一种微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法
【专利摘要】本发明涉及一种微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，包括以下步骤：1）配制双水相体系：取无机盐，加入水溶解，加入有机溶剂，即分相成为双水相提取剂；2）微波辅助双水相提取：向步骤1）所得双水相提取剂中加入葛根粉，采用微波辅助提取，抽滤得明显分相的葛根黄酮提取液。与已有技术相比，本发明所提供的双水相萃取葛根黄酮的方法的优点在于：1）操作简单，无需等待分相；2）过程集成；3）提取过程迅速，高效；4）提取溶剂低毒；5）界面张力小，有助于两相之间的质量传递；6）大量杂质可与固体物质一同除去，有利于纯化样品；7）该提取方法放大效应不明显，易于工艺放大和连续操作，与后续纯化工序可直接相连，无需特殊处理。
【专利说明】一种微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然产物有效成分的提取分离纯化领域，具体涉及一种微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法。
【背景技术】
[0002]葛根为豆科植物野葛的干燥根，是常用的中药材，历代以来本草均有记载，味甘、辛、性平，可解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒。目前，葛根广泛用于改善心脑血管疾病，在治疗腹泻、糖尿病等重要复方制剂中，用量极大，是制剂的重要成分。《中华人民共和国药典》和《卫生部药品标准》中收录大约有140余种葛根复方制剂，其中主要有葛根片剂、针剂等。葛根主要有效成分为葛根总黄酮，尤其野葛含葛根总黄酮较多，主要作为葛根制剂、药品、保健品等的原料。医药方面，葛根黄酮目前主要用于治疗心脑血管类疾病，如高血压、高血脂、偏头痛、冠心病、心肌梗塞等症，替代中成药中的中药葛根。同时因其毒性较低及显著独特的生物活性，葛根黄酮被作为天然添加剂，广泛用于保健食品(解酒、延缓女性更年期、糖尿病引起的并发症等)或食品、化妆品行业(如食用色素、甜味剂、抗氧化剂等)等领域。
[0003]葛根中含有的黄酮类化合物多以糖苷的形式存在，一般提取时多采用水、甲醇、乙醇溶液做提取溶剂，用正丁醇做萃取剂。但是选用的提取剂往往毒性较大，提取时间也较长，耗时耗能。
[0004]微波辅助技术是利用微波场的体积加热和选择性加热的功能，加速提取过程的进行。选用对微波透明或半透明的并且对目标成分有较强溶解能力的介质做溶剂，在微波场中，对微波不透明的材料内部分子在微波作用下相互碰撞、挤压，有利于目标成分的快速浸出。微波法具有高选择性和高效性，大大缩短了反应时间的同时，又可以提高反应收率。
[0005]双水相萃取技术(Aqueous two-phase extraction, ATPS)又称水溶液两相分配技术，是近几十年来研究并发展起来的一项极具发展前景的新型萃取分离技术。双水相萃取技术但由于其条件温和，质量传输快，成本低，易操作，可调节，容易放大，可连续操作等特点，与传统的有机溶剂萃取体系相比较，在生物物质的分离中有独到的优越之处。传统的高聚物/高聚物或高聚物/无机盐双水相体系，已经成功用于分离和提取各种蛋白质(多肽和酶)，分离和提取各种抗生素、氨基酸、金属和中药的有效成份等领域。
[0006]高聚物形成的双水相体系，虽然萃取效率高，但所用的聚乙二醇(简称PEG)和葡聚糖(简称Dextran)成本太高，而且体系黏度大，回收难，因而成本高,不适于工业大规模生产。而低级醇(如乙醇)与盐的水溶液形成的双水相体系毒性低，对有机溶剂的回收操作简便，可反复利用，成本低。其原理是利用盐离子的水化作用，与乙醇共同竞争水分子从而形成乙醇水溶液和盐的水溶液两相。当生物物质或天然产物中的有效成分进入双水相体系时，由于表面性质、电荷作用和各种力(憎水键、氢键和离子键)的存在和环境因素(浓度、温度、PH值以及离子的 种类和强度等)的影响，生物物质或天然产物中的有效成分易在两相间形成选择性的分配。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提供一种微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，不但避免了有毒萃取溶剂的使用，提高了葛根中总黄酮的提取率，且使提取和分离步骤一步完成，极大简化了操作步骤。
[0008]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0009]I)配制双水相体系:取无机盐，加入水溶解，加入有机溶剂，即分相成为双水相提取剂；
[0010]2)微波辅助双水相提取:向步骤I)所得双水相提取剂中加入葛根粉，采用微波辅助提取，抽滤得明显分相的葛根黄酮提取液。
[0011]按上述方案，所述的无机盐为三水磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，碳酸钾或硫酸铵。
[0012]按上述方案，所述的有机溶剂为无水乙醇，所述的无水乙醇用量为双水相提取剂总质量的35%-55%。
[0013]按上述方案，所 述的无机盐的用量为双水相提取剂总质量的20%_40%。
[0014]按上述方案，所述的葛根粉与双水相提取剂固液比为1: 5-1: 30，单位是g: ml。
[0015]按上述方案，所述的微波辅助提取的提取温度为40°C -90°C，提取时间为5-20分钟，微波功率为400-700W。
[0016]按上述方案，所述的双水相提取剂的pH为7-11。
[0017]本发明在提取过程中即使用双水相体系作溶剂，在操作温度下，两相亦分相明显，葛根粉恰好悬浮于两相之间，易溶于乙醇相的黄酮提取出后进入上相，易溶于水相的多糖溶于下相。这样，提取和分离过程同时进行。葛根黄酮显著富集于上相，下相中几乎没有，通过改变加入的盐的质量分数改变上、下相的体积，减小上相体积，达到富集浓缩的目的，葛根黄酮由于其结构特点，易溶于弱碱性溶液，磷酸氢二钾与乙醇形成的双水相提取剂为弱碱性，PH范围在7-11，有利于葛根黄酮的溶出。实验证实，从收率和葛根黄酮在上下相的分配情况来看，磷酸氢二钾的效果都无疑是最好的，若用硫酸铵，易受温度限制，室温较低时，不易形成双水相，若用碳酸钾，葛根黄酮在上下两相都有分布，且差别不大，而本实验的目的是希望葛根黄酮富集于上相。
[0018]与已有技术相比，本发明所提供的双水相萃取葛根黄酮的方法的优点在于:
[0019]I)操作简单，无需等待分相
[0020]在实验中观察到，将盐、水、乙醇依次加入后，加入葛粉即可进入提取步骤，不用等待分相明显，收率不变。
[0021]2)过程集成
[0022]微波辅助双水相提取法将提取、萃取分离和富集步骤集成为一步提取过程，操作简单方便，提取过程中即完成了萃取了富集，将葛根黄酮与葛根多糖及其他易溶于水相的组分分离开，且葛根黄酮富集于上相，浓缩倍数可达4倍以上。
[0023]3)提取过程迅速，高效
[0024]借助微波辐射作用，将原本需要若干小时的提取过程缩短至15分钟以内，葛根黄酮的收率高。
[0025]4)提取溶剂低毒
[0026]采用乙醇/无机盐双水相作提取剂，避免了有毒溶剂如正丁醇的使用，原料环保。
[0027]5)界面张力小，有助于两相之间的质量传递
[0028]所述双水相体系，上相为有机溶液乙醇，下相为盐的溶液，上下相之间表面张力小，自由能小，有助于两相之间物质的传递。
[0029]6)大量杂质可与固体物质一同除去，有利于纯化样品
[0030]提取结束后，固体药渣悬浮于两相之间或下相，大量杂质可随药渣进入下相，与葛根黄酮分离开。
[0031]7)该提取方法放大效应不明显，易于工艺放大和连续操作，与后续纯化工序可直接相连，无需进行特殊处理。
【具体实施方式】
[0032]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0033]实施例1:
[0034](I)配制双水相体系
[0035]取12gK2HP04.3H20,加入22mL水溶解，加入18mL乙醇，配制为双水相提取剂；
[0036](2)微波辅助双水相提取
[0037]步骤(I)中所得双水相体系，加入精密称定的过60目筛的葛根粉0.2g,设定微波条件为60°C、10min、500W，进行微波辅助双水相提取，提取结束后，抽滤得明显分相的葛根
黄酮提取液。
[0038](3)利用紫外分光光度法测定双水相萃取体系中葛根总黄酮的浓度，按公式(3)计算回收率:
[0039]R=Vi/Vt (I)
[0040]K = C上/C下 (2)
[0041]Y= C上 XV上/MX 100% (3)
[0042]式中:R为相比；V±和VtS上下相的体积(ml) ;C±，C〒分别是上、下相中目标分离物的质量浓度(mg/mL) ;K为分配系数；Μ为加入的葛根粉的质量。
[0043]总黄酮的含量测定采用分光光度法。具体步骤如下:称取一定量的葛根总黄酮提取物，精密称定，以空白溶液做参比，在248nm处测定吸光度，代入标准曲线计算葛根总黄酮的含量。
[0044]葛根黄酮的收率为12.10% ο
[0045]实施例2:
[0046](I)配制双水相体系
[0047]取16gK2HP04.3H20,加入22mL水溶解，加入18mL乙醇，配制为双水相提取剂；
[0048](2)微波辅助双水相提取
[0049]步骤(I)中所得双水相体系，加入精密称定的过60目筛的葛根粉0.2g,设定微波条件为60°C、10min、600W，进行微波辅助双水相提取，提取结束后，抽滤得明显分相的葛根黄酮提取液。葛根黄酮的收率为12. 92%。[0050]实施例3:
[0051](I)配制双水相体系
[0052]取16gK2HP04.3H20,加入22mL水溶解，加入18mL乙醇，配制为双水相提取剂；
[0053](2)微波辅助双水相提取
[0054]步骤(I)中所得双水相体系，加入精密称定的过60目筛的葛根粉lg，设定微波条件为60°C、10min、600W，进行微波辅助双水相提取，提取结束后，抽滤得明显分相的葛根黄酮提取液。葛根黄酮的收率为12.72%。
[0055]实施例4:
[0056]( I)配制双水相体系
[0057]取16gK2HP04.3H20,加入22mL水溶解，加入18mL乙醇，配制为双水相提取剂；
[0058](2)微波辅助双水相提取
[0059]步骤(I)中所得双水相体系，加入精密称定的过60目筛的葛根粉2g，设定微波条件为60°C、10min、700W，进行微波辅助双水相提取，提取结束后，抽滤得明显分相的葛根黄酮提取液。葛根黄酮的收率为11.48%。
[0060]实施例5:
[0061](I)配制双水相体系
.[0062]取HgK2CO3,加入22mL水溶解，加入18mL乙醇，配制为双水相提取剂；
[0063](2)微波辅助双水相提取
[0064]步骤(I)中所得双水相体系，加入精密称定的过60目筛的葛根粉1.5g，设定微波条件为60°C、10min、700W，进行微波辅助双水相提取，提取结束后，抽滤得明显分相的葛根黄酮提取液。葛根黄酮的收率为10.23%。
【权利要求】
1.一种微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)配制双水相体系:取无机盐，加入水溶解，加入有机溶剂，即分相成为双水相提取剂； 2)微波辅助双水相提取:向步骤I)所得双水相提取剂中加入葛根粉，采用微波辅助提取，抽滤得明显分相的葛根黄酮提取液。
2.根据权利要求1所述的微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于:所述的无机盐为三水磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，碳酸钾或硫酸铵。
3.根据权利要求1所述的微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于所述的有机溶剂为无水乙醇，所述的无水乙醇用量为双水相提取剂总质量的35%-55%。
4.根据权利要求1所述的微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于所述的无机盐的用量为双水相提取剂总质量的20%-40%。
5.根据权利要求1所述的微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于所述的葛根粉与双水相提取剂固液比为1: 5-1: 30，单位是g: ml。
6.根据权利要求1所述的微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于所述的微波辅助提取的 提取温度为40°C -90°C，提取时间为5-20分钟，微波功率为400-700W。
7.根据权利要求1所述的微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于所述的双水相提取剂的PH为7-11。
8.根据权利要求1所述的微波辅助双水相提取分离葛根总黄酮的方法，其特征在于所述的无机盐的用量为双水相提取剂总质量的27%-34%。
【文档编号】A61K36/488GK103432193SQ201310408920
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】池汝安, 张越非, 刘哲, 李娅丽, 余军霞 申请人:武汉工程大学