATCCACCATGGCCGAGGGCGAAATTACAACA-TTCACCGCCCTCACCGAAAAGTTTAATCTGCCTCCCGG-3′野生型FGF-1反向扩增引物(SEQ ID NO23)是5′-GATCGAATTCTCAATCAGAAGAAGCTGGCAG-3′正向引物再产生下列N-端氨基酸AEGEITTFTALTEK(SEQ IDNO24)。设计此引物组用于插入pcDNAIII(Invitrogen，La Jolla，CA)的BamHI/EcoRI位点。这个载体可在哺乳动物细胞中表达，包括在COS细胞中瞬时过量表达。设计扩增的产物使之具有优选的用于启动翻译的前后序列。另外，相同的扩增产物和限制性位点与GST形成框内的N-端融合(pGEX-4T-3)。扩增条件是94℃ 1分钟循环一次；94℃ 45秒，48℃ 45秒，72℃ 1分钟循环8次；94℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 1分钟循环25次；72℃ 5分钟循环1次。
为有另外的抗体选择用于免疫沉淀全长和/或N端截短的FGF-1，FGF-1还与编码被商业上可获得的抗体识别的肽标签的C端序列融合。C端附加表位包括flg肽DYKDDDDK(SEQ ID NO35)和流感血细胞凝集素(HA)肽YPYDVPDYA(SEQ ID NO36)。将HA附加表位加到FGF-1上的反向扩增引物序列(SEQ ID NO25)是5′-CTAGTCTAGATCAGGCGTAGTCGGGCACG-TCGTATGGGTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3′将flg附加表位加到FGF-1的反向引物(SEQ ID NO26)是5′-GATCGAATTCTCACTTGTCATCGTCGTCCTT-GTAGTCACGCGTATCAGAAGAGACTGGCAG-3′.
这两例中，正向引物如上面所描述的。扩增条件是94℃ 1分钟循环1次；94℃ 45秒，48℃ 45秒，72℃ 1分钟循环8次；94℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 1分钟循环25次；72℃ 5分钟循环1次。实施例14 HIV TAT融合蛋白的构建85个氨基酸和72个氨基酸的tat基因产物都是与C-端附加表位序列融合而得以构建。用于Tat85的模板是BBG34(R&D Systems；Minneapolis，MN)，用于Tat 72的模板是pSV2 tat 72。为亚克隆HIV Tat72或TAT85，正向扩增引物(SEQ ID NO27)是5′-CTAGGGATCCACCATGGAACCAGTCGACC-3′用于野生型Tat 85的反向引物(SEQ ID NO28)是5′-GATCGAATTCTCATTCCTTAGGACCTGTCGG-3′编码C-端HA-附加表位的反向引物(SEQ ID NO29)是5′-CTAGTCTAGATCAGGCGTAGTCGGGCACG-TCGTATGGGTATTCCTTAGGACCTGTCGG-3′用于Tat 72反向引物(SEQ ID NO30)是5′-CTAGGAATTCAGATCACTGTTTAGACAGAG-3′编码C-端flg标签的反向引物(SEQ ID NO31)是5′-CTGAGAATTCTCACTTGTCATCGTCGTC-CTTGTAGTCCTGTTTAGACAGAGAAACC-3′用于Tat 72和C-端HA-标签的反向引物(SEQ ID NO32)是5′-CTGAGAATTCTCAGGCGTAGTCGGGCACGT-CGTATGGGTACTGTTTAGACAGAGAAACCTG-3′扩增野生型Tat 85和Tat 85 HA-标签的反应条件是94℃1分钟循环1次；94℃45秒，52℃45秒，72℃1分钟循环8次；94℃45秒，65℃45秒，72℃1分钟循环25次；72℃5分钟循环1次。用上面引物扩增Tat 72的反应条件是94℃1分钟循环1次；94℃45秒，52℃45秒，72℃1分钟循环8次；94℃45秒，65℃45秒，72℃1分钟循环25次；72℃5分钟循环1次。用于扩增带flg标签的Tat 72的扩增条件是94℃1分钟1个循环；94℃45秒，50℃45秒，72℃1分钟循环8次；94℃45秒，65℃45秒，72℃1分钟循环28次；72℃5分钟循环1次。用于扩增Tat 72HA-标签的条件是94℃1分钟循环1次；94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟循环8次；94℃45秒，70℃45秒，72℃1分钟循环28次；72℃5分钟循环1次。实施例15构建IL-1α融合蛋白用编码成熟人IL-1α的载体转染细胞。如上面所描述的，制备pGEX4T-3中的一个亚克隆以检测与成熟的IL-1α结合的细胞相关蛋白。正向PCR引物(SEQ ID NO33)是5′-CTAGGGATCCACCAT-GAGGATCATCAAATACGAATTC-3′反向PCR引物(SEQ ID NO34)是5′-GCACTTCTCGAGCTACGCCTGGTTTTCCAGTATC3′PCR扩增条件是94℃1分钟1个循环；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分钟8个循环；94℃45秒，70℃45秒，72℃1分钟25个循环；72℃5分钟1个循环。
IL-1α和FGF-2都以乌本苷敏感的方式从转染的COS细胞中输出。因此可比较COS细胞中表现出的每种无前导序列蛋白的结合蛋白的特征以确定它们是普通的和/或特殊的蛋白。另外，IL-1α将在啮齿类动物吞噬细胞系P388D1中表达。相似的方法可用于IL-1β。实施例16构建VSV N基因产物融合蛋白在pGEX4T-3载体中制备GST-VSV N基因产物的融合。图23-28显示的资料表明瞬时转染的COS细胞中表达的VSV N蛋白可在条件培养液中被检测到。N蛋白不含疏水的信号肽序列并由此预测它位于胞质中。家兔抗VSV多克隆被用于从代谢法标记的细胞中沉淀N蛋白。如此处所示的，N蛋白是以抗乌本苷的(图24，27)ATP-依赖的(图25)和ER/Golgi-非依赖性(图26)的时间依赖方式(图23)在细胞外检测到的。实施例17构建FGF-2诱变剂用Na+/K+ATP酶的α亚单位剖分FGF-2的接触位点是通过构建FGF-2的突变蛋白并评定突变对FGF-2输出的影响来进行的。
起始的构建体，被称为PSSK+FGF-2，是通过连接含有来自p18dx的FGF-2的XhoI片段进入pBSSK+的XhoI位点而产生的。用试剂盒(Chameleon1M双链定点诱变试剂盒；Stratagene Cloning Systems SanDiego，CA)来完成诱变。简言之，设计的诱变的和筛选引物是(a)25-45个碱基长且突变的两侧有10-15个碱基；(b)至少40％的G+C含量。和(c)终止在1个或多个Gs或Cs。磷酸化引物并且与模板DNA以100∶1的摩尔比通过煮沸5分钟、冰上猝灭、然后室温孵育30分钟退火。延伸引物并用T7DNA聚合酶，T4DNA连接酶和单股结合蛋白连接引物。连接酶是热灭活的并且用仅仅切割亲代质粒的限制性酶消化反应混合物(含有质粒的突变体用筛选引物去除了限制性位点)。突变体质粒转化进入XLmutS感受态细胞。转化的细胞生长在液体培养中。恢复来自转化体的DNA并用筛选限制性酶再次消化。未切割的质粒用来转染XL1-Blue感受态细胞。约70％或更多的克隆含有诱变处理的质粒。选择个别的克隆并且分离质粒DNA。用限制性消化和DNA序列分析证实突变体。
构建了下面的FGF-2突变体Ser5 → Val Glu108 → Pro，Ala Ser122 → TrpTyr33 → Ala，Leu Tyr112 → Ala Lys128 → Asp，ProArg53 → Trp，Ile Tyr115 → Ala Arg129 → Glu，LeuSer73 → Trp，Val，Thr Ser117 → Ala Lys134 → ThrCys78 → Ser Arg118 → Ile Lys144 → ValCys96 → Ser Tyr120 → Ala Met151 → ArgGlu105→ Pro，Lys Thr121 → Pro Ser152 → Val，Trp每种突变体的阳性克隆通过XhoI位点亚克隆回到p18dx。这些克隆在COS细胞中表达并且通过用此处所描述的Tran35S Label(ICN，IrvineCA)代谢法标记来测定。下面列出了这些突变蛋白中一些的结果。

另外，下面列出了细胞内区域化的和输出的野生型FGF-2和一些突变蛋白的相对数量。7小时时，所有FGFs的输出被乌本苷抑制。

根据前面所述，尽管是为说明的目的在此已描述了本发明的特定的实施方案，但在不偏离本发明的精神和范围的情况下，作不同的改良是可理解的。因此，除了所附加的权利要求，本发明不是局限的。
序列表(1)基本信息(i)申请人Florkiewicz，Robert Z.
Baird，Andrew(ii)发明名称无前导序列蛋白输出的抑制剂(iii)序列数36(iv)联系地址(A)收信人SEED and BERRY LID(B)街道6300 Columbia Center，701 Fifth Avene(C)城市Seattle(D)州名Washington(E)国家美国(F)邮政编号98104(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(v)目前申请资料(A)申请号(B)递交日1998年2月25日(C)分类(vii)律师/代理人信息(A)名称Nottenburg Ph.D.，Carol(B)登记号39,317(C)参考/著录号760100.418PC(vii)电信信息(A)电话(206)622-4900
(F)传真(206)682-6031(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1120个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCGCCGCGG CCCGGCGGGT GCCAGATTAG CGGACGCGTG CCCGCGGTTG CAACGGGATC 60CCGGGCGCTG CAGCTTGGGA GGCGGCTCTC CCCAGGCGGC GTCCGCGGAG ACACCCATCC 120GTGAACCCCA GGTCCCGGGC CGCCGGCTCG CCGCGCACCC AGGGGCCGGC GGACAGAAGA 180GCGGCCGAGC GGCTCGAGGC TGGGGGACCG CGGGCGCGGC CGCGCGCTGC CGGGCGGGAG 240GGCTGGGGGG CCGGGGCCGG GGCCGTGCCC CGGAGCGGGT CGGAGGCCGG GGCCGGGGCC 300GGGGGACGGC GGCTCCCCGC GGCGGCTCCA GCGGCTCGGG GATCCCGGCC GGGCCCCGCA 360GGGACCATGG CAGCCGGGAG CATCACCACG CTGCCCGCCT TGGCCCGAGG ATGGCGGCAG 420CGGCGGCTTC CCGCCCGGCC ACTTCAAGGA CCCCAAGCGG CTGTACTGCA AAAACGGGGG 480CTTTCTTCCT GCGCATCCAC CCCGACGGCC GAGTTGACGG GGTCCGGGAG AAGAGCGACC 540CTCACATCAA GCTACAACTT CAAGGCAGAA GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG 600TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGAA GATGGAAGAT TACTGGGCTT CTAAATGTGT 660TACGGATGAG TGTTTCTTTT TTGAACGATT GGAATCTAAT AACTACAATA CTTACCGGTC 720AAGGAAAATA CACCAGTTGG TATGTGGCAC TGAAACGAAC TGGGCAGTAT AAACTTGGAT 780CCAAAACAGG ACCTGGGCAG AAAGCTAATA CTTTTTCTTC CAATGTCTGC TAAGAGCTGA 840TTTTAATGGC CACATCTAAT CTCATTTCAC ATGAAAGAAG AAGTATATTT TTAGAAATTT 900GTTAATGAGA GTAAAAGAAA ATAAATGTGT ATAGCTCAGT TTGGATAATT GGTCAAACAA 960TTTTTTATCC CAGTAGTAAA ATATGTAACC ATTGTCCCAG TAAAGAAAAA TAACAAAAGT 1020TGTAAAATGT ATATTCTCCC TTTTATATTG GCATCTGCTG TTACCCAGTG AAGCTTACCT 1080AGAGCATGAT CTTTTCACGC ATTTGCTTAT CGAAAGAGCT1120(2)关于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征
(A)长度477个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置10..474(xi)序列描述SEQ ID NO2CGCAGGACC ATG GCA GCC GGG AGC ATC ACC ACG CTG CCC GCC TTG CCC 48Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro1 5 10GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC CAC TTC AAG GAC CCC 96Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro15 20 25AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC CTG CGC ATC CAC CCC 144Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro30 35 40 45GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC GAC CCT CAC ATC AAG 192Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys50 55 60CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG TCT ATC AAA GGA GTG 240Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val65 70 75TGT GCT AAC CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA AGA TTA CTG GCT 288Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala80 85 90TCT AAA TGT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA CGA TTG GAA TCT 336Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser95 100 105AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC ACC AGT TGG TAT GTG 384Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val110 115 120 125GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA TCC AAA ACA GGA CCT 432Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro130 135 140GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT GCT AAG AGC 474Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155TGA 477(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度155个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65 70 75 80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度351个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..348(xi)序列描述SEQ ID NO4ATG GAT TAC TAC AGA AAA TAT GCA GCT ATC TTT CTG GTC ACA TTG TCG 48Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser1 5 10 15GTG TTT CTG CAT GTT CTC CAT TCC GCT CCT GAT GTG CAG GAT TGC CCA 96Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro20 25 30GAA TGC ACG CTA CAG GAA AAC CCA TTC TTC TCC CAG CCG GGT GCC CCA144Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro35 40 45ATA CTT CAG TGC ATG GGC TGC TGC TTC TCT AGA GCA TAT CCC ACT CCA192Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro50 55 60CTA AGG TCC AAG AAG ACG ATG TTG GTC CAA AAG AAC GTC ACC TCA GAG240Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu65 70 75 80TCC ACT TGC TGT GTA GCT AAA TCA TAT AAC AGG GTC ACA GTA ATG GGG288Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly85 90 95GGT TTC AAA GTG GAG AAC CAC ACG GCG TGC CAC TGC AGT ACT TGT TAT336Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr100 105 110TAT CAC AAA TCT TAA351Tyr His Lys Ser115(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度116个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser1 5 10 15Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro20 25 30Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro35 40 45Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro50 55 60Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu65 70 75 80Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly85 90 95Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr100 105 110Tyr His Lys Ser115(2)关于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度816个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1.813(xi)序列描述SEQ ID NO6ATG GCC AAA GTT CCA GAC ATG TTT GAA GAC CTG AAG AAC TGT TAC AGT48Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser1 5 10 15GAA AAT GAA GAA GAC AGT TCC TCC ATT GAT CAT CTG TCT CTG AAT CAG96Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30AAA TCC TTC TAT CAT GTA AGC TAT GGC CCA CTC CAT GAA GGC TGC ATG144Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met35 40 45GAT CAA TCT GTG TCT CTG AGT ATC TCT GAA ACC TCT AAA ACA TCC AAG192Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys50 55 60CTT ACC TTC AAG GAG AGC ATG GTG GTA GTA GCA ACC AAC GGG AAG GTT240Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val65 70 75 80CTG AAG AAG AGA CGG TTG AGT TTA AGC CAA TCC ATC ACT GAT GAT GAC288Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp85 90 95CTG GAG GCC ATC GCC AAT GAC TCA GAG GAA GAA ATC ATC AAG CCT AGG336Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110TCA GCA CCT TTT AGC TTC CTG AGC AAT GTG AAA TAC AAC TTT ATG AGG384Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg115 120 125ATC ATC AAA TAC GAA TTC ATC CTG AAT GAC GCC CTC AAT CAA AGT ATA432Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile130 135 140ATT CGA GCC AAT GAT CAG TAC CTC ACG GCT GCT GCA TTA CAT AAT CTG480Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu145 150 155 160GAT GAA GCA GTG AAA TTT GAC ATG GGT GCT TAT AAG TCA TCA AAG GAT528Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp165 170 175GAT GCT AAA ATT ACC GTG ATT CTA AGA ATC TCA AAA ACT CAA TTG TAT576Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr180 185 190GTG ACT GCC CAA GAT GAA GAC CAA CCA GTG CTG CTG AAG GAG ATG CCT624Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp G1n Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro195 200 205GAG ATA CCC AAA ACC ATC ACA GGT AGT GAG ACC AAC CTC CTC TTC TTC672Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe210 215 220TGG GAA ACT CAC GGC ACT AAG AAC TAT TTC ACA TCA GTT GCC CAT CCA720Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro225 230 235 240AAC TTG TTT ATT GCC ACA AAG CAA GAC TAC TGG GTG TGC TTG GCA GGG768Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly245 250 255GGG CCA CCC TCT ATC ACT GAC TTT CAG ATA CTG GAA AAC CAG GCG813Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala260 265 270TAG816(2)关于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度271个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser1 5 10 15Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met35 40 45Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys50 55 60Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val65 70 75 80Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp85 90 95Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg115 120 125Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile130 135 140Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu145 150 155 160Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp165 170 175Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr180 185 190Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro195 200 205Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe210 215 220Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro225 230 235 240Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly245 250 255Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala260 265 270(2)关于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度480个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置43..477(xi)序列描述SEQ ID NO8TCAGCACCTT TTAGCTTCCT GAGCAATGTG AAATACAACT TT ATG AGG ATC ATC54Met Arg Ile Ile1AAA TAC GAA TTC ATC CTG AAT GAC GCC CTC AAT CAA AGT ATA ATT CGA 102Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg5 10 15 20GCC AAT GAT CAG TAC CTC ACG GCT GCT GCA TTA CAT AAT CTG GAT GAA 150Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu25 30 35GCA GTG AAA TTT GAC ATG GGT GCT TAT AAG TCA TCA AAG GAT GAT GCT 198Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala40 45 50AAA ATT ACC GTG ATT CTA AGA ATC TCA AAA ACT CAA TTG TAT GTG ACT 246Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr55 60 65GCC CAA GAT GAA GAC CAA CCA GTG CTG CTG AAG GAG ATG CCT GAG ATA 294Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile70 75 80CCC AAA ACC ATC ACA GGT AGT GAG ACC AAC CTC CTC TTC TTC TCG GAA 342Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu85 90 95 100ACT CAC GGC ACT AAG AAC TAT TTC ACA TCA GTT GCC CAT CCA AAC TTG 390Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu105 110 115TTT ATT GCC ACA AAG CAA GAC TAC TGG GTG TGC TTG GCA GGG GGG CCA438Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro120 125 130CCC TCT ATC ACT GAC TTT CAG ATA CTG GAA AAC CAG GCG TAG480Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala135 140 145(2)关于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度145个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln1 5 10 15Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His20 25 30Asn Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser35 40 45Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln50 55 60Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu65 70 75 80Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu85 90 95Phe Phe Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala100 105 110H1s Pro Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu115 120 125Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln130 135 140Ala145(2)关于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度810个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..807(xi)序列描述SEQ ID NO10ATG GCA GAA GTA CCT GAG CTC GCC AGT GAA ATG ATG GCT TAT TAC AGT 48Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser1 5 10 15GGC AAT GAG GAT GAC TTG TTC TTT GAA GCT GAT GGC CCT AAA CAG ATG 96Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met20 25 30AAG TGC TCC TTC CAG GAC CTG GAC CTC TGC CCT CTG GAT GGC GGC ATC144Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile35 40 45CAG CTA CGA ATC TCC GAC CAC CAC TAC AGC AAG GGC TTC AGG CAG GCC192Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala50 55 60GCG TCA GTT GTT GTG GCC ATG GAC AAG CTG AGG AAG ATG CTG GTT CCC240Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro65 70 75 80TGC CCA CAG ACC TTC CAG GAG AAT GAC CTG AGC ACC TTC TTT CCC TTC288Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe85 90 95ATC TTT GAA GAA GAA CCT ATC TTC TTT GAC ACA TGG GAT AAC GAG GCT336Ile Phe Glu 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Thr Trp Asp Asn Glu Ala100 105 110Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp115 120 125Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala130 135 140Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met145 150 155 160Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu165 170 175Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp180 185 190Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys195 200 205Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn210 215 220Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr225 230 235 240Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly245 250 255Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser260 265(2)关于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度462个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..459(xi)序列描述SEQ ID NO12GCA CCT GTA CGA TCA CTG AAC TGC ACG CTC CGG GAC TCA CAG CAA AAA 48Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys1 5 10 15AGC TTG GTG ATG TCT GGT CCA TAT GAA CTG AAA GCT CTC CAC CTC CAG 96Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln20 25 30GGA CAG GAT ATG GAG CAA CAA GTG GTG TTC TCC ATG TCC TTT GTA CAA144Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln35 40 45GGA GAA GAA AGT AAT GAC AAA ATA CCT GTG GCC TTG GGC CTC AAG GAA192Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu50 55 60AAG AAT CTG TAC CTG TCC TGC GTG TTG AAA GAT GAT AAG CCC ACT CTA240Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu65 70 75 80CAG CTG GAG AGT GTA GAT CCC AAA AAT TAC CCA AAG AAG AAG ATG GAA288Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu85 90 95AAG CGA TTT GTC TTC AAC AAG ATA GAA ATC AAT AAC AAG CTG GAA TTT336Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe100 105 110GAG TCT GCC CAG TTC CCC AAC TGG TAC ATC AGC ACC TCT CAA GCA GAA384Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu115 120 125AAC ATG CCC GTC TTC CTG GGA GGG ACC AAA GGC GGC CAG GAT ATA ACT432Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr130 135 140GAC TTC ACC ATG CAA TTT GTG TCT TCC TAA462Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150(2)关于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度153个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys1 5 10 15Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln20 25 30Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln35 40 45Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu50 55 60Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu65 70 75 80Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu85 90 95Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe100 105 110Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu115 120 125Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr130 135 140Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150(2)关于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度454个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO14ATGGCCGAGG GCGAAATTAC AACATTCACC GCCCTCACCG AAAAGTTTAA TCTGCCTCCC 60GGGAATTACA AGAAGCCCAA ACTCCTCTAC TGCAGCAACG GGGGCCACTT CCTGAGGATT120CTTCCGGATG GCACAGTGGA TGGGACAAGG GACAGGAGCC GACCAGCACA TTCAGCTGCA180ACTCAGTGCG GAAAGCGTGG GGGAGGTGTA TATAAAGAGT ACCGAGACTG GCCAGTACTT240TGGCAATGGA CACCGACGGG CTTTTATACG GCTCACAGAC ACCAAATGAG GAATGTTTGT300TCCTGGAAAG GCTGGAGGAG AAACCATTAC AACACCTATA TATCCAAGAA GCATGCAGAG360AAGAATTGGT TTGTTGGCCT CAAGCGGTCC TCGGACTCAC TATGGCCAGA AAGCAATCTT420GTTTCTCCCC CTGCCAGTCT CTTCTGATTA ATAA454(2)关于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度156个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe1 5 10 15Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser20 25 30Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly35 40 45Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu50 55 60Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Tyr65 70 75 80Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn85 90 95Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr100 105 110Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys115 120 125Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys130 135 140Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp145 150 155(2)关于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度221个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID N016ATGGAACCGG TCGACCCGCG TCTGGAACCA TGGAAACACC CCGGGTCCCA GCCGAAAACC 60GCGTGCACCA ACTGCTACTT GCAAAAAATG CTGCTTCCAC TGCCAGGTTT GCTTCATCAC120CAAAGCCCTA GGTATCTCTT ACGGCCGTAA AAAACGTCGT TCAGCGACGT CGTCCGCCGC180AGGGATCCCA GACCCACCAG GTTTCTCTGT CTAAACAGTG A22l(2)关于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度72个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO17Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln65 70(2)关于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度263个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO18ATGGAACCAG TCGACCCTAG ACTGGAACCG TGGAAACACC CGGGTTCCCA GCCGAAAACT 60GCATGCACCA ACTGTTACTG TAAAAAGTGT TGCTTCCACT GTCAAGTTTG TTTCATCACC120AAGGCTTTGG GTATCTCCTA CGGTCGTAAG AAACGTAGAA CAGCGCAGAC GTCCACCGCA180AGGTTCTCAG ACTCATCAAG TTTCCTTGTC CAAGCAACCG ACCTCCCAAT CTCGCGGTGA240ACCCGACAGG TCCTAAGGAA TAG263(2)关于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度86个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO19Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu85(2)关于SEQ ID 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NO27的信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO27CTAGGGATCC ACCATGGAAC CAGTCGACC 29(2)关于SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO28GATCGAATTC TCATTCCTTA GGACCTGTCG G 31(2)关于SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度58个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO29CTAGTCTAGA TCAGGCGTAG TCGGGCACGT CGTATGGGTA TTCCTTAGGA CCTGTCGG 58(2)关于SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO30CTAGGAATTC AGATCACTGT TTAGACAGAG 30(2)关于SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度56个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO31CTGAGAATTC TCACTTGTCA TCGTCGTCCT TGTAGTCCTG TTTAGACAGA GAAACC56(2)关于SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度61个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO32CTGAGAATTC TCAGGCGTAG TCGGGCACGT CGTATGGGTA CTGTTTAGAC AGAGAAACCT60G61(2)关于SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO33CTAGGGATCC ACCATGAGGA TCATCAAATA CGAATTC 37(2)关于SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO34GCACTTCTCG AGCTACGCCT GGTTTTCCAG TATC34(2)关于SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO35Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5(2)关于SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线型(xi)序列描述SEQ ID NO36Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 权利要求
1.一种抑制无前导序列蛋白从细胞输出的方法，包括用有效量的抑制无前导序列蛋白和转运分子之间结合的抑制剂作用于输出无前导序列蛋白的细胞。
2.权利要求1的方法，其中无前导序列蛋白选自FGF-1、FGF-2、IL-1α、IL-1β、CNTF和HIM-tat。
3.权利要求1的方法，其中无前导序列蛋白是FGF-2。
4.权利要求1的方法，其中无前导序列蛋白是IL-1α。
5.权利要求1的方法，其中转运分子是Na+/K+ATP酶。
6.权利要求1的方法，其中转运分子是Na+/K+ATP酶α亚单位或含有Na+/K+ATP酶α亚单位的复合物。
7.权利要求1的方法，其中转运分子选自Ca2+中ATP酶、H+/K+ATP酶、Na+通道、C1-通道和K+通道。
8.一种抑制FGF-2从细胞输出的方法，包括用有效量的抑制FGF-2和转运分子之间结合的抑制剂作用于输出FGF-2的细胞，从而是抑制FGF-2输出。
9.权利要求8的方法，其中转运分子是Na+/K+ATP酶。
10.权利要求8的方法，其中转运分子是Na+/K+ATP酶的α亚单位或含有Na+/K+ATP酶α亚单位的复合物。
11.无前导序列蛋白从细胞输出的抑制剂，其中抑制剂(a)抑制无前导序列蛋白的输出；(b)不抑制含前导序列蛋白的分泌，并且(c)抑制无前导序列蛋白和转运分子之间的结合。
12.权利要求11的抑制剂，其中无前导序列蛋白是FGF-2。
13.权利要求11的抑制剂，其中无前导序列蛋白是IL-1α。
14.权利要求11的抑制剂，其中转运蛋白是Na+/K+ATP酶。
15.一种治疗血管发生的方法，包括用治疗有效量的根据权利要求11-14所述的无前导序列蛋白输出的抑制剂作用于内皮细胞，从而治疗血管发生。
16.权利要求15的方法，其中无前导序列蛋白是FGF-2。
17.一种治疗再狭窄的方法，包括用治疗有效量的根据权利要求11-14所述的无前导序列蛋白输出的抑制剂作用于平滑肌细胞，从而治疗再狭窄。
18.权利要求17的方法，其中无前导序列蛋白是FGF-2。
19.一种检测无前导序列蛋白的方法，包括(a)将以低复数表达cDNA融合蛋白的cDNA表达文库转染或转化入宿主细胞；(b)在抑制剂分泌的情况下培养宿主细胞；(c)在细胞上清液中检测cDNA融合蛋白；并且(d)确定此cDNA是无前导序列蛋白的cDNA。
20.权利要求19的方法，其中cDNA融合蛋白与报告或标签序列融合。
21.一种检测无前导序列蛋白的转运分子的方法，包括(a)用无前导序列蛋白和标签的融合蛋白与含转运分子的细胞提取物或细胞膜相互作用以形成与转运分子结合的融合蛋白复合物。(b)分离复合物；且(c)检测复合物中的转运分子。
22.权利要求21的方法，其中标签是谷胱苷肽-S-转移酶或其结合谷胱苷肽的片段。
23.权利要求21的方法，其中检测步骤是变性凝胶电泳。
24.无前导序列蛋白从细胞输出的抑制剂，选自N-苯甲酰甲基-N-苯基三氟甲基磺酰胺、阿的平、刺囊酸、N，N’-D1-(2，4-二氨基苯基间苯二甲酰胺、2-苯甲酰胺-3-羧基-4，5，6，7-环己烯基[b]噻吩、N，N’-D1-(4-二甲氨基-亚苄基)肼、6-亚戊基氨基嘌呤、D1-)4-环己基氧乙氧基羰基氨基苯基)甲烷、2-(叔-丁氨基磺酰基-3-苯基丙烯酸、乙酯、2-苄氧基羰基-5-[(2，2-二乙氧基羰基)亚乙基]吡喃酮及其衍生物和类似物。
25.权利要求24的抑制剂，其中无前导序列蛋白是FGF-2。
26.权利要求1的方法，其中抑制剂选自N-苯甲酰甲基-N-苯基三氟甲基磺酰胺、阿的平、刺囊酸、N，N，-D1-2，4-二氨基苯基间苯二甲酰胺、2-苯甲酰胺-3-羧基-4，5，6，7-环己烯基[b]噻吩，N，N’-D1-(4-二甲氨基亚苄基)肼、6-亚戊基氨基嘌呤、D1-(4-环己基氧乙氧基羰基氨基苯基)甲烷、2-(叔-丁氨基磺酰基-3-苯基丙烯酸、乙酯、2-苄氧基羰基-5[(2，2-二乙氧基羰基)亚乙基]吡喃酮及其衍生物和类似物。
27.权利要求1的方法，其中抑制剂是N-苯甲酰甲基-N-苯基三氟甲基磺酰胺。
28.权利要求1的方法，其中抑制剂是阿的平。
29.权利要求1的方法，其中抑制剂是刺囊酸。
30.权利要求1的方法，其中抑制剂是N，N’-D1-2，4-二氨基苯基间苯二甲酰胺。
31.权利要求1的方法，其中抑制剂是2-苯甲酰胺-3-羧基-4，5，6，7-环己烯基[b]噻吩。
32.权利要求1的方法，其中抑制剂是N，N’-D1-(4-二甲氨基-亚苄基)肼。
33.权利要求1的方法，其中抑制剂是6-亚戊基氨基嘌呤。
34.权利要求1的方法，其中抑制剂是D1-(4-环己基氧乙氧基羰基氨基苯基)甲烷。
35.权利要求1的方法，其中抑制剂是2-(叔-丁氨基磺酰基-3-苯基丙烯酸)，乙酯。
36.权利要求1的方法，其中抑制剂是2-苄氧基羰基-5[2，2-二乙氧基羰基)亚乙基]吡喃酮。
全文摘要
本发明提供通过用抑制无前导序列蛋白与转运分子结合的化合物作用于细胞以抑制细胞以无前导序列蛋白输出的方法。无前导序列蛋白包括FGF－1、FGF－2、IL－lα、IL－1β、CNTF和HIV－tat。这些方法可用于治疗多种疾病,包括肿瘤和糖尿病。
文档编号A61P43/00GK1252716SQ98803844
公开日2000年5月10日 申请日期1998年2月25日 优先权日1997年2月26日
发明者R·Z·弗洛凯维茨, A·贝尔德 申请人:西布莱克斯公司