治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用，该组合物由以下重量份的组分制成：白芍1-5重量份、知母1-5重量份、苦参1-5重量份、化橘红1-5重量份。该药物组合物可通过醇提或水提方法制备得到。上述药物组合物对于治疗和预防糖尿病及其肾并发症具有显著性效果。
【专利说明】治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是指糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，又称糖尿病肾小球硬化症，DN可以看作为糖尿病微血管并发症之一，除此之外还包括糖尿病视网膜病变和糖尿病神经病变。DN是糖尿病最常见的并发症，其发病率随着糖尿病的快速增长而逐年上升，已成为引起终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因之一，过去20年DN的发病率一直在增加。西方国家的DN占ESRD的25%~42%，中国的DN占ESRD的6%~10%，ESRD的治疗花费巨大。
[0003]目前西药治疗ESRD，没有理想的药物。中药复方具有多组分、多靶点的特点，开发在降血糖的同时治疗糖尿肾并发症的复方具有可能性和空间。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种能有效治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物。
[0005]本发明的另一目的是提供上述药物组合物的制备方法。
[0006]本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0007]—种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成:
[0008]白芍1-5份、知母1-5份、苦参1-5份、化橘红1-5份。
[0009]该组合物优选由以下重量份的组分制成:
[0010]白芍1-3份、知母1-3份、苦参1-3份、化橘红1-3份。
[0011]该组合物进一步优选由以下重量份的组分制成:
[0012]白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份；
[0013]白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红1份；
[0014]白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红1份；
[0015]白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红2份；
[0016]白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红2份；
[0017]白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红2份；
[0018]白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红3份；
[0019]白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红3份；
[0020]白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红3份；
[0021]白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红1份；
[0022]白芍1份、知母1份、苦参 1份、化橘红2份；
[0023]白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红3份；[0024]白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红1份；
[0025]白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红3份；
[0026]白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红2份；
[0027]白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红1份。
[0028]该组合物最优选由以下重量份的组分制成:白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份。
[0029]上述组合物与药学上可接受的载体制成制剂。所述的制剂为口服液、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂或注射剂。
[0030]上述组合物可通过醇提方法制备得到，具体的制备方法包括以下步骤:称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量浓度为10%-90%的乙醇加热回流提取1-3次，每次提取1-3小时，过滤，合并滤液，浓缩。优选乙醇质量浓度为60%-70%。
[0031]上述组合物也可以通过水提方法制备得到，具体的制备方法包括以下步骤:称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量水，加热提取1-3次，每次提取0.5-1小时,过滤,合并滤液,浓缩。
[0032]本发明药物组合物可在制备治疗或预防糖尿病及其肾并发症的药物中的应用。所述的糖尿病引起的肾并发症为肾损伤。
[0033]白芍味苦、酸，微寒，具有平肝止痛、养血调经，敛阴止汗的功效。知母(RhizomaAnemarrhenae)味苦、甘,寒、功效清热湾火,生津润燥。苦参(Sophora flavescens)味苦；性寒、功效清热燥湿，杀虫(外用)，利尿。化橘`红(Exocarpium citrl Grandis,Pummelo Peel)味辛、苦，温，功效散寒，燥湿，利气，消痰。发明人综合上述原料药材的优势，结合现代新药研究手段，研制出能有效治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物，该药物组合物还具有使用安全、起效快的特点。
[0034]与现有技术比较本发明的有益效果:本发明具有显著的降低血糖及治疗糖尿病肾并发症的作用；与阳性对照药二甲双胍、消渴丸、二甲双胍加羟苯磺酸钙合用相比，总体药效具有优效性；该组方同时具有组方创新性和活性创新性。
[0035]以下通过具体试验例对上述效果进行进一步说明:
[0036]试验例1.HepG2细胞胰岛素抵抗模型实验
[0037]治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物由白芍、知母、苦参、化橘红味药物组成。白芍、知母、苦参、化橘红四种药物可以在1-5:1-5:1-5:1-5的重量比例范围内任意组合。现列出该药物组合物的药物组合序号和该序号下的4味药物的组合比例关系。下列药物组合物的重量比例关系和序号，在后面的体外抑制α糖苷酶实验、胰岛素增敏实验、促进胰岛素分泌实验和修复高微血管内皮损伤实验以及糖尿病大鼠模型实验中也具体使用到。
[0038]组方I组:白苟:知母:苦参:化橘红=1:2:3:1
[0039]组方2组:白芍:知母:苦参:化橘红=2:3:1:1
[0040]组方3组:白苟:知母:苦参:化橘红=3:1:2:1
[0041]组方4组:白苟:知母:苦参:化橘红=1:2:3:2
[0042]组方5组:白苟:知母:苦参:化橘红=2:3:1:2
[0043]组方6组:白苟:知母:苦参:化橘红=3:1:2:2[0044]组方7组:白苟:知母:苦参:化橘红=1:2:3:3
[0045]组方8组:白苟:知母:苦参:化橘红=2:3:1:3
[0046]组方9组:白苟:知母:苦参:化橘红=3:1:2:3
[0047]组方10组:白苟:知母:苦参:化橘红=1:1:1:1
[0048]组方11组:白苟:知母:苦参:化橘红=1:1:1:2
[0049]组方12组:白苟:知母:苦参:化橘红=1:1:1:3
[0050]组方13组:白苟:知母:苦参:化橘红=2:2:2:1
[0051]组方14组:白苟:知母:苦参:化橘红=2:2:2:3
[0052]组方15组:白苟:知母:苦参:化橘红=3:3:3:2
[0053]组方16组:白苟:知母:苦参:化橘红=3:1:1:1
[0054]1.实验材料:
[0055]细胞株:肝癌细胞(HepG2)，FROM ATCC，中国药科大学国家新药筛选中心。
[0056]试药:高糖DMEM培养基(批号:914292, Gibco公司)；低糖DMEM培养基(批号:914292, Gibco公司);胰蛋白酶(Amresco，USA);胎牛血清(赛默飞世尔公司);MTT ；DMS0 (南京化学试剂有限公司)；棕榈酸；葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
[0057]2.相关试剂和培养基的配制:
[0058]低糖DMEM培养基的配制:
[0059]I袋DMEM+800ml蒸馏水于磁力搅拌器上搅拌Ih ;再加3.7g (实际上称得3.7005g)NaHC03+0.06g青霉素(实际上称得0.0604g) +0.1006g链霉素(实际上称得0.1006g)，搅拌3h以上；0.22 μ m滤过除菌，放于4°C保存备用。
[0060]高糖DMEM的配制:
[0061]I袋DMEM+800ml蒸馏水于磁力搅拌器上搅拌Ih ;再加3.7g (实际上称得3.7005g)NaHC03+0.06g青霉素(实际上称得0.0604g) +0.1006g链霉素(实际上称得0.1006g)，搅拌3h以上；0.22 μ m滤过除菌，放于4°C保存备用。
[0062]胰蛋白酶消化液配制:
[0063]称取胰蛋白酶0.25g，置于100ml的烧杯中，量取100mlPBS溶液，磁力搅拌溶解Ih0 lX10_7mol/L胰岛素的高糖DMEM诱导液的配制:
[0064]已知胰岛素注射液规格为IOml含有400IU胰岛素，胰岛素28IU约等于Img胰岛素(5778g/mol)，则配制I X 10_7mol/L胰岛素高糖DMEM诱导液操作方法为:吸取40 μ I胰岛素注射液和Iml血清，加入高糖DMEM培养液100ml，充分混匀，于超净台中用0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，即得IOOmL胰岛素浓度为I X 10_7mol/L、血清浓度为1%的胰岛素高糖DMEM诱导液。
[0065]含1%血清的高糖培养基的配制:
[0066]取Iml胎牛血清，加高糖培养基至100ml。用于正常组实验。
[0067]含10_9mol/L的胰岛素和1%血清的低糖培养基的配制:
[0068]取7.5μ I的胰岛素注射液于一玻璃瓶中，加19.5mL的低糖培养基，混匀，得胰岛素浓度为10_7mol/L的母液；取该溶液ImL至IOOmL容量瓶中，加ImL血清，再用低糖培养基定容至IOOmL,超净台中过0.22 μ m滤膜除菌，即得所需胰岛素浓度为10_9mol/L的诱导溶液 IOOmL。[0069]3.实验方法
[0070]将IfepG2细胞按8X IO4浓度接种于96孔板上，每孔200 μ L，造模组使用浓度为10_6mol/L胰岛素诱导液诱导24h后，更换胰岛素浓度为10_9mol/L培养液继续孵育12h，测定各组细胞的葡萄糖消耗量。
[0071]3.1 H印G2细胞培养及接板
[0072]HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，每瓶加入约12mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37°C含有5%C02的培养箱中培养，约每3天一次0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA溶液消化传代，在细胞状态较好时胰酶消化后接板。
[0073]3.2组方样品液16 (2.5mg生药/ml)配制:
[0074]组方16药物的提取:称取白芍30g，知母10g，苦参10g，化橘红IOg置于圆底烧瓶中，加药材总重10倍量的浓度为60%的乙醇溶液，浸泡Ih后，加热回流提取lh，16层纱布过滤，得滤液。同法提取3次，合并3次滤液，70°C减压回收至无醇味，70°C水浴锅上蒸至近干后60°C减压干燥，得该组方的干膏粉末24.114g，得率40.19%。
[0075]组方待测样品液16 (2.5mg生药/ml)配制:称取组方样品0.0020g于2mlEP管中，加2ml低糖DMEM培养液涡旋溶解，于超净台中过0.22 μ m滤膜除菌，得浓度为2.5mg生药/ml的母液。
[0076]组方样品液1-15 (2.5mg生药/ml)配制:分别按试验例I项下的规定比例，取组方1-15组各组药材，然后按“组方16样品液(2.5mg生药/ml)配制”方法，配制组方1_15组样品液(2.5mg生药/ml)。
[0077]组方样品液17 (2.5`mg生药/ml)配制:
[0078]组方17药物的提取:按组方16的药材3:1:1:1的比例，称取白芍30g，知母10g，苦参10g，化橘红10g，置于圆底烧瓶中，加药材总重10倍量水，浸泡Ih后，水浴提取lh，16层纱布过滤，得滤液。同法提取3次，合并3次滤液，80°C水浴锅上蒸至近干后60°C减压干燥，得该组方样品的干膏粉末31.2g,得率52%。
[0079]组方样品液17 (2.5mg生药/ml)配制:称取组方样品0.0026g于2mlEP管中，加2ml低糖DMEM培养液涡旋溶解，0.22 μ m滤膜除菌，得浓度为2.5mg生药/ml的母液。
[0080]3.3 HepG2细胞分组、造模及给药
[0081]!fepG2细胞生长至80~90%融合时，倒掉培养基，用PBS清洗2遍；将细胞以0.25%的胰蛋白酶消化约40s，倒出胰酶，加入含10%血清的培养基终止消化，倒掉培养基，加入新的含10%胎牛血清的培养基，轻轻吹打细胞至均匀，将细胞稀释至8 X IO4个/mL，接种于96孔板中，每孔接种200 μ L，周围每孔加入200 μ LD-HanV s溶液。将96孔板置于5% CO2,37°C恒温培养箱中培养，待细胞生长至80-90%融合时，吸出培养液，分组如下，每组6个复孔，各孔加入如下培养基、诱导液及药液后继续培养:空白组:200 μ L高糖DMEM ;模型组:180 μ L高糖DMEM和20 μ Ll(T5mol/L胰岛素诱导液；样品组:160 μ L高糖DMEM，20 μ L诱导液和 20 μ L400 μ g/mL 阿卡波糖、20 μ L400 μ g/ml 二甲双胍、20 μ L0.025mg/ml 格列本脲、20 μ L436 μ g/mL羟苯磺酸钙、20 μ L2.5mg/ml和血明目片及各20 μ L组方样品液1_17。
[0082]3.4细胞培养液中葡萄糖含量测定
[0083]诱导培养16_20h后，将含药培养液取出，每孔加入新鲜的含10_9mol/L胰岛素并含1%FBS的低糖培养基200 μ L，培养12h后从各孔吸取20 μ I培养液于1.5mLEP管中，加入1000 μ L的葡萄糖浓度测定工作液，充分混匀，置于37°C水浴15min。显色后，在波长492nm处，测定各样品的吸光值，计算培养前后培养基中葡萄糖的含量差值即为各组葡萄糖消耗量。实验结果如表1所示。
[0084]表1.不同药物及组方样品液1-17组对H印G2细胞胰岛素敏感性的影响(X 土 SD, n=6)
[0085]
【权利要求】
1.一种治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成: 白芍1-5份、知母1-5份、苦参1-5份、化橘红1-5份。
2.根据权利要求1所述的治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成: 白芍1-3份、知母1-3份、苦参1-3份、化橘红1-3份。
3.根据权利要求1所述的治疗和预防糖尿病及其肾并发症的药物组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成: 白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份； 白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红1份； 白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红1份； 白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红2份； 白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红2份； 白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红2份； 白芍1份、知母2 份、苦参3份、化橘红3份； 白芍2份、知母3份、苦参1份、化橘红3份； 白芍3份、知母1份、苦参2份、化橘红3份； 白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红1份； 白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红2份； 白芍1份、知母1份、苦参1份、化橘红3份； 白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红1份； 白芍2份、知母2份、苦参2份、化橘红3份； 白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红2份； 白芍3份、知母3份、苦参3份、化橘红1份。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的组分制成:白芍1份、知母2份、苦参3份、化橘红1份。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的药物组合物，其特征在于所述的组合物与药学上可接受的载体制成制剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂为口服液、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂或注射剂。
7.—种权利要求1、2、3或4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤:称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量浓度为10%-90%的乙醇加热回流提取1-3次，每次提取1-3小时，过滤，合并滤液，浓缩。
8.—种权利要求1、2、3或4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤:称取白芍，知母，苦参和化橘红，加药材总重8-12倍量水，加热提取1-3次，每次提取0.5-1小时，过滤，合并滤液，浓缩。
9.权利要求1、2、3或4所述的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病及其肾并发症的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的糖尿病引起的肾并发症为肾损伤。
【文档编号】A61K36/8964GK103599339SQ201310409021
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】杨中林 申请人:杨中林