专利名称：松花粉超临界萃取物中总黄酮含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种松花粉超临界萃取物中总黄酮含量的测定方法。
背景技术：
松花粉(PollenPini)是松科植物马尾松(Pinus massonina lamb)、油松(Pinus tabulaefermiscarr)等植物于春季花刚开时将雄球采摘，晒干，搓下花粉，收集，除去杂质所得的淡黄色细花粉[参见ChP (中国药典).2010. Vol 1(—部)191]。松花粉是天然的微型营养库。作为优良的保健食品，松花粉的营养成分可以分为糖、蛋白质、脂肪、维生素、 微量元素和生物活性物质六大类。其所含的多种酶、激素、黄酮以及丰富的磷脂等生物活性物质对人体的生命活动有重要的调节作用，具有抗衰老、抗疲劳、调节血脂、降血糖、护肝、 美容、减肥等多种药理作用，是花粉产品中的佼佼者。松花粉活性成分复杂，虽被《中国药典》收载，规定了制法、显微鉴别和检查项目， 但未对其活性有效成分的含量做出质控标准。目前的文献表明松花粉中的黄酮类化合物多以甙的形式存在，具有多方面的生理活性。可有效清除体内的氧自由基，其阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，可阻止细胞的退化、衰老。所富含的磷脂更是具有显著的降血脂等多种药理活性。近20年来生物医学研究表明磷脂具有调节生理机能、增强免疫力、防治心、脑、血管等疾病的作用。但磷脂遇热不稳定，给传统的溶剂提取带来困难。超临界流体萃取(supercritical fluid extraction, SFE)是近代分离领域出现的高新技术，除减少有机溶剂用量外，还有萃取效率和选择性高、适用于热不稳定物质的提取、环境污染小、操作条件易于改变等特点，是一种较为理想的中药活性物质提取方法。 对松花粉进行超临界(X)2萃取，可以避免有机溶剂的残留，提高产率，同时在提取过程中不易破坏松花粉中的有效活性物质，大大提高活性成分的萃取量。[参见邵兴军，丁德华， 郦宏岩等.超临界CO2萃取松花粉中有效成分的方法.[P]中国专利200810155138. 3， 2009-03-18;冯武，范国栋，刘嘉宝.云南松花粉超临界CO2脱脂研究.[J]云南林业科技· 2003，(1) :63ο ]松花粉超临界萃取物作为具有广阔市场前景的中药提取物，制定其质量评价标准对其在中药产业的发展有非常重要的意义，特别是针对其中多个典型活性成分建立有效的分析方法从而从总体上把握萃取物的质量情况尤为重要。目前，国内外尚未见针对松花粉超临界萃取物进行黄酮类成分的含量测定文献及专利。本发明首次针对超临界流体萃取松花粉中的总黄酮建立了简便可行的分析方法，为制定松花粉超临界萃取物的质量标准提供了一个可靠的依据，同时也为进一步合理开发和综合利用该萃取物提供了质量评价手段。
发明内容
本发明的目的在于设计提供一种针对超临界流体萃取松花粉中总黄酮成分建立含量测定方法的技术方案。对萃取物中的总黄酮运用紫外可见分光光度法进行测定，简便可行，准确度、精密度良好，能通过活性成分的含量测定把握萃取物的质量情况，可作为松花粉超临界萃取物的质量评价依据。本发明的技术方案如下一种松花粉超临界萃取物(SFE-PP)中总黄酮含量的测定方法，它包括如下步骤步骤1.标准储备液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇溶解并定容至 100ml，配成150 μ g · ml-1的芦丁标准储备液；步骤2.供试样品溶液的制备1.精密称取松花粉超临界萃取物2. OOOOg，用滤纸包紧置于平底烧瓶中，加入 IOOml 70%乙醇溶液，浸润后在80°C水浴下回流2h，粗提液冷却后减压抽滤，用少量25% 乙醇洗涤烧瓶和滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去其中的乙醇，倒出烧瓶内溶液，抽滤，并用 30ml热水分3次洗涤烧瓶，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml三氯甲烷分3次萃取脱脂，收集水溶液，旋转蒸发至干后加70%乙醇溶解后用于下述的柱层析加样；2.取经预处理的聚酰胺树脂粉末湿法装柱，用水饱和，吸取上述脱脂后的样品沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一定时间，至待测液被充分吸附后，用70 %乙醇洗脱，收集洗脱液，上述洗脱液浓缩定容得供试样品溶液，用于测定总黄酮的含量；步骤3.测定方法精密量取上述供试样品溶液或芦丁标准溶液适量于IOml容量瓶中，加30%乙醇液至5ml，加质量百分浓度为5%亚硝酸钠溶液0. :3ml，振摇后放置5min， 加入质量百分浓度为10%硝酸铝溶液0. 3ml摇勻后放置6min，加1. Omol · L—1氢氧化钠溶液anl，用30%乙醇定容至刻度，摇勻，以相应的试剂为空白，在510nm处测定吸光度；步骤4.结果计算以芦丁标准溶液的测定数据制作标准曲线，以供试样品溶液的测定数据对照标准曲线计算出样品溶液中总黄酮的量。有益效果目前，针对松花粉及其提取物的药理作用和活性成分的研究已有多篇文献报道。 由于松花粉功效成分复杂，其质量评价散见于维生素、微量元素和部分单类活性物质的测定，评价内容的规范性和完整性尚有待完善。松花粉超临界萃取物作为具有广阔市场前景的中药提取物，针对其中典型活性成分制定其质量评价方案对其在中药产业的发展有非常重要的意义。目前，国内外尚未见针对松花粉超临界萃取物进行黄酮类成分的含量测定的文献及专利。本发明首次针对超临界流体萃取松花粉中总黄酮建立了简便可行的分析方案，准确度、精密度良好，为实现松花粉超临界萃取物的质量可控提供了方法依据。
图1为芦丁标准品(1)及松花粉超临界(X)2萃取物供试样品O)的紫外扫描图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。一、实验部分1.仪器与试药UV-2401PC型紫外分光光度计(日本岛津)；XT-102A型电子天平(瑞士 I^recisa)寸。松花粉超临界(X)2萃取物(SFE-PP，江苏江大源生态生物科技有限公司)；芦丁对照品(南京泽朗医药科技有限公司)；其余试剂分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。2.实验方法SFE-PP中总黄酮的含量测定2. 1标准储备液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇溶解并定容至100ml， 配成150 μ g · mr1的芦丁标准储备溶液。2. 2供试样品溶液的制备2. 2. 1精密称取松花粉超临界萃取物2. OOOOg，用滤纸包紧置于平底烧瓶中，加入 IOOml 70%乙醇溶液，浸润后在80°C水浴下回流池。粗提液冷却后减压抽滤，用少量25% 乙醇洗涤烧瓶和滤渣，合并滤液。减压蒸馏除去其中的乙醇。倒出烧瓶内溶液，抽滤，用30ml 热水分3次洗涤烧瓶，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml三氯甲烷分3次萃取脱脂， 待完全分层后，收集水溶液，旋转蒸发至干后加70%乙醇溶解后用于加样。2. 2. 2取经预处理的聚酰胺树脂粉末湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的样品沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一定时间，至待测液被充分吸附后，用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，上述洗脱液浓缩定容即得供试样品溶液，以用于测定总黄酮的含量。2. 3测定方法精密量取上述供试品溶液或芦丁标准溶液适量于IOml量瓶中， 加30%乙醇至5ml，加5%亚硝酸钠溶液0. :3ml，振摇后放置5min，加入10%硝酸铝溶液 0. 3ml，摇勻后放置6min，加1. Omol · L-1氢氧化钠溶液2ml，用30%乙醇定容至刻度，摇勻。 以相应的试剂为空白，在510nm处测定吸光度。2. 4结果计算以芦丁标准溶液的测定数据制作标准曲线，以供试样品溶液的测定数据对照标准曲线计算出样品溶液中总黄酮的量。二、结果与讨论1总黄酮含量测定实验条件的优化与验证1. 1测定波长的选择精密量取2. 1项下的芦丁标准溶液和2. 2项下的供试样品溶液适量于IOmL量瓶中，照2. 3测定方法加入试剂，以相应的试剂为空白，分别在200nm SOOnm范围内进行扫描，以确定最大吸收波长。发现芦丁标准品和SFE-PP样品在510nm处均有最大吸收(见图 1)，且峰形相似，因此选择510nm为测定波长。1.2标准曲线的绘制精密量取芦丁标准储备液0. 50ml、1.00ml、2. 00ml、3. 00ml、4. OOml 置 IOmL 量瓶中，照2. 3测定方法加入试剂，以相应的试剂为空白，在510nm处测定吸光度，对所得数据进行回归，求出回归方程为y = 0. 0099x+0. 0289 (r = 0. 9990，η = 5)，结果表明，在实验浓度范围内芦丁的吸光度与浓度呈良好的线性关系。1. 3精密度实验精密吸取芦丁标准储备溶液1. 00ml,2. 00ml,4. OOml于IOml量瓶中，得低、中、高三个浓度分别为15、30、60μ g · πιΓ1的标准溶液，按2. 3项显色。每个浓度平行测定5份， 以考察方法的日内精密度；以上三个浓度的标准溶液，每天测一次，连续5天，以考察方法的日间精密度。结果见表1。表1总黄酮精密度实验结果(n = 5)
权利要求
1. 一种松花粉超临界萃取物中总黄酮含量的测定方法，其特征是它包括如下步骤 步骤1.标准储备液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇溶解并定容至100 ml, 配成150 yg πιΓ1的芦丁标准储备液； 步骤2.供试样品溶液的制备精密称取松花粉超临界萃取物2.0 g，用滤纸包紧置于平底烧瓶中，加入100 ml 70%乙醇溶液，浸润后在80°C水浴下回流2 h，粗提液冷却后减压抽滤，用少量25%乙醇洗涤烧瓶和滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去其中的乙醇，倒出烧瓶内溶液，抽滤，并用30 ml热水分3 次洗涤烧瓶，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75 ml三氯甲烷分3次萃取脱脂，收集水溶液，旋转蒸发至干后加70%乙醇溶解后用于下述的柱层析加样；取经预处理的聚酰胺树脂粉末湿法装柱，用水饱和，吸取上述脱脂后的样品沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一定时间，至待测液被充分吸附后，用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，上述洗脱液浓缩定容得供试样品溶液，用于测定总黄酮的含量；步骤3.测定方法精密量取上述供试样品溶液或芦丁标准溶液适量于10 ml量瓶中， 加30%乙醇液至5 ml，加质量百分浓度为5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，振摇后放置5 min，加入质量百分浓度为10%硝酸铝溶液0. 3 ml摇勻后放置6 min,加1. 0 mol 厂1氢氧化钠溶液2 ml，用30%乙醇定容至刻度，摇勻，以相应的试剂为空白，在510 nm处测定吸光度；步骤4.结果计算以芦丁标准溶液的测定数据制作标准曲线，以供试样品溶液的测定数据对照标准曲线计算出样品溶液中总黄酮的量。
全文摘要
一种松花粉超临界萃取物中总黄酮含量的测定方法，它是以芦丁为标准，用70%乙醇提取松花粉超临界萃取物，以聚酰胺树脂层析柱分离出总黄酮，加5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液和1.0mol·L-1氢氧化钠溶液显色，以紫外光510nm处测定吸光度，测得总黄酮的含量。本发明针对超临界流体萃取松花粉中总黄酮建立了简便可行的分析方案，准确度、精密度良好，为实现松花粉超临界萃取物的质量可控提供了方法依据。
文档编号G01N1/40GK102426156SQ201110374429
公开日2012年4月25日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者余江南, 徐希明, 童姗姗, 邓倩 申请人:江苏大学