用于预防糖尿病并发症中的治疗干涉的化合物和方法

专利名称：用于预防糖尿病并发症中的治疗干涉的化合物和方法
根据35 U.S.C.§202(c)，特此承认美国政府在本文描述的发明中具有一定的权利，该发明的一部分是用国家健康研究所的基金进行的(资助号为DK44050、DK50317和DK50364)。发明背景本发明涉及用于治疗糖尿病、特别是预防、降低或延迟糖尿病并发症和相关病因学的其它病征发作的治疗剂及其用途。更具体地讲，本发明涉及抑制果糖赖氨酸(FL)酶促转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)的一类酶抑制剂，认为该转化是导致糖尿病并发症的生化机制中的重要一步。本发明也涉及评估糖尿病患者经历糖尿病并发症风险的方法，也涉及确定治疗干涉在预防、降低或延迟糖尿病并发症发作中的效力的方法。
有四种特别严重的糖尿病并发症，即糖尿病性肾病；糖尿病性视网膜病，它由于破坏视网膜而致盲；涉及外周神经功能丧失的糖尿病性神经病；以及由毛细管损害引起的循环问题。人们认为，视网膜病和肾病均是与该疾病状态有关的一般循环问题的亚类。最近已经概述了微血管功能障碍在晚期糖尿病中的作用(Tooke，Diabetes，44721(1995))。在本说明书的全文中，术语“糖尿病相关的病理学病征”和同义词是指包括各种众所周知的视网膜病、神经病、肾病、大血管病(macroangiopathic)以及其它糖尿病并发症。
已经广泛地报道了由糖尿病引起的病理学和由衰老引起的病理学之间的相似性。研究已经表明，许多糖尿病相关的病理学病征同与衰老正常相关的病理学在临床上非常相似。例如已经表明，在糖尿病中，动脉和关节过早僵硬，肺弹性和肺活量过早降低。而且，动脉硬化症、心肌梗死和中风在糖尿病患者中发生的频率比与衰老相匹配的非糖尿病个体中的频率更高。糖尿病患者对感染也更敏感，更可能在比非糖尿病患者年纪轻时患有高血压、骨损失加快、骨关节炎以及T细胞功能受损。
糖尿病相关的病理学病征与衰老之间的相似性似乎暗示一个共同的机制原理。已经提出了种种机制作为糖尿病相关的病理学病征和衰老的共同生化基础。来自人类被试者的数据最有力支持的假说是在非酶促糖基化机制上假定的。该假说指出，衰老过程和诸如上述的糖尿病相关的病理学病征，至少部分是由葡萄糖和葡萄糖衍生的代谢物通过Maillard反应进行蛋白修饰和交联所引起的(Monnier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81583(1984)和Lee等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，123888(1984))。由这类糖基化反应产生的修饰的蛋白本文称为高级糖化终产物修饰的蛋白(AGE-蛋白)。普遍认为，在导致AGE-蛋白形成的多步反应顺序中，3-脱氧葡萄糖醛酮(3DG)是关键的中间体。3DG是一种葡萄糖衍生的代谢物，它可以与蛋白反应，导致胞内蛋白和胞外蛋白(诸如胶原蛋白和基底膜)交联。
在糖尿病并发症的情况下，人们认为与该疾病相关的慢性高血糖在动力学上加速了产生AGE-蛋白的反应。支持该机制的证据包括这样的数据，该数据表明，来自糖尿病被试者的长寿命蛋白(诸如胶原蛋白和晶状体晶体蛋白)含有的AGE-蛋白含量显著高于来自衰老匹配的正常对照的含量。因此，在糖尿病患者中，相对早期时不寻常的白内障发生率可用晶状体晶体蛋白的修饰和交联的速率的提高来解释。同样，关键的结构蛋白-胶原蛋白的修饰和交联速率的提高，解释了在糖尿病患者中观察到的关节和动脉变硬的早期发作以及肺活量的降低。因为这些蛋白是长寿命的，所以，修饰的结果倾向于是累积性的。
证明糖尿病并发症和高血糖之间因果关系的另一因素是高血糖记忆。该现象的一个特别突出的实例是狗中严重视网膜病的形成，所述狗开始是糖尿病患者，然后经治疗恢复正常的血液葡萄糖水平。尽管治疗时狗眼在组织学上是正常的，但随着时间的流逝，尽管葡萄糖含量正常化，但在这些动物中发生了糖尿病性视网膜病(Engerman等，Diabetes，36808(1987))。因此，在临床症状明显之前，在早期高血糖期间对眼睛的潜在损害不可逆地发生了。
已经表明，糖尿病病人和动物的早期和晚期糖修饰的AGE-蛋白的浓度高于正常浓度。事实上，AGE-蛋白的增加高于血液葡萄糖水平的增加。AGE-蛋白的浓度可以通过荧光测量来估计，以重排产生蛋白结合的荧光分子的糖分子的一定百分比表示。
AGE-蛋白的致病作用不限于糖尿病。已将蛋白质糖化与阿尔茨海默氏病相关联(Harrington等，Nature，370247(1994))。随着衰老，也可以观察到蛋白荧光增加。实际上，某些理论将衰老过程归因于氧化损害和糖诱导的蛋白修饰的组合。因此，减少AGE-蛋白形成的治疗对治疗其它病因学上相似的人类疾病状态也可能是有用的，也许可以减慢衰老过程。
一般假定，AGE-蛋白的形成以一个蛋白氨基和一个糖(主要是葡萄糖)的反应开始。一个典型的文献引述陈述“通过赖氨酸残基的ε-氨基糖化形成的原始加成物是Amadori化合物、果糖赖氨酸…。糖化是统称为Maillard反应或褐变反应的一系列复杂反应中的最初一步，它最终导致形成交联的、沉淀的、氧化的、褐色的和荧光的蛋白”。K.J.Knecht等，Archives of Biochem.Biophys.，294130(1992)。
由糖形成AGE-蛋白是一个多步过程，涉及早期可逆的与糖的反应，产生含果糖-赖氨酸的蛋白。这些修饰的蛋白然后继续反应，产生不可逆修饰的AGE-蛋白。显然，AGE-蛋白不同于含糖化赖氨酸残基的蛋白，因为针对AGE-蛋白产生的抗体不与果糖-赖氨酸反应。也很清楚，AGE-蛋白作为多种化学种类存在，然而，几乎没有鉴定出这些种类。在最近的研究中，这些化学种类(ε-氨基-(羧甲基)赖氨酸已经鉴定为一种重要的最终AGE-蛋白结构(Reddy等，Biochem.，3410872(1995)以及Ikeda等，Biochemistry，358075(1996))。该项研究不能在化学上鉴别构成大约50％所述修饰位点的另一AGE-蛋白的表位。最近已经开发了一种研究由核糖形成AGE-蛋白的动力学的方法(Khalifah等，Biochemistry，354645(1996))。然而，该研究提示，核糖可能在AGE-蛋白形成中起重要的生理学作用，这支持以下提供的糖化赖氨酸和果糖-赖氨酸的相对广义的定义。
其它参考文献指出了含糖化赖氨酸残基的蛋白和AGE蛋白之间的区别，“在数小时和数周内分别达到席夫碱和Amadori产物的平衡水平。早期糖基化产物的可逆平衡性质是重要的，因为它意味着，甚至在非常长寿命的蛋白上，这类产物的总量在短时间内也达到了稳态平顶……。由于这些早期糖基化产物在慢性糖尿病患者中数年内不继续在胶原蛋白和其它稳定的组织蛋白上累积，因此，它们的浓度与或者糖尿病性视网膜病的存在或者严重性无关是不奇怪的…。然而，胶原蛋白和血管壁的其它长寿命蛋白上的某些早期糖基化产物不解离。而是它们经历一系列缓慢复杂的化学重排，形成不可逆的高级糖基化终产物”。M.Brownlee等，New England Journal of Medicine，3181315(1988)。产生科学文献中描述的这些修饰蛋白的唯一途径，涉及蛋白质和糖分子之间的一个最初反应。
许多参考文献指出，AGE-蛋白的形成通过一个多步途径发生，而3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)是该途径中的关键中间体。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)；M.Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)；T.Niwa等，Nephron，69438(1995)；W.L.Dills，Jr.，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993)；H.Yamadat等，J.Biol.Chem.，26920275(1994)；N.Igaki等，Clin.Chem.，36631(1990)。在

图1中描述了普遍接受的由糖和蛋白反应形成3DG的途径。正如在图1中可见到的，糖(葡萄糖)分子最初与蛋白-赖氨酸的氨基(I)形成席夫碱。产生的席夫碱然后重排，产生果糖-赖氨酸修饰的蛋白(II)。导致(II)的反应是自由可逆的。(II)可以重排，产生3DG和游离的蛋白赖氨酸。3DG和蛋白之间的随后反应在AGE-蛋白形成中是第一个不可逆的步骤。
就我们所知，从未报道过3DG可以由替代途径产生，或事实上，主要的3-DG源来自一个酶催化的代谢途径，而非来自图1所示的非催化的反应。
糖尿病患者血清中的3DG显著高于非糖尿病患者(12.78±2.49μM相对于1.94±0.17μM)。(Toshimitsu Niwa等，Nephron，69438(1995))。然而，在正常的健康个体中发现这种毒性化合物。因此，机体已经形成对该分子的解毒途径是不奇怪的。这些反应之一是由醛还原酶催化的，它通过将3DG还原为在尿中有效排泄的3-脱氧果糖(3DF)而将3DG解毒(Takahashi等，Biochem，341433(1995))。另一解毒反应由氧代醛脱氢酶将3DG氧化为3-脱氧-2-酮葡萄糖醛酸(DGA)(Fujii等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，210852(1995))。
对数据研究的结果表明，至少这些酶之一的醛还原酶的效力在糖尿病中受不利影响。当从正常大鼠肝脏中分离时，该酶的一部分在赖氨酸67、84和140上部分糖化，当与正常未修饰的酶相比时，催化效力低(Takahaski等，Biochem.，341433(1995))。由于糖尿病患者的糖化蛋白的比率高于正常血糖的个体，因此他们的3DG水平可能较高，并且通过将该反应性分子还原为3DF而将该反应性分子解毒的能力降低。
已经研究了醛还原酶的机制。这些研究确定，这种重要的解毒酶受醛还原酶抑制剂(ARI)抑制(Barski等，Biochem.，3411264(1995))。目前正在对ARI减少糖尿病并发症的潜力进行临床研究。这些化合物作为一类，已经表现出对短期糖尿病并发症的某些作用。然而，它们缺乏对长期糖尿病并发症的临床作用，并且它们使喂食高蛋白膳食的大鼠的肾功能恶化。正如下文所表述的，这一发现与构成本发明基础的新发现的赖氨酸回收的代谢途径一致。高蛋白膳食将增加果糖-赖氨酸的消耗，果糖-赖氨酸通过肾脏的赖氨酸回收途径转化为3DG。产生的3DG通过还原为3DF的解毒将受ARI治疗的抑制，与未接受ARI的大鼠相比，这必然导致对肾脏损害的增加。这是因为ARI对醛糖还原酶的抑制会降低醛糖还原酶还原3DG和3DF的有效性。
先前已经研究了3-DG在导致人类疾病中的作用，这些将从以下概述的专利的综述中认识到。
Ulrich等的美国专利5,476,849描述了一种方法，使用氨基-苯甲酸和衍生物抑制AGE-蛋白的形成。这些化合物假定通过与3-DG反应、并在它可以与蛋白反应而开始AGE-蛋白形成的不可逆步骤之前将其从该系统中去除而起作用。
Cerami等的美国专利4,798,583和5,128,360描述了氨基胍防止AGE-蛋白形成和糖尿病诱导的动脉壁蛋白交联的用途。表明氨基胍与早期糖基化产物反应。该早期产物为本文所定义的3DG。这些专利没有设想抑制3-DG形成的可能性。它们的焦点仅仅是将该毒性分子络合。
France等的美国专利5,468,777描述了预防口腔中由蛋白非酶促褐变引起的牙齿染色的方法和药剂。半胱氨酸和半胱氨酸衍生物被说成在该申请中特别有用。
Ulrich等的美国专利5,358,960描述了采用氨基取代的咪唑抑制AGE-蛋白形成的方法。表明这些化合物与早期糖基化产物(3DG)反应。在该专利中没有提及3DG的代谢源可能存在。该专利设想，3DG仅仅作为蛋白非酶促褐变中的中间体而产生。
Ulrich等的美国专利5,334,617描述了可用作AGE-蛋白形成抑制剂的氨基酸。赖氨酸和其它双官能氨基酸被说成在该方面特别有用。这些氨基酸被描述为与葡萄糖和蛋白反应的早期糖基化产物反应。看来，该专利中描述的早期糖基化产物为3DG。
Ulrich等的美国专利5,318,982描述了使用作为抑制剂的1，2，4-三唑抑制AGE-蛋白的形成。该专利中描述的抑制剂含有定位与3DG反应并将其络合的二氨基取代基。该专利将这些化合物描述为与早期产物(本文定义的3DG)反应。
Ulrich等的美国专利5,272,165描述了使用2-亚烷基-氨基胍作为AGE-蛋白形成的抑制剂。该专利中所述的抑制剂据说与3DG高度反应。在该专利中没有提及抑制3DG的代谢形成。
Ulrich等的美国专利5,262,152描述了使用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白的形成。该专利中所述的化合物为α-效应胺(α-efiectamine)。W.P.Jencks，第3版，McGraw Hill，New York。该类化合物已知与例如3DG的二羰基化合物反应。
Ulrich等的美国专利5,258,381描述了使用2-取代-2-咪唑啉抑制AGE-蛋白的形成。该专利中描述的化合物含有可以迅速与3DG反应的相邻氨基。
Ulrich等的美国专利5,243,071描述了使用2-亚烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白的形成。该专利中所述的化合物与3DG高度反应，并通过将该反应性毒性分子络合而起作用。
Ulrich等的美国专利5,221,683描述了使用二氨基吡啶化合物抑制AGE-蛋白的形成。被描述为特别有用的所述二氨基吡啶化合物会与3DG反应，形成稳定的、含六元环的络合物。
Ulrich等的美国专利5,130,337描述了使用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白的形成。该专利中所述的抑制剂为α-效应胺(α-effctamine)，它们如本领域已知的，会与3DG快速反应，形成稳定的络合物。
Ulrich等的美国专利5,130,324描述了使用2-亚烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白的形成。该专利中所述的化合物通过与由葡萄糖与蛋白反应产生的早期糖基化产物(3DG)反应而起作用。
Ulrich等的美国专利5,114,943描述了使用氨基取代的嘧啶抑制AGE-蛋白的形成。该专利中所述的化合物据说与3DG快速反应并将其解毒。
上述专利中没有一个提示抑制3DG的代谢形成，作为预防糖尿病并发症的治疗干涉工具。实际上，这些专利中甚至没有一个提示在3DG产生中涉及酶促途径。
Ulrich等的美国专利5,108,930描述了检测生物样品中氨基胍水平的方法。该测定被描述为在通过测量氨基胍消除的时间而测定肾功能中具有潜在效用。在该专利中计划用于该测定方法的主要效用是用于测定氨基胍的组织水平，使得可以在动物和人类的研究中维持足以抑制AGE-蛋白形成的剂量。在该专利中没有提及使用尿3DG、3DF或DGA的比率来确定有并发症风险的糖尿病患者。
Szwergold等的美国专利5,231,031描述了一种方法，评估糖尿病相关的病理学病征的风险，并且确定对这些并发症的治疗效力。该专利描述了糖尿病患者红细胞中的两种磷酸化化合物。这两种化合物在该专利中没有在化学上得到鉴定。然而，没有一种化合物是3DG或3DF，在本发明的诊断实施方案中测定了尿中3DG和3DF的水平。
通过测量糖基化终产物而监测糖尿病患者中代谢控制的方法是已知的。已知糖基化血红蛋白的浓度反映出前数周内的平均血液葡萄糖浓度。授权于A.Cerami等的美国专利4,371,374描述了一种方法，通过定量测定尿中糖基化蛋白的降解产物(更具体地讲为非酶促糖基化的氨基酸和肽)而监测葡萄糖水平。该方法表明利用碱性硼酸的亲和性，与糖基化终产物中发现的共平面顺-二醇基团形成特殊的络合物，以分离并定量这类终产物。
授权予A.Cerami的美国专利4,761,368描述了褐变多肽(例如牛血清白蛋白和聚-L-赖氨酸)中存在的发色团的分离和纯化。发色团2-(2-糠酰)-4(5)-2(糠酰)-1H-咪唑(FFI)是由两分子葡萄糖与两个源自赖氨酸的氨基缩合而衍生的共轭杂环。该专利还描述了FFI在测量蛋白样品中“衰老”(高级糖基化的程度)的方法中的用途，在该方法中，通过测定该样品中上述发色团的量，然后将该测量结果与标准(具有一定量FFI的蛋白样品，已经将FFI与该样品的“年龄”相关联)相比，测定所述样品的“年龄”。
在现有的治疗糖尿病患者的方法中，对于鉴定那些有形成糖尿病相关的病理学病征风险的糖尿病患者、通过治疗干涉预防、减少或延迟这类病征发作、以及确定这类治疗干涉益处的有效方法，有长期存在的、未满足的需要。
发明概述本发明源自下述代谢途径的发现，该途径涉及酶介导的FL向FL3P的转化，并在受糖尿病影响的器官中产生相对高浓度的3-脱氧葡萄糖醛酮(3DG)。随后对这一新发现的途径的生化功能的研究倾向于指出，该途径在糖尿病性肾病的病因学中具有重要作用。也推测该途径导致发生各种已知的糖尿病相关的病理学病征。
该发现已经建立了本发明中的实际应用，一方面，本发明提供具有酶抑制活性并有效抑制果糖-赖氨酸转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸的一类化合物。通过测定，可容易地测定本发明化合物的相关酶抑制活性。该测定方法包括提供一种果糖-赖氨酸、三磷酸腺苷(ATP)、一种果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源和其量足以证明抑制活性的一种本发明化合物的水溶液；使产生的溶液经受促进果糖-赖氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷形成的条件，果糖-赖氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷为上述激酶、果糖-赖氨酸和三磷酸腺苷相互作用的产物；并且测量至少一种这类产物的产量，与相同相对量的果糖-赖氨酸、三磷酸腺苷和果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源、没有加入本发明化合物的水溶液相比，本发明的化合物降低这类产物的量。刚刚描述的测定方法也属于本发明的范围。
按照另一方面，本发明提供用于预防、减少或延迟糖尿病患者中糖尿病并发症发作的药用制剂，包含作为活性药剂的一种上述本发明化合物和一种药学上可接受的载体。
按照本发明的再一方面，提供用于在有发生糖尿病并发症风险的患者中预防、减少或延迟糖尿病并发症发作的方法，该方法包括给予该患者一种本发明的化合物，其量可以有效地抑制果糖-赖氨酸向果糖-赖氨酸-3-磷酸的酶促转化。这同一方法可以用于预防或治疗其它病因学相似的疾病状态，这些将在下文进一步描述。
按照又一方面，本发明提供糖尿病患者经历糖尿病相关的病理学病征风险的评估方法。该方法包括给予该患者糖化赖氨酸残基源，其量提供预定剂量的糖化赖氨酸残基；并且以正常被试者(即非糖尿病被试者或没有糖尿病临床症状的被试者)中的3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比为基准，测定得自该患者的生物样品中3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比。与无症状被试者的3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比相比，该糖尿病患者样品中的该比率较高表明该患者有较高风险经历糖尿病相关的病理学病征。
本发明也提供一种方法，评估治疗干涉在预防糖尿病并发症中的效力。该方法包括，测定得自该治疗干涉开始前后的糖尿病患者的生物样品中3-脱氧葡萄糖醛酮、3-脱氧果糖和果糖-赖氨酸的浓度。然后将3-脱氧葡萄糖醛酮和3-脱氧果糖的浓度之和与所述样品中的果糖-赖氨酸浓度相比。与测得的取自该治疗干涉开始之前的生物样品中的3-脱氧葡萄糖醛酮、3-脱氧果糖和果糖-赖氨酸的浓度相比，在取自治疗干涉开始之后的该生物样品中，3-脱氧葡萄糖醛酮和3-脱氧果糖的浓度之和相对于果糖-赖氨酸浓度的降低，为该治疗干涉效力的指示。
作为本发明的再一方面提供一种方法，将一种食品导致发生糖尿病相关的病理学病征的可能性报告给糖尿病病人。该方法包括测量该食品中糖化赖氨酸残基的含量，并且在例如该食品的包装上或在计划让糖尿病患者使用的出版物中将该信息提供糖尿病患者。
附图简述图1展示参与产生不可逆修饰的AGE-蛋白的多步反应的最初一步。
图2说明参与赖氨酸回收途径的反应。
图3图示尿分布型，显示进食2gFL、随后跟踪24小时的单个个体的3DF、3DG和FL随时间的变化。
图4图示进食2g果糖赖氨酸的7个自愿者的3DF随时间的尿排泄。
图5展示一组对照动物和维持含0.3％糖化蛋白的饲料的实验组之间3DF和N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶的图示比较。
图6图示喂食或者对照膳食或者富含糖化蛋白的膳食的大鼠的尿中3DF和3DG水平之间的线性关系。
图7A和7B图示对3DF禁食水平作图的正常者和糖尿病患者的尿中3DG的禁食水平。
发明详述如下文进一步详细描述的，提供以下定义以有助于理解本发明1.糖化赖氨酸残基-本文所用的表述“糖化赖氨酸残基”，是指通过还原糖和一种含赖氨酸蛋白反应产生的稳定加成物的修饰的赖氨酸残基。
大多数蛋白的赖氨酸残基位于蛋白表面，如对带正电氨基酸所预期的。因此，与血清或其它生物流体接触的蛋白上的赖氨酸残基，可以自由地与溶液中的糖分子反应。该反应以多步发生。最初一步涉及所述赖氨酸的游离氨基和该糖的酮基之间形成席夫碱。这种最初产物然后经历Amadori重排，产生稳定的酮胺化合物。
该系列反应可以用各种糖发生。当涉及的糖为葡萄糖时，最初的席夫碱产物将涉及该葡萄糖的C-1上的醛部分与所述赖氨酸的ε-氨基之间形成亚胺。Amadori重排将导致形成与果糖、1-脱氧-1-(ε-氨基赖氨酸)-果糖(本文称为果糖-赖氨酸或FL)的C-1碳偶联的赖氨酸。
用其它醛糖，例如半乳糖和核糖将发生相似的反应(Dills，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993))。对于本发明来说，无论所述修饰性糖分子的精确结构如何，任何还原糖和蛋白赖氨酸的ε-氨基残基反应的早期产物均包括在糖化赖氨酸残基的含义内。
而且，术语糖化赖氨酸残基、糖化蛋白以及糖基化蛋白或赖氨酸残基在本文中可互换使用，这与目前科学杂志中的用法一致，在这些科学杂志中，这类表述常常互换使用。
2.果糖-赖氨酸-术语“果糖-赖氨酸”(FL)本文用来表示任何糖化赖氨酸，无论是加入蛋白/肽中的，还是从蛋白/肽通过蛋白水解消化释放的。该术语具体不限于通常称为果糖-赖氨酸的化学结构，该结构据报道由蛋白的赖氨酸残基和葡萄糖反应而形成。如上所述，赖氨酸的氨基可以与种类繁多的糖反应。实际上，一篇报道指出，葡萄糖是测试的一组十六(16)个不同糖中反应性最小的糖(Bunn等，Science，213222(1981))。因此，无论在该说明书中何处提及果糖-赖氨酸，都包括与葡萄糖类似的由半乳糖和赖氨酸形成的塔格糖-赖氨酸，同样包括所有其它糖的缩合产物，无论它是否是天然存在的。根据本文的描述，人们会理解，蛋白-赖氨酸残基和糖之间的反应涉及多个反应步骤。该反应顺序中的最后几步涉及蛋白的交联和称为AGE-蛋白的多聚体种类的产生，其中某些有荧光。这类修饰蛋白的蛋白水解消化不产生与糖分子共价连接的赖氨酸。因此，这些种类不包括在本文所用的术语“果糖-赖氨酸”的含义内。
3.果糖-赖氨酸-3-磷酸-该化合物通过将高能磷酸基团从ATP酶促转移至FL而形成。本文所用的术语果糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)是指包括可以酶促形成的所有磷酸化果糖-赖氨酸部分，无论是游离的还是蛋白结合的。
4.果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶-该术语是指这样的一种或多种蛋白，如上所述，当另外供应高能磷酸源时，所述蛋白可以将FL酶促转化为FL3P。
5.3-脱氧葡萄糖醛酮-3-脱氧葡萄糖醛酮(3DG)是1，2-二羰基-3-脱氧糖(也称为3-脱氧己酮糖醛酮(3-deoxyhexulosone))，它在FL3P分解产生游离赖氨酸和无机磷酸时形成。对于本说明书来说，术语3-脱氧葡萄糖醛酮计划包括FL3P分解时形成的所有可能的二羰基糖，具有上述FL3P的广义定义。
6.FL3P赖氨酸回收途径-在人类肾脏以及可能在其它组织中存在一个赖氨酸回收途径，它再生作为游离氨基酸或在多肽链中加入的未修饰的赖氨酸。正如以下进一步解释的，该途径是导致糖尿病并发症的重要因素。
7.AGE-蛋白-术语“AGE-蛋白”(高级糖化终产物修饰的蛋白)已经用于科学杂志中，用于本文是指糖和蛋白之间反应的最终产物(Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)以及Niwa等，Nephron，69438(1995))。显然，例如蛋白的赖氨酸残基和葡萄糖之间的反应不以果糖-赖氨酸的形成而终止。FL可以经过多个脱水和重排反应，产生非酶促的3DG，3DG再与游离氨基反应，导致所涉及蛋白的交联和褐变。实际上，适当的证据表明，上文定义的3DG是该修饰反应中的中心中间体。
9.“糖化膳食”-本文所用的该表述是指其中一定百分比的正常蛋白用糖化蛋白取代的任何给定的膳食。表述“糖化膳食”和“糖化蛋白膳食”本文可互换使用。
至少某些糖尿病并发症，可能所有的糖尿病并发症是由葡萄糖和其它反应性糖共价修饰蛋白引起的。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)。如上所述，已经表明糖尿病病人和动物的糖修饰蛋白的浓度高于正常。事实上，糖尿病相关的AGE-蛋白的增加高于血液葡萄糖水平的增加。
先前普遍认为，3DG在体内的起源来自含糖化赖氨酸残基的蛋白的分解。也普遍认为，这些糖化赖氨酸可能不用作氨基酸源。正如下文所表述的，这种先前的看法是不正确的。
如上所述，从先前未知的在酶催化反应中产生3DG的代谢途径的发现展开本发明。该酶促途径能够进行酶抑制，由此减少毒性3DG的产生。
在对糖尿病性肾病的一系列研究过程中，对来自链脲菌素(streptozotoxin)诱导的糖尿病大鼠肾脏的高氯酸提取物进行31P NMR光谱的检查，在NMR光谱中显示一个不寻常的新峰。本发明人先前的研究已经证明，在大鼠晶状体和人红细胞中存在果糖-3-磷酸(A.Petersen等，Biochem.J.，284363-366(1992)；Lal等，Arch.Biochem.Biophys.，318191(1995)；Szwergold等，Science，247451(1990)以及Lal等，Investigative Opthalmology and Visual Science，36(5)969(1995))。较早的研究已经鉴定出大鼠晶状体中的其它不寻常的磷酸化糖(Szwergold等，Diabetes，44810(1995)以及Kappler等，Metabolism，441527(1995))。因此，假定这一新鉴别的峰是另一种磷酸化糖是合理的。更加广泛的实验室研究表明，这种新化合物不是单糖，而是在果糖组分的3位磷酸化的果糖-赖氨酸。
以两种方式证实了该鉴定。用以下实施例2中公开的方法合成真正的果糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)，显示在31P NMR光谱中与糖尿病大鼠肾脏中所述峰共振(co-resonate)。也将合成的果糖-赖氨酸注射入非糖尿病大鼠中。这些大鼠在该注射后表现出其肾脏中FL3P水平显著增加。
进行了两个实验，以证明FL3P在一个酶催化的反应中直接由FL衍生。合成在该果糖部分的C3位用氘标记的果糖-赖氨酸，并将其注射入大鼠。注射后3小时，取出这些大鼠的肾脏，用高氯酸萃取。NMR光谱表明，从这些大鼠分离的FL3P物质在所述果糖部分的C3位含有氘标记。另外，大鼠肾脏匀浆证明在需要ATP和果糖-赖氨酸的反应中产生FL3P的能力。这后一个提及的实验证实存在特殊的FL3P激酶，因为当仅将果糖赖氨酸和ATP在生理条件下共同温育时，没有形成FL3P。涉及肾皮质分级分离的其它实验已经证明，该激酶活性在肾脏中不是均匀分布的，而是集中在证明在人类和动物糖尿病性肾脏中损害的最早的解剖部位之一的近端小管区。
FL3P在水溶液中不稳定。它快速降解形成3DG、赖氨酸和无机磷酸。该反应也在体内发生。目前不知道体内FL3P的降解是自发反应还是酶催化的反应。然而，非常怀疑涉及酶催化，因为由果糖-赖氨酸产生3DG在完整的肾脏中发生得非常快。
图2显示了FL3P赖氨酸回收途径中的反应步骤。在第一步中，在一个由FL3P激酶催化的反应中，果糖-赖氨酸和ATP反应，形成果糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)和ADP。在果糖部分的3位发生磷酸化，导致果糖赖氨酸分子的去稳定化。产生的FL3P然后分解形成3-脱氧葡萄糖醛酮(3DG)、无机磷酸和未修饰的、游离的、可重新使用的赖氨酸，这在蛋白合成中可以加以利用。醛还原酶通过将3DG还原为在尿中排泄的3-脱氧果糖(3DF)，而将3DG解毒。
尽管图2描述了使用最普遍的糖化赖氨酸、果糖-赖氨酸的该途径，但对本领域技术人员而言，种类繁多的相似分子可以通过该途径流出，这是显而易见的。实际上，正如以下进一步详细解释的，FL3P赖氨酸回收途径的底物选择性是相当广的，保证了上述术语的广义定义。
其它实验已经表明，在包括绵羊、猪、狗、兔子、奶牛、小鼠和鸡的种类繁多的动物物种中，发现赖氨酸回收途径。该途径也存在于人类中。已知赖氨酸是大多数食品中以相对低浓度存在的必需氨基酸，因此可以理解FL3P赖氨酸回收途径的普遍存在。另外，食品中的相当大百分比的赖氨酸残基以糖化形式存在，当蒸煮该食品时，这种修饰的赖氨酸的比例将增加。由于这些糖化赖氨酸残基不可以用于蛋白合成，因此赖氨酸的回收途径具有很大的用途，为具有该途径的生物体提供选择优势。
糖尿病对赖氨酸回收途径具有两个作用。当从糖尿病患者中分离时，血液蛋白含有糖化赖氨酸的浓度高于从非糖尿病个体分离的浓度。因此，糖尿病患者承受的通过赖氨酸回收途径的通量大于非糖尿病患者。另外，根据对糖尿病患者和正常者尿中3DG和3DF之比的初步观察，糖尿病患者通过该途径产生的将3DG解毒的能力似乎降低。这两个因素综合起来，在糖尿病患者中产生较高的3DG尿浓度(参见图7；也参见Lal等，Arch.Biochem.and Biophys.，342(1)254-60(1997)。
参与赖氨酸回收途径的因子已经在肾脏以外的其它组织中鉴定出，具体是红细胞、晶状体和外周神经组织。所有这些组织均受糖尿病并发症的影响。定位于红细胞中与糖尿病微血管并发症相关，例如糖尿病性视网膜病，肾脏定位与糖尿病性肾病相关，而在外周神经中的定位与糖尿病性外周神经病相关。这些因子也在胰腺中发现。正在进行实验，以确定这些因子在皮肤中的存在。如果发现存在，则相信它的有害作用可以通过采用合适载体中的本发明的抑制性化合物局部治疗来减轻，以防止胶原蛋白交联，由此提高皮肤弹性。
已经进行了实验，趋于证明人类由经口摄取的含糖化赖氨酸残基的蛋白产生3DG和3DF。这些实验在以下详细描述，令人信服地证明赖氨酸回收途径存在于人类中。这些实验也阐明了令人迷惑的现象，也就是说，某些糖尿病患者发生糖尿病并发症，而其它糖尿病患者，甚至血糖控制差的那些糖尿病患者都不发生这类并发症。从本文提出的数据来看，该现象的原因是显而易见的。糖尿病患者将3DG解毒的能力不同。一个亚群的糖尿病患者群体的醛还原酶活性似乎相对高于大多数糖尿病患者。因此，这些个体能够通过有效地将高于正常水平的3DG解毒，而处理通过赖氨酸回收途径的较高的通量。能力受损的其它个体将其提高水平的3DG解毒的能力较差，因此发生糖尿病并发症的风险较高。
正如以下更详细描述的，已经经实验证明，赖氨酸回收途径的刺激可以通过使用糖化蛋白膳食而发生。如以上用FL的情况一样，在喂食糖化蛋白膳食的实验动物中观察到FL3P、3DG和3DF水平升高。
本发明的酶抑制剂化合物阻断赖氨酸回收途径，防止由FL3P形成毒性3DG。
以下描述了一套广泛的、能够显示用于本发明实践的一种合适的酶抑制剂的标准；也描述了测定任何推定的抑制剂是否满足这些标准的一些试验。用于按照本发明使用的候选激酶抑制剂，可以是从植物或微生物中分离的天然产物。或者，它们可以是得自酶促反应及其机制的合理理解的合成分子。抑制剂也可以通过组合方法合成。可以由随机起始点产生组合文库。此外，可以利用组合方法产生种类繁多的、与先前鉴定的靶FL3P激酶抑制剂相关的化合物。
不考虑所述推定的抑制剂源，认为不满足所有下列标准的化合物不是能够抑制赖氨酸回收途径并由此预防、减少或延迟糖尿病并发症或相关病因学病征发作的有用的治疗剂。
1.该抑制剂应该是小分子，并且容易被细胞吸收。为了满足该标准，该抑制剂的分子量必须小于2,000道尔顿，更理想的是大约1,000道尔顿或更小。
2.该抑制剂必须表现出对FL3P激酶的竞争性、非竞争性、不可逆或自杀性的抑制。如果该抑制剂为竞争性或非竞争性抑制剂，则抑制常数Ki必须小于大约1mM。理想的是，它必须小于100μM，更理想的是大约40μM或更低。如果该抑制剂表现出自杀性抑制或其它不可逆抑制，则对抑制剂常数的要求尚有争论。
3.该抑制剂在水溶液中必须是可溶性的，并且在生理pH的水溶液中必须是稳定的。只有当该抑制剂或该抑制剂的盐在不低于10μM浓度下在生理盐水或血清中可溶时，才满足对溶解性的要求。只有当抑制剂于37℃溶于生理盐水中的溶液在温育1小时后保留的活性大于50％时，才满足这一稳定性要求。理想的是，在温育1天或更长时间时，该抑制剂保留的活性必须大于50％。
4.该抑制剂必须表现出可接受的药代动力学。也就是说，它必须在给予该药剂后以治疗有效浓度保留至少1小时。理想的是，它应该维持有效浓度至少8小时。更理想的是，每日给药一次应该是为维持该抑制剂治疗浓度必需的所有给药量。该要求不意味着该抑制剂必需能够在首次给药后建立治疗浓度。存在许多仅在给药延长时观察到治疗效果的成功药物的实例。该标准不意味着，一旦达到有效浓度，则该浓度应该能够在最后一次给予药物后维持1小时以上。本文描述了治疗效力的测试。
5.该抑制剂必须是无毒的。该标准要求当以治疗剂量给予时，该抑制剂不表现对人类的毒性。理想的是，当该抑制剂以两倍于治疗效果所需水平的血液和/或靶组织水平存在时，毒性应该不明显。更理想的是，在6倍或更高倍于治疗范围的水平下，应该没有明显的毒性。可以只通过长期的抑制剂治疗，预防糖尿病并发症。因此，对无毒性的要求必须包括急性毒性和在延长的长期使用期间可能变得明显的慢性毒性。可以采用很好建立的动物研究，容易地评估候选分子的毒性。在一期临床试验中评估人类毒性。
在对本发明实践有用的化合物中，包括下式的那些化合物以及所述化合物的异构体和药学上可接受的盐
其中，X为-NR’-或-O-，R’选自H、线性或支链烷基(C1-C4)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下的取代基H、氨基酸残基、多氨基酸残基、肽链、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代)、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代，并且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分中断)，R”为线性或支链烷基(C1-C6)以及未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X代表-NR’时，R和R’同它们连接的氮原子一起也可以代表一个具有5-7个环原子的取代或未取代的杂环，氮和氧中的至少一个是所述环中仅有的杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)以及所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1为具有1-4个线性碳原子的多元醇部分，Y为或者羰基部分
或亚羟甲基部分
Z选自-H、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2以及可选的-OH。
含氮或含氧“R”取代基的说明性实例包括衍生自γ-氨基-α-羟基丁酸(-(CH2)2-CHOH-COOH)、1，2，4-三氨基丁烷(-(CH2)2-CHNH2-CH2NH3)、3，6-二氨基-5-羟基庚酸(-CH2-CH(OH)-CH2-CH(NH2)-CH2-COOH)等的那些取代基。
式I的结构具有不对称中心，可以作为外消旋物、外消旋混合物和各种立体异构体以及它们的混合物产生，所有这类异构形式均属于本发明范围。
尽管具有以上式I结构的某些化合物是先前已知的，但认为其它化合物是新的，因此属于本发明范围，所有式I化合物在体内抑制酶催化产生3DG的用途也属于本发明范围。
可以通过使合适的糖(例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖或它们的衍生物)与氨基酸或其它合适的伯胺或仲胺反应，产生具有羰基部分(即Y＝-C(＝O)-)的抑制剂，来制备上式的抑制剂。或者，可以在将席夫碱中间体选择性地还原为胺的试剂(诸如NaBH3CH)存在下，使诸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖或此类糖的糖与本文所述类型的氨基取代的或羟基取代的反应物反应，由此产生具有醇部分(即Y＝-CH(-OH)-)的抑制剂。当使用时，氨基酸反应物的反应性部分可以是α-碳上的氨基或所述酸侧链上的氨基或羟基。合适的氨基酸包括必需氨基酸。具体实例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸和色氨酸。其它合适的反应物来自一类更广泛的氨基羧酸，例如焦谷氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基已酸等。如果需要，也可以使用上述氨基酸的N-酰基衍生物，诸如甲酰赖氨酸。
其它合适的反应物包括但不限于未取代或取代的芳基(C6-C10)化合物(其中该取代基可以是烷基(C1-C3)、烷氧基、羧基、硝基和卤素基团)、未取代或取代的烷烃(其中该取代基可以是至少一个烷氧基)；或未取代或取代的含氮杂环化合物(其中所述取代基可以是烷基(C1-C3)、芳基(C6-C10)、烷氧基、羧基、硝基或卤素基团)。最后一组提及的反应物的说明性实例，包括间甲基-、对甲基-、间甲氧基-、邻甲氧基-和间硝基-氨基苯、邻-和对-氨基苯甲酸；正丙胺、正丁胺、3-甲氧基丙胺；吗啉和哌啶(piperdine)。
在所附的表A中提出了具有上式的代表性抑制剂化合物。在本发明实践中可以用作抑制剂的已知化合物的实例，包括但不限于葡甲胺(meglumine)、山梨糖醇赖氨酸和甘露糖醇赖氨酸。
本文所述的抑制剂化合物可以与各种无机或有机酸或碱形成药学上可接受的盐。合适的碱包括例如碱金属盐、碱土金属盐、铵、取代的铵和其它胺盐。合适的酸包括例如盐酸、氢溴酸和甲磺酸。
式I化合物的药学上可接受的盐可以按照本领域技术人员熟悉的方法制备。
可以采用种类繁多的激酶活性测定，确定化合物抑制FL3P激酶的能力。一个有用的测定涉及在肾匀浆或其它酶源存在下，将潜在的抑制剂与果糖-赖氨酸和ATP一起温育。制备所述测定组分的溶液，它通常含有1毫摩尔或更少的本发明抑制剂化合物、范围为1-10毫摩尔的一定量的果糖赖氨酸(FL)、范围为0.1-10毫摩尔的一定量的ATP和其量足以将FL转化为果糖赖氨酸-3-磷酸的所述酶源。进行温育的pH范围内应该为4.5-9.5，理想的是中性或近中性pH。进行温育的温度应该符合酶活性，为4-40℃。理想的是，该温育在生理温度下进行。温育后，通过酸沉淀该蛋白终止该反应，通过31P-NMR光谱学测定FL3P的产生。与不含抑制剂的对照样品相比时，在含抑制剂化合物的样品中，FL3P的产生将减少或消除。
其它测定具有快速测定酶抑制的用途。一个这种测定涉及使用果糖-赖氨酸和γ-标记的32P或33P-ATP。由于FL3P不与Dow-1结合，而ATP和大多数其它磷酸与Dow-1结合，因此通过在预定反应时间后，通常为10分钟后，使该测定溶液通过Dow-1树脂柱，将产物FL3P与其余反应混合物分离是可能的。将产生的溶液加入闪烁液体(例如Ecoscint A)的容器中并计数，以测定产生的放射性的量。
因为难以获得大量的人类组织，所以最好使用克隆入表达系统(诸如大肠杆菌)中的重组形式的激酶。可以容易地从组织特异性cDNA文库的“鸟枪法”克隆，得到所述克隆的激酶。这类文库容易得自商业来源。例如它们可以得自Clontech，Palo Alto，CA。可以采用商业上得自Stratagen(位于San Diego，California)的λ克隆系统，进行设想的鸟枪法克隆。该克隆试剂盒带有详细的使用说明。
本发明的药用制剂包含作为活性组分的一种或多种上述化合物，结合一种药学上可接受的载体介质或辅助剂。
这些组分可以以各种给药形式制备，包括液体或固体。因此，该制剂可以为片剂、囊片(caplet)、丸剂或糖衣丸，或可以填入诸如胶囊的合适容器中，或在悬浮剂的情况下，可以装入瓶中。本文所用的“药学上可接受的载体介质”包括任何和所有的适合于所需具体给药形式的溶剂、稀释剂或其它液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。合适载体介质的代表性实例包括明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、植物和动物脂肪和油、树胶、聚亚烷基二醇或此类物质。Remington’sPharmaceutical Sciences，第15版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，PA 1975)公开了用于配制药用制剂的各种载体和制备药用制剂的已知技术。除了在任何常规载体介质与本发明的酶抑制剂不相容的情况下，诸如由于产生任何不良的生物效应或者以有害方式与该药用制剂的其它组分相互作用，设想其使用属于本发明范围。
在本发明的药用制剂中，所述活性药剂的存在量可以为该制剂(包括载体介质和/或辅助剂(如果有的话))总量的至少5％(重量)，一般不大于98％(重量)。最好是，活性药剂的比例在该组合物重量的65％和95％之间变化。
优选的补充活性药剂是在体内与3DG结合的化合物。该类化合物包括但不限于氨基胍、氨基苯甲酸及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物、氨基取代的咪唑、1，2-二取代的苯并咪唑、取代1，2，4-三唑、二氨基吡啶及其衍生物、氨基取代的嘧啶、氨基醇、二胺等。特别是包括血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂的抗高血压药物也可以作为补充活性药剂包括于本发明的药用制剂中。
如果必需或需要，诸如保护该活性化合物免受胃中酸破坏、或促进该活性化合物吸收入血流的化合物的辅助剂，也可以加入该药用制剂中。这类辅助剂可以包括例如络合剂等，诸如硼酸盐或部分抵销胃中酸性条件的其它盐。通过将该活性化合物作为脂肪酸盐传递(在该活性化合物含有一种或多种碱性官能团的情况下)，可以提高吸收。
可以采用有效抑制FL3P赖氨酸回收途径的任何给药量和任何给药途径，将本发明的化合物与任何补充活性组分一起给予。因此，本文所用的表述“治疗有效量”是指该酶抑制剂无毒、但足以提供所需治疗以对抗糖尿病并发症或为了其它医学原因而抑制3DG代谢产生(诸如减低衰老作用或减少其中AGE-蛋白形成具有致病作用的其它人类疾病状态)的量。根据物种、年龄和该患者的一般健康状况、并发症的性质、具体的酶抑制剂及其给药模式等，所需的准确量可以变化。
本发明的化合物最好以易于给予和剂量均一性的剂量形式配制。本文所用的剂量单位形式是指适用于待治疗患者的酶抑制剂的物理上独立的单位。每个剂量应该含有计算产生所需治疗效果的活性物质的量，所述活性物质或者为其本身，或者结合选定的药用载体介质。通常，本发明化合物以含有按该制剂的重量计大约1mg至大约2,500mg该化合物的剂量单位给予，其范围最好为大约5mg至大约250mg。
根据待治疗的糖尿病并发症的性质，本发明的化合物可以经口、胃肠外(诸如肌内注射、腹膜内注射、静脉输注等)给予。经口或胃肠外给予的本发明化合物的剂量水平可以大约为每日0.7μg至大约20mg/kg患者体重，最好每日为大约30μg至大约3.5mg/kg患者体重，一日一次或多次，以获得所需的治疗效果。
只要口服剂量能够产生治疗上有活性的血液和/或靶组织水平的抑制剂，则特别优选口服活性的酶抑制剂。本领域技术人员可以容易地测量血液、肾脏和其它靶组织的去蛋白样品中的小分子抑制剂的水平。可以将这些样品中的抑制剂浓度与预定的抑制常数相比。远低于该抑制常数的组织水平提示缺乏治疗活性。在不可逆抑制剂的情况下，这种缺乏可以通过相应组织中FL3P激酶水平的测定而被证实或被驳倒。在所有情况下，可以通过让人类或动物被试者进食富含糖化赖氨酸残基或果糖-赖氨酸的食品，并测定进食前后其尿中3DG和3DF的量，来评估治疗活性。如下文进一步详细描述的，与被试者进行抑制剂治疗之前的分泌水平相比，这些在其系统中具有治疗活性抑制剂的相同被试者的3DG和3DF的分泌均将减少，而果糖-赖氨酸的尿分泌将增加。
本发明化合物通常每日给予一次，最多每日给予4-5次，这取决于选择的恰当的抑制剂。尽管最好是一日一次的给药制度，但糖尿病患者习惯于密切关注其疾病状态，因此，如果需要，他们容易接受更频繁给药制度，以便提供上述日剂量。然而，本文所述化合物和组合物的精确的给药制度，必需取决于单个待治疗患者的需要、给予的治疗类型和主治医师的判断。本文所用的术语“患者”包括人类和动物。
本文所述的抑制剂化合物可用来对抗糖尿病并发症，特别是糖尿病性肾病，它影响多于40％的糖尿病患者，并且是需要透析和移植的晚期肾病的主要原因。另外，这些抑制剂可以用来预防或治疗可归因于AGE-蛋白形成的其它病理学病征，诸如高血压、中风、神经退化性疾病(例如Alzheimers类型的老年性痴呆)、循环性疾病、动脉硬化症、骨关节炎、白内障和衰老的普遍使人衰弱的作用。
初步实验已经表明，严重不利的健康影响是通过长期消费糖化蛋白而刺激赖氨酸回收途径产生的。FL的情况也是如此，在喂食糖化蛋白膳食的实验动物中观察到FL3P、3DG和3DF增加，参见表B。进食这种膳食8个月后，在进食糖化蛋白膳食的动物中观察到类似在糖尿病肾脏中发现的明显的肾病理学证据，如以下实施例10中进一步的描述。在进食少量糖化蛋白的人类志愿者的尿中，也观察到3DG和3DF水平的短暂升高。
表B糖化蛋白％FL3P浓度 3DG/3DF浓度(肾中的nM) (血浆中的μM)0971.4/0.051295 -2.5 605 -5937 -10 1066 3.6/0.1220 1259 5.2/0.1430 1267 6.2/0.28由于这一新发现的赖氨酸回收途径的刺激导致系统3DG水平的显著提高，因此进行一项研究以确定糖化膳食是否对妊娠产生显著作用。迄今获得的结果提示，如在以下的实施例中所表述的，由该途径引起的作用非常强。
此外，众所周知，在大鼠和小鼠的敏感品系中，在早期生活(断奶后)中维持所述动物的膳食可以对1型糖尿病的发生率有显著的影响，发生率为10％-90％。已经在最近十年期间对该现象的研究投入了相当大的努力。例如，参见Diabetes，46(4)589-98(1997)和DiabetesMetab.Rev.，12(4)341-59(1996)和其中引用的参考文献。一些本发明人已经对处于诱导糖尿病两个极端的两种膳食进行了研究。AIN-93(Dyets，Inc.)引起的糖尿病发生率最低，产生的已经观察到的尿3DF/肌苷酸的比率最小(1.0)。Purina 500诱导的糖尿病发生率最高，使3DF/肌苷酸的比率提高2.5倍。由于在大鼠胰脏中观察到FL3P、3DG和3DF，因此可能果糖赖氨酸激酶和该代谢途径中的代谢物参与I型糖尿病的发生。对该类型糖尿病敏感的动物(在人类胰岛素依赖性糖尿病或I型糖尿病中有用的模型)具有异常的免疫系统，这使得它们对胰脏β-细胞中形成的未知抗原敏感，导致动物自身免疫系统对其β-细胞的自身免疫攻击。这导致它们随后被破坏，由此剥夺了该动物制造胰岛素的能力。众所周知，与蛋白反应的3DG可以制造新的抗原位点。因此，各种膳食的抗原特性的来源看来是通过胰脏中果糖赖氨酸-3-磷酸的分解产生的3DG。
此外，因为已知3DG一般与胺反应，所以它可能能够与DNA相互作用，表现出诱变和致癌潜力，并且使蛋白交联。
FL3P赖氨酸回收途径的发现，使得首次可以区分糖尿病患者群体，并确定该群体的哪些亚群可能发生糖尿病并发症。这一确定可以在试验对象的生物流体上常规进行，例如尿、血液组分(特别是血浆或血清)、淋巴液、组织液等。
过夜禁食后，让人类被试者进食含相对高浓度糖化赖氨酸残基的食品源。作为实例，这种食品可以为酪蛋白/糖“曲奇”(诸如以下实施例5中描述的)或某些其它合适的糖化赖氨酸或合成果糖-赖氨酸源的形式。当利用含糖化赖氨酸残基的蛋白时，糖化赖氨酸的含量应该优选为总蛋白氨基酸的0.02-10％，或更优选为大约0.2-0.4％。口服剂量中的糖化赖氨酸残基的总量应该大约为0.3克。最好是，在消费该糖类赖氨酸源之前收集尿样，然后在1小时、3小时和5小时或在各个临床状态可以保证的这类其它合适时间时收集尿样。
测定这些尿样中的3DG和3DF水平，并计算这些代谢物的比率。该测定中使用的具体方法学对于本发明的实践并不重要。如果需要，可以利用以下实施例5中描述的GC法。或者，正如对于本领域技术人员显而易见的，可以使用比色或免疫测定法。
显然，如最近完成的糖尿病控制和糖尿病实验清楚地证明的，糖尿病患者面临的主要风险因素是糖血控制(glycernic control)。然而，糖尿病并发症的发生率不能仅用血糖水平来解释；当将糖尿病并发症的发生率与历史血糖水平进行比较时，观察到相当宽的分布。
确定发生糖尿病并发症风险最大的糖尿病患者群体亚群的一种方法是本发明的一个特别显著的方面。该方法涉及在摄食糖化赖氨酸源之前、最理想的是在其之后，测量FL、3DG和3DF水平。
例如，正常被试者尿中的3DG与3DF之比持续不变，大约为0.025，而糖尿病患者的比率较高，可以高至高5倍或5倍以上。这一点由图7中的数据支持，图7表明，血糖正常者的3DG/3DF之比为0.025(1/39.77)，在该数值附近分布相当紧密，而糖尿病患者的比率高于平均比率2倍(平均0.069)，而且在该平均值附近相当分散。
如本文证明的，糖尿病患者3DG的产生增加。因此，抗糖尿病并发症需要高度有效地去除这种毒性代谢物。用本文所述方法计算的3DG与3DF之比，使得人们可以评估3DG解毒途径的效力。比率低的那些个体一般对发生糖尿病并发症有抗性。比率较高(包括在正常范围内包括的比率)的个体风险较高，而比率高于正常范围的个体尤其有发生这些并发症的风险。
最近对四个不同大鼠品系的血浆和尿中果糖赖氨酸(FL)的测量已经证明在下述情况下有相当大的变异性，即在这些大鼠中它们各自的肾脏加工血液中的FL。根据该化合物及其代谢物与肌酸酐之比，在四个品系中的两个品系(Long Evans、褐色挪威(Brown Norway))中，实际上肾过滤的所有FL均出现在尿中。至于其它两个品系(Sprague Dawley、Fischer)，根据与肌酸酐过滤的比较，血浆中10-20％的FL出现在尿中。这些测量结果强烈地提示在哺乳动物肾脏中FL加工的主要变异性。如果已知啮齿动物和人类的肾脏的功能相当，则假定在人类中存在FL加工的相似变异是合理的。由于FL主要输入至果糖赖氨酸回收途径，因此，在从超滤吸收大量FL的那些人中这整个途径可能受显著刺激，导致肾脏中3-脱氧葡萄糖醛酮(3DG)的局部水平高，整个机体系统水平也高。这一观察可以用作诊断试验的基础，其中同时期获得的血浆样品或血清样品与尿样的比较，将确定FL流入肾脏的通量以及出现在尿中的通量的分数。该比率大致低于1的那些个体则将具有发生种种肾病理学的风险，包括但不限于糖尿病性肾病、老年时的肾衰竭和肾癌。
采用赖氨酸回收途径的测试，可以容易和安全地确定本发明激酶抑制剂的治疗效力。该测试方案与以上刚刚提出的方法相同，只是除测定尿3DG和3DF水平外，还测定尿的果糖赖氨酸水平。在开始FL3P激酶抑制剂治疗之前和之后进行该测试是有用的。在每个时间点将尿中3DG和3DF的水平相加，将其与同一样品中测定的果糖-赖氨酸水平相比较。
在摄食富含糖化赖氨酸残基的食品后，在尿中发现的3DG和3DF峰值水平得自赖氨酸回收途径的活性。这些代谢物与未反应的果糖-赖氨酸(这是人尿的正常组分)的浓度比反映出该途径的活性。抑制赖氨酸回收途径，将引起排泄的3DG和3DF的量减少，而果糖-赖氨酸的排泄水平提高。因此，可以通过测量治疗开始后(3DG+3DF)/果糖-赖氨酸之比的降低，定量测定激酶抑制剂的治疗效力。值得注意的是，尿体积或代谢物浓度不是阐明该测定中的因素，因为仅仅考虑代谢物的比率。
人们从以上公开内容中会认识到，经口摄入的含高浓度糖化赖氨酸残基的食品，会导致产生肾脏和血清的3DG。比较好的是提醒例如糖尿病患者的有肾病风险的个体避免这些高浓度的食品。可以采用各种各样的方法，测定糖化赖氨酸残基的浓度。在以下实施例4中描述了一个这样的测定方法。然而，精确测定糖化赖氨酸残基水平的任何合适的测量方法均可以代替以上例举的测定方法。具体设想的测定方法的实例包括但不限于比色法和免疫法。
无论使用何种测量方法，测定预制食品中糖化赖氨酸残基的含量以及将这些测定通知有发生肾功能障碍风险的个人，使得这些个人可以避免摄食糖化赖氨酸含量高的食品，均属于本发明范围。
提供以下实施例以进一步详细地描述本发明。提供这些实施例仅仅为了说明，决不应该解释为限制本发明。这些实施例中给出的所有温度均以摄氏度计，除非另外指明。
实施例1FL3P的分离和鉴定对糖尿病大鼠肾脏的高氯酸提取物的31PNMR分析，显示于6.24ppm的一个新的一磷酸糖的共振，这在非肾脏组织中未观察到，而且在非糖尿病肾脏中水平大大降低。通过将该提取物在微晶纤维素柱色谱分离，采用1-丁醇-乙酸-水(5∶2∶3)作为洗脱剂，分离引起观察到的共振的化合物。通过质子2D COSY，测定该结构为3-磷酸果糖-赖氨酸。后来通过给动物注射按先前所述(Finot和Mauson，Helv.Chim.Acta，521488(1969))制备的FL，并且表明直接磷酸化为FL3P，而证实这一点。使用于3位特异性氘化的FL证实磷酸位置为碳-3。这通过分析偶合和去偶合的31P NMR光谱来进行。正常的P-O-C-H偶合在FL3P中产生双峰，J值为10.3Hz，而P-O-C-D没有偶合，偶合和去偶合的均产生单峰，发现3-氘化FL3P也是同样。FL3P的独特特性是，当用硼氢化钠处理时，它转化为于5.85ppm和5.95ppm的两个新共振，这对应于甘露糖醇和3-磷酸山梨糖醇-赖氨酸。
实施例2FL3P的合成将1mmol 3-磷酸二苄基-葡萄糖和0.25mmolα-苄酯基-赖氨酸在50ml MeOH中回流3小时。用100ml水稀释该溶液，并在吡啶鎓形式的Dow-50柱(2.5×20cm)上进行色谱分离，首先用水(200ml)洗脱，然后用600ml缓冲液(0.1M吡啶和0.3M乙酸)洗脱。靶化合物于水洗涤结束和缓冲液洗涤开始时洗脱。于20psi氢气下用5％Pd/C去除cbz和苄基封闭基团，产生FL3P，得率为6％。
实施例3由FL和ATP酶促产生FL3P以及筛选抑制剂的测定首先用31P NMR证明肾皮质中的激酶活性。将3g新鲜猪肾皮质样品在9ml50mM pH7.5 Tris·HCl中匀浆，所述Tris·HCl含有150mM KCl、5mM DTT、15mM MgCl2。将其以10,000g离心30分钟，然后上清液以100,000g离心60分钟。加入硫酸铵至60％饱和度。于4°1小时后，离心收集沉淀，并将其溶于5ml原始缓冲液中。将2ml等分样品的该溶液与10mM ATP和10mM FL(按以上实施例1制备)于37°温育2小时。反应用300uL高氯酸猝灭，离心除去蛋白，在Sephadex G 10柱(5×10cm)上脱盐。对反应混合物的31P NMR分析检测到FL3P的形成。
根据由此获得的激酶活性的证明，开发出放射性测定。该测定设计利用FL3P缺乏与Dow-1阴离子交换树脂的结合。在努力分离FL3P期间发现FL3P的特征。由于大多数磷酸结合于该树脂，因此推测与ATP反应的所有化合物中的大多数以及任何过量的ATP将结合，将FL3P留在溶液中。第一步是测定去除该测定中的ATP所需的树脂量。通过将所述混合物吸移到0.9ml水中的200mg Dow-1的悬浮液中，涡旋混合并离心以装填树脂，完成这一步。从中将0.8ml上清液吸移到200mg新的干树脂上，涡旋混合并离心。将0.5ml体积的上清液吸移到10ml Ecoscint A中并计数。残留的计数为85cpm。该方法用于该测定。于4°将来自粗皮质匀浆60％硫酸铵沉淀的沉淀物，重新溶于匀浆缓冲液中。该测定物含有0.1ml 50mM pH7.5 Tris·HCl中的10mMγ33P-ATP(40,000cpm)、10mM FL、150mM KCl、15mM MgCl2、5mM DTT。采用1mg、2mg和4mg蛋白于37°以三份重复进行30分钟的测定，确定FL3P的产生速率和酶浓度之间的关系。减去无FL的并流洗脱的空白，并记录数据。观察到的活性相当于大约20nmols/hr./mg.蛋白的FL3P合成速率。
实施例4用葡甲胺和各种多元醇赖氨酸抑制3-脱氧葡萄糖醛酮的形成a.通用的多元醇赖氨酸的合成。
将糖(11mmoles)、α-苄酯基-赖氨酸(10mmols)和NaBH3CN(15mmoles)溶于50ml MeOH-H2O(3∶2)中，于25°搅拌18小时。用过量的Dow-50(H)离子交换树脂处理该溶液，以分解过量的NaBH3CN。将该混合物(液体加树脂)转移到Dow-50(H)柱(2.5×15cm)上，用水充分洗涤，以去除过量的糖和硼酸。用5％NH4OH洗脱苄酯基-多元醇赖氨酸。将蒸发获得的残留物溶于水-甲醇(9∶1)中，采用10％钯炭催化剂用氢气(20psi)还原。过滤并蒸发产生所述多元醇赖氨酸。
b.用山梨糖醇赖氨酸、甘露糖醇赖氨酸和半乳糖醇赖氨酸降低尿和血浆3-脱氧葡萄糖醛酮的实验方案。
收集6只大鼠3小时的尿液。也获得血浆样品。然后通过腹膜内注射，给予所述动物10μmols或者山梨糖醇赖氨酸、甘露糖醇赖氨酸或者半乳糖醇赖氨酸。收集另外3小时的尿液，在此3小时结束时获得血浆样品。
如以下实施例5中所述，测定这些样品中的3-脱氧葡萄糖醛酮，将可变体积对肌酸酐归一化。对于尿3-脱氧葡萄糖醛酮的平均降低，用山梨糖醇赖氨酸降低50％，用甘露糖醇赖氨酸降低35％，而用半乳糖醇赖氨酸降低35％。对于血浆3-脱氧葡萄糖醛酮，用山梨糖醇赖氨酸降低40％，用甘露糖醇赖氨酸降低58％，而用半乳糖醇赖氨酸降低50％。
c.使用葡甲胺降低尿3-脱氧葡萄糖醛酮。
按紧接上面的b)中所述处理3只大鼠，只是腹膜内注射葡甲胺，而不是注射上述赖氨酸衍生物。注射后3小时，尿中的平均3-脱氧葡萄糖醛酮降低42％。
实施例5提入糖化蛋白后人类的尿FL、3DG和3DF的升高a.含糖化蛋白食品的制备将260g酪蛋白、120g葡萄糖和720ml水混合，得到均一的混合物。将该混合物转移至金属盘上，于65°蒸煮68小时。然后将产生的饼状物磨成粗粉。
用凯氏法测定，该粉末含有60％蛋白。
b.糖化赖氨酸含量的测定通过与6N HCl回流20小时，将在以上步骤a.中制备的1g粉末水解。用NaOH溶液，将产生的溶液调至pH1.8，并稀释至100ml。在氨基酸分析仅上，以得自果糖赖氨酸酸水解的产物furosine，测定果糖赖氨酸含量。以该方法，测定该饼状物含有5.5％(w/w)果糖赖氨酸。
c.实验方案志愿者用2天进食无果糖赖氨酸的膳食，然后消费按本文所述制备的22.5g食品，由此有效地接受2g剂量的果糖赖氨酸。以2小时间隔收集14小时的尿，最后于24小时收集一次。
d.尿中FL、3DG和3DF的测量采用46°的Water C18无氨基酸柱，用乙腈-甲醇-水(45∶15∶40)至乙腈-乙酸钠-水(6∶2∶92)的梯度洗脱系统以1ml/min洗脱，用具有Waters 996二极管阵列的HPLC测定FL。定量测定使用葡甲胺内标。
将该样品去离子后，用HPLC测定3DF。在Dionex DX-500 HPLC系统中进行分析，该系统使用一个PA1柱(Dionex)，用32mM氢氧化钠以1ml/min洗脱。根据以合成3DF每日获得的标准曲线进行定量。
将该样品去离子后，通过GC-MS测定3DG。用PBS中过量10倍的二氨基萘得到3DG。乙酸乙酯萃取产生无盐组分，用Tri-Sil(Pierce)将其转化为三甲基硅醚。在Hewlett-Packard 5890选定离子监测GC-MS系统上进行分析。在熔凝硅石毛细管柱(DB-5，25mx.25mm)上，采用以下温度程序进行GC注射口250°，起始柱温150°，将该柱温保持1分钟，然后以16°/分钟升至290°，保持15分钟。3DG的定量使用选定的离子监测，采用U-13C-3DG内标。
图3所示的图表示一个志愿者在消费所述糖化蛋白后尿中的FL、3DF和3DG的产生。非常明显的是，所有三种代谢物均快速出现。3DF和3DG均表现出甚至在24小时后也略微升高。
图4所示的图表示7人测试组的每个成员中3DF的形成。在所有情况下均观察到相似的图式。如图4所显示的，在FL大药丸摄入后(after the FL bolus)大约4小时，3DF的排泄达到峰值，甚至在该大药丸摄入后24小时，也可注意到3DF略微升高。
实施例6进食实验N-乙酰-β-葡糖胺酶(NAG酶)是糖尿病患者中以提高的浓度排泄到尿中的一种酶。人们认为它是一种肾小管损害的早期标记，但尚未充分了解尿中NAG酶增加的发病机理。已经提出，在糖尿病患者中NAG酶尿输出增加是由糖尿病诱导的近端小管中溶酶体的激活引起的，向尿中的输出增加，而不是细胞破坏。
该实施例中获得的结果表明，在所有的比较中，3DF和NAG酶的水平在实验组中均相对于对照升高。因此，喂食糖化蛋白的动物将过量的NAG酶排泄到其尿中，类似于糖尿病患者获得的结果。与对照动物相比，NAG酶的输出增加大约50％。于对照相比，这些动物尿中的3DF也增加5倍。如在图5和图6中可以见到的，尿3DF与3DG的相关性极其好。两种化合物看来均以肾小球过滤速率从血浆中去除，没有重吸收。
实施例7肾脏蛋白的SDS凝胶每日给2只大鼠注射5μmols或者FL或者甘露糖醇(用作对照)，注射5天。处死动物，取出肾脏，将其解剖为皮质和髓质。将组织在5倍体积的50mM pH7.5 Tris·HCl中匀浆，该Tris·HCl含有150mM KCl、15mM MgCl2和5mM DTT。以10,000g离心15分钟除去细胞碎片，然后上清液以150,000g离心70分钟。在12％聚丙烯酰胺凝胶以及在4-15％和10-20％梯度凝胶上，通过SDS PAGE分析可溶性蛋白。在所有情况下，与注射甘露糖醇的动物相比时，来自注射FL的动物的肾脏提取物，其分子量较低的条带消失或目测减少。
实施例83-O-甲基果糖赖氨酸的合成将30ml甲醇和15ml甘油中的19.4g(0.1mol)无水3-O-甲基葡萄糖和1g亚硫酸氢钠的悬浮液回流30分钟，然后加入0.035mol α-苄酯基-赖氨酸和4ml乙酸。将该溶液回流3小时。该溶液用1倍体积的水处理，并在吡啶鎓形式的Dowex-50柱(4×50cm)上进行色谱分离，首先用水洗脱，然后用乙酸吡啶鎓洗脱。合并并蒸发含有纯品物质的组分。将所得的物质溶于50ml水-甲醇(9∶1)中，并采用10％钯炭催化剂，用氢气(20psi)还原。过滤和蒸发产生3-O-甲基-果糖赖氨酸。
例如可以通过用诸如果糖的糖化剂，将选定的含氮或含氧原料(它可以是氨基酸、多氨基酸、肽等)糖化，制备具有以上式(I)结构的其它具体化合物，如果需要，可以按照本领域技术人员熟知的方法进行化学修饰。
实施例9FL3P激酶活性的另一种测定a.母液的制备制备测定缓冲液，它为100mM HEPES pH8.0、100mM ATP、2mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM PMSF。制备2mM果糖基-精胺HCl的果糖基-精胺母液。制备2mM精胺HCl的精胺对照溶液。
b.果糖基-精胺的合成通过已知方法(J.Hodge和B.Fisher，Methods Carbohydr.Chem.，299-107(1963))的修改方法，进行果糖基-精胺的合成。在50ml甲醇-水(1∶1)中，以8∶4∶1(精胺∶葡萄糖∶焦亚硫酸盐)的摩尔比，制备精胺(500mg)、葡萄糖(500mg)和焦亚硫酸钠(80mg)的混合物，将其回流12小时。用水将该产物稀释至200ml，上样至DOW-50柱(5×90cm)。用2倍柱体积的水去除未反应的葡萄糖，用0.1M NH4OH除去该产物和未反应的精胺。冻干合并的该产物的峰组分，通过测定该产物的定量13C NMR光谱中的C-2果糖基峰的积分(以45°脉冲、10秒弛豫延迟(relaxation delay)以及无NOE去偶合收集的NMR数据)，测定果糖基-精胺的浓度。
c.用于纯化的激酶测定制备温育混合物，包含10μl酶制剂、10μl测定缓冲液、1.0μCi33P ATP、10μl果糖基-精胺母液和70μl水，于37°温育1小时。温育结束时，将90μl(2×45μl)该样品点样至两个2.5cm直径的磷酸纤维素圆盘(WhatmanP-81)上，让其干燥。将圆盘用水彻底洗涤。干燥后，将圆盘置于闪烁小瓶中并计数。
以双份试样测定每个酶组分与合适的精胺对照。
实施例10在维持糖化蛋白膳食的实验动物中观察到的肾脏病理学让3只大鼠维持糖化蛋白膳食(20％总蛋白；3％糖化)8个月，将其与维持对照膳食的9只同龄大鼠相比。初步发现在维持糖化膳食的动物中损害的肾小球显著增加。在这些动物中观察到的典型病灶是肾小球(glomerular tuft)节段硬化并粘附于肾小囊、壁上皮肾小管组织变形和间质性纤维变性。维持糖化蛋白膳食的所有3只动物和维持对照膳食的动物中的仅1只动物，表现出损害的肾小管多于13％。这种现象偶然发生的可能性低于2％。除在肾小球中观察到的病理学外，还观察到肾小管中的许多hylinated casts。尽管没有对这些hylinatedcasts进行定量，但这些hylinated casts在维持糖化膳食的动物中发现得更多。在维持糖化膳食的动物中也观察到NAG酶水平提高。
从该实验结果来看，糖化膳食看来引起实验动物发生类似于糖尿病肾脏中观察到的一系列组织学病变。
实施例11糖化膳食对妊娠的影响在一个初步实验中，让5对小鼠维持糖化膳食(18％总蛋白；3％糖化)，在7个月期间生育6次。发生的6次妊娠产下以下活幼鼠17只、23只、13只、0只、3只和0只。根据第3次生育后活幼鼠数的这种急剧下降，让2群10对小鼠每对维持或者糖化膳食(13％总蛋白；3％糖化)或者对照膳食(13％总蛋白；0％糖化)。到现在为止，这2组幼鼠已经生育4次，2组中获得相似的结果。第一次妊娠产下49/20(糖化/对照)只幼鼠；第二次妊娠产下18/41只幼鼠；第三次妊娠产生37/27只幼鼠；第四次妊娠产下20/33只幼鼠。第五次妊娠目前正在进行中。已经对这些小鼠进行了高血糖测试。在实验组和对照组中，血液葡萄糖水平分别为120mg/dl和112mg/dl。
在小鼠尿中3DF水平的初步测定正如预期的，表明当维持本文所述糖化膳食时，系统3DF显著升高(大约5-10倍)。
实施例12果糖赖氨酸途径的致癌作用为了研究在果糖赖氨酸途径中形成的代谢物的致癌潜力，在对肾癌具有高度敏感性的一个大鼠品系上已经进行了实验。让4只大鼠维持糖化蛋白膳食，3只大鼠维持对照膳食。维持该膳食十周后，处死这些动物，检查其肾脏。在维持该膳食的所有4只动物中，发现肾癌的尺寸大于1mm，而在对照动物中发现病灶没有这样大。这种情况偶然发生的可能性低于2％。该数据表明，在肾小管细胞(已知为大多数肾癌起源的细胞)中发现的、来自动物膳食中的糖化蛋白的过量果糖赖氨酸引起的提高水平的3DG，可以与细胞DNA相互作用，导致种种诱变事件，最终导致致癌事件。存在这种可能性，该过程在人类肾脏和其它部位癌症的发生中是重要的。
尽管以上已经描述和/或例举了本发明的一些实施方案，但根据以上的公开内容，各种其它实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明不限于描述和/或例举的具体实施方案，而是能考虑变化和修改，而不脱离所附的权利要求书的范围。
表A化合物名称 X R R1Y Z3-O-甲基果糖赖氨酸-N-H
-O-CH3半乳糖醇赖氨酸同上 同上 同上
-OH3-脱氧山梨糖醇赖氨酸 同上 同上 同上 同上 -H
3-羧基木糖赖氨酸 同上 同上
-COO-3-磺酸果糖gaba 同上
同上
1，3-二脱氧-3-氟-塔格糖吗啉吗啉 同上 同上 F3-脱氧-景天庚酮糖醇精胺 -N-CH3
Ha-赖氨酸残基b-γ-氨基丁酸残基c-精胺残基
权利要求
1.具有酶抑制活性的化合物，所述化合物有效地抑制果糖-赖氨酸酶促转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸，所述活性通过一种测定方法测定，该方法包括提供一种水溶液，它含有预定量的果糖-赖氨酸、三磷酸腺苷、果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源和所述化合物；使所述溶液经受促进生成果糖-赖氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷的条件，果糖-赖氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷为所述激酶、所述果糖-赖氨酸和所述三磷酸腺苷相互作用产生的产物；并且测定至少所述产物之一的产量，与没有加入所述化合物的相同相对量的果糖-赖氨酸、三磷酸腺苷和果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源的水溶液相比，所述化合物减少所述产物的量。
2.按照权利要求1的化合物，其中所述果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源为肾组织。
3.按照权利要求1的化合物，其中所述果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源为红细胞或其祖细胞。
4.按照权利要求1的化合物，其中所述果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源为外周神经组织。
5.按照权利要求1的化合物，其中所述果糖-赖氨酸-3-磷酸激酶源为晶状体组织。
6.按照权利要求1的化合物，其中所述果糖-赖氨酸-3-磷酸源为胰腺组织。
7.按照权利要求1的化合物，其中所述化合物表现出竞争性或非竞争性酶抑制，并且抑制常数(Ki)小于大约1mM。
8.按照权利要求1的化合物，另外(i)其分子量低于大约2,000道尔顿；(ii)其生理盐水或血清中的溶解度不低于10μM；以及(iii)在生理盐水或血清中温育至少1小时后，保留至少50％的其酶抑制活性。
9.具有下式结构的化合物以及所述化合物的异构体和药学上可接受的盐
其中X为-NR’-或-O-，R’选自H、线性或支链烷基(C1-C4)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下的取代基H、氨基酸残基、多氨基酸残基、肽链、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代)、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代，并且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分中断)，R”为线性或支链烷基(C1-C6)以及未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X代表-NR’时，R和R’同它们连接的氮原子一起也可以代表一个具有5-7个环原子的取代或未取代的杂环，氮和氧中的至少一个是所述环中仅有的杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)以及所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1为具有1-4个线性碳原子的多元醇部分，Y为或者羰基部分
或亚羟甲基部分
Z选自-H、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2。
10.用于预防、减少或延迟糖尿病患者中糖尿病并发症发作的药用制剂，包含作为活性药剂的按照权利要求1的化合物和一种药学上可接受的载体。
11.按照权利要求10的药用制剂，还包含抗高血压药物和补充活性药剂。
12.按照权利要求10的液体形式的药用制剂。
13.按照权利要求12的药用制剂，其中所述药学上可接受的载体为所述活性药剂在其中可溶的液体。
14.按照权利要求10的片剂形式的药用制剂。
15.按照权利要求14的药用制剂，其中所述片剂具有时间释放包衣。
16.按照权利要求14的药用制剂，其中所述片剂具有肠溶衣。
17.在有发生糖尿病并发症风险的患者中预防、减少或延迟所述并发症发作的方法，包括给予所述患者有效抑制果糖-赖氨酸酶促转化为果糖-赖氨酸-3-磷酸的化合物，其给予量足以抑制所述转化。
18.按照权利要求17的方法，其中所述化合物具有下式结构
其中X为-NR’-或-O-，R’选自H、线性或支链烷基(C1-C4)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下的取代基H、氨基酸残基、多氨基酸残基、肽链、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代)、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代，并且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分中断)，R”为线性或支链烷基(C1-C6)以及未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X代表-NR’时，R和R’同它们连接的氮原子一起也可以代表一个具有5-7个环原子的取代或未取代的杂环，氮和氧中的至少一个是所述环中仅有的杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)以及所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1为具有1-4个线性碳原子的多元醇部分，Y为或者羰基部分
或亚羟甲基部分
Z选自-H、-OH、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2，以及所述化合物的异构体和药学上可接受的盐。
19.如权利要求18中要求保护的方法，其中所述化合物为选自葡甲胺、山梨糖醇赖氨酸、甘露糖醇赖氨酸和半乳糖醇赖氨酸中的至少一种。
20.按照权利要求17的方法，其中所述化合物结合作为补充活性药剂的一种抗高血压药物一起给予。
21.按照权利要求17的方法，其中所述糖尿病相关的病理学病征选自糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病或糖尿病性外周神经病。
22.按照权利要求17的方法，其中口服所述化合物。
23.糖尿病患者经历糖尿病相关的病理学病征风险的评估方法，所述方法包括给予所述患者糖化赖氨酸残基源，其给予量提供每公斤体重至少大约0.05克至大约0.3克的所述糖化赖氨酸残基；并且以无糖尿病临床症状的个体中的3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比为基准，测定得自所述患者的至少一种生物样品中3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比，与所述无症状个体相比，所述糖尿病患者中3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比较高，表明所述糖尿病患者经历所述糖尿病相关的病理学病征的风险较高。
24.按照权利要求23的方法，其中所述糖尿病相关的病理学病征选自糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病或糖尿病性外周神经病。
25.按照权利要求23的方法，其中所述糖化赖氨酸残基源经口给予所述糖尿病患者。
26.按照权利要求23的方法，其中所述生物样品为尿。
27.糖尿病患者经历糖尿病相关的病理学病征风险的评估方法，所述方法包括以禁食中的无糖尿病临床症状的个体中的3DG与3DF之比为基准，测定得自禁食一段时间后所述患者的至少一种生物样品中3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比，所述糖尿病患者中3-脱氧葡萄糖醛酮与3-脱氧果糖之比较高，表明所述糖尿病患者经历所述糖尿病相关的病理学病征的风险较高。
28.按照权利要求27的方法，其中所述糖尿病相关的病理学病征选自糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病或糖尿病性外周神经病。
29.按照权利要求27的方法，其中所述糖化赖氨酸残基源经口给予所述糖尿病患者。
30.按照权利要求27的方法，其中所述生物样品为尿。
31.治疗干涉预防糖尿病并发症的效力的评估方法，所述方法包括测定得自所述治疗干涉开始前后的所述糖尿病患者的生物样品中3-脱氧葡萄糖醛酮、3-脱氧果糖和果糖-赖氨酸的浓度，将所述3-脱氧葡萄糖醛酮和3-脱氧果糖的浓度之和与所述样品中的果糖-赖氨酸浓度相比，与取自该治疗干涉开始之前的生物样品相比，在取自治疗干涉开始之后的所述生物样品中，3-脱氧葡萄糖醛酮和3-脱氧果糖的浓度之和相对于果糖-赖氨酸浓度的降低，为该治疗干涉效力的指示。
32.按照权利要求31的方法，其中所述生物样品为尿。
33.按照权利要求31的方法，其中在禁食一段时间后获得所述生物样品。
34.按照权利要求31的方法，其中在口服每公斤体重含0.05至大约0.3所述糖化赖氨酸的糖化赖氨酸源之后，获得所述生物样品。
35.报告糖尿病病人一种包装食品导致发生糖尿病相关的病理学病征的潜力的方法，该方法包括测量所述食品中糖化赖氨酸残基的含量，并且在该食品的包装上或在计划让糖尿病患者使用的出版物中提供所述测量结果。
36.在患者中预防由AGE-蛋白形成引起的病理学病征的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的抑制所述患者产生3-脱氧葡萄糖醛酮的化合物。
37.如权利要求36中要求保护的方法，其中所述病理学病征选自高血压、中风、神经退化性疾病(例如Alzheimers类型的老年性痴呆)、循环性疾病、动脉硬化症、骨关节炎、白内障。
38.如权利要求36中要求保护的方法，其中所述化合物具有下式
其中X为-NR’-或-O-，R’选自H、线性或支链烷基(C1-C4)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R为选自以下的取代基H、氨基酸残基、多氨基酸残基、肽链、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代)、线性或支链脂族基(C1-C8)(该基团为未取代的或用至少一个含氮或含氧取代基取代，并且被至少一个-O-、-NH-或-NR”-部分中断)，R”为线性或支链烷基(C1-C6)以及未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是当X代表-NR’时，R和R’同它们连接的氮原子一起也可以代表一个具有5-7个环原子的取代或未取代的杂环，氮和氧中的至少一个是所述环中仅有的杂原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)以及所述杂环取代基选自H、烷基(C1-C6)、卤素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1为具有1-4个线性碳原子的多元醇部分，Y为或者羰基部分
或亚羟甲基部分
Z选自-H、-OH、-O-烷基(C1-C6)、-卤素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2，以及所述化合物的异构体和药学上可接受的盐。
39.如权利要求38中要求保护的方法，其中所述化合物为选自葡甲胺、山梨糖醇赖氨酸、甘露糖醇赖氨酸和半乳糖醇赖氨酸中的至少一种。
40.在试验动物中诱导病理学病征的方法，所述病理学病征选自糖尿病性肾病、糖尿病性神经病、糖尿病性大血管病(macroangiopathy)、糖尿病性视网膜病、心血管病、神经变性性疾病、胰岛素依赖性糖尿病、糖尿病相关的出生缺陷和癌症，所述方法包括给所述试验动物喂食糖化蛋白膳食，相对于来自喂食大体不含所述糖化蛋白的膳食的相同物种动物的生物流体的3DG含量，其喂食量和时间足以维持所述试验动物的生物流体的3DG含量。
全文摘要
公开了一类化合物,它们在一个新发现的代谢途径中的一个ATP依赖性反应中,抑制果糖－赖氨酸酶促转化为果糖.赖氨酸－3－磷酸。根据该途径的正常功能,果糖－赖氨酸－3－磷酸(FL3P)分解形成游离的赖氨酸、无机磷酸和3－脱氧葡萄糖醛酮(3DG)。3DG为一种反应性蛋白修饰剂。3DG可以通过将其还原为3－脱氧果糖(3DF)解毒,或它可以与内源蛋白反应,形成高级糖化终产物修饰的蛋白(AGE－蛋白),认为这些蛋白是形成糖尿病并发症的原因之一。也公开了一种使用这类抑制剂减少AGE－蛋白形成的治疗方法,由此减轻、减少和延迟糖尿病并发症,也公开了评估糖尿病患者发生并发症风险的方法以及通过测定经口给予含果糖－赖氨酸食品后生物样品中3DG与3DF之比来确定公开的抑制剂治疗的效力的方法。
文档编号A61K31/7028GK1251521SQ98803748
公开日2000年4月26日 申请日期1998年2月5日 优先权日1997年2月5日
发明者T·R·布朗, F·卡普勒, B·什维戈尔德, S·拉尔, 苏邦瑛 申请人:福克斯契思癌症中心