专利名称：一种总黄酮含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种用紫外可见分光光度法来测定物质含量的方法，具体是一种总黄酮含量测定方法，特别是一种测定青天葵或青天葵提取物或与青天葵总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法。
背景技术：
自然界很多植物含有黄酮类化合物。据估计，我国传统中草药有20%含有黄酮类化合物。黄酮一直是医药及食品工业的热点研究物质，因为黄酮类化合物具有多种生理作用，例如芦丁、槲皮素、槲皮苷能增强心脏收缩，减少心脏搏动次数；法尔杜鹃素、紫花杜鹃素等有止咳祛痰作用；牡荆素、汉黄芩素等具有抗肿瘤活性；水飞蓟素有保肝作用等。植物所含的黄酮一般不以单一成分存在，而以几种结构相似或相近的成分共同存在，其总量称为总黄酮含量。青天葵是广东、广西有名的中草药。其出口量较大，药材市场价格昂贵。在临床上的应用越来越多。目前的研究表明，黄酮类物质是青天葵中一类主要的植物化学成分。测定总黄酮含量的方法较多，但针对青天葵总黄酮含量的测定方法至今未见报道。因此，建立有专门针对性的测定青天葵总黄酮含量的方法对青天葵药材质量控制具有重要的参考意义。 此外，青天葵目前还未有法定的质量标准，因而难以有效的监督和规范市场。这一测定方法的建立也将对此有很大帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确、快捷测定青天葵或青天葵提取物或与青天葵总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是一种总黄酮含量测定方法，具体是测定青天葵或青天葵提取物或与青天葵总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法。该方法系紫外可见分光光度法，用芦丁对照品配制成梯度标准溶液，青天葵药材或提取物配制成待测液，采用AlCl3-HAc-NaAc显色体系，在405nm 波长下，测定梯度标准溶液吸光度，建立标准曲线，再测定待测液吸光度，从标准曲线查出待测液浓度，最后根据配制溶液时的稀释倍数计算出青天葵药材或提取物的总黄酮含量， 具体操作步骤如下1.青天葵药材粉碎，精密称定一定量药材，置于具塞锥形瓶中，加一定量石油醚， 超声，静置后过滤除去滤液，重复三次，挥干滤渣中的石油醚，加入70 %乙醇，称定重量，超声，放冷至室温，用70 %乙醇补足重量，摇勻，离心，即得样品溶液；2.将芦丁对照品在110°C下加热至恒重；3.精密称取芦丁对照品、，用甲醇溶解并定容，即得芦丁对照品溶液。精密量取一定量此溶液置于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，即得芦丁标准溶液；4.用吸量管分别精密吸取芦丁标准溶液，置于25mL容量瓶中，加0. Imol '!/1AlCl3溶液，加HAc-NaAc缓冲溶液(pH5. 5)，加70 %乙醇稀释到刻度，摇勻，即得一系列不同浓度的标准溶液。分别取上述溶液，以相应试剂为空白，在405nm波长处测定吸光度。以吸光度 (A)为纵坐标，溶液浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线；5.精密量取步骤(1)所得样品溶液1. OmL，按步骤(4)操作，测定吸光度值。计算样品总黄酮含量。上述采用AlCl3-HAc-NaAc显色体系，要求的酸碱度为pH = 5. 5。上述青天葵药材提取时，样品量与提取溶剂用量为1 75，提取时间为60min。本发明具有下列优点1.检测方法专属性、针对性强，结果准确可靠。本发明专门针对青天葵或与青天葵总黄酮相同的物质中总黄酮含量的测定。青天葵中所含有的黄酮类成分结构中普遍缺乏邻二酚羟基结构片段，采用传统检测中药材总黄酮含量的方法时，青天葵样品与芦丁对照品在200 SOOnm波长范围内没有重叠的最大吸收波长(见图1)。但青天葵及同属植物中所含黄酮类成分基本含有5位-0H，4位C = 0，在酸性环境下，容易与Al3+络合产生的络合物，并在400nm左右有最大吸收(见图2)，且这个反应具有专属性。因此，我们采用 AlCl3-HAc-NaAc为显色体系，并对该显色体系不同的pH条件进行了考察，从而确定了显色条件为 AlCl3-HAc-NaAc (pH5. 5)，检测波长为 405nm。2.精密度良好。精密量取样品溶液l.OmL，连续测量6次，测定吸光度值，结果表明，RSD1. 30%，说明该方法仪器精密度良好。3.稳定性良好。精密量取样品溶液，每隔20min测定一次吸光度，分别于0，20， 40，60，80，IOOmin测定其吸光度，总共测6次，结果表明，本方法在IOOmin内吸光度基本没有变化，RSD % = 1. 02 %，说明该方法稳定性良好。4.重复性好。平行称取同一批样品5份，每份约lg，精密称定。制备样品溶液，测定吸光度，计算样品中总黄酮含量，得出RSD%= 2. 88%，说明该方法重复性好。5.准确度高。取已知总黄酮含量的青天葵样品6份，每份约0.2g，精密称定。每份均加入一定量的芦丁对照品，制备样品溶液，测定各份样品的吸光度，计算样品总黄酮含量、计算回收率及RSD值。结果表明平均回收率为99.78%，RSD%= 1. 94%，说明该方法的准确度高。本发明可用于药材或提取物的质量控制。
图1为采用传统检测中药材总黄酮含量的方法检测青天葵总黄酮含量时的紫外扫描图。图中I青天葵样品，II芦丁对照品。图2为采用本发明方法检测青天葵总黄酮含量时的紫外扫描图。图中I青天葵样品，II芦丁对照品。
具体实施例方式紫外分光光度法测定中药材中总黄酮含量时，通常采用NaNO2-Al (NO3) 3_NaOH显色体系，这个方法针对具有邻二酚羟基结构片段的黄酮类成分具有很好的显色效果。该方法应用广泛，但不能准确测出青天葵或青天葵同属植物总黄酮含量，这是由于青天葵中所含有的黄酮类成分结构中普遍缺乏邻二酚羟基结构片段，采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH显色体系时，青天葵样品与芦丁对照品在200 SOOnm波长范围内没有重叠的最大吸收波长(见图 1)。但青天葵及同属植物中所含黄酮类成分基本含有5位-0H，4位C = 0，在酸性环境下， 容易与Al3+络合产生络合物，并在400nm左右有最大吸收(见图2)，且这个反应具有专属性。因此，我们采用AlCl3-HAc-NaAc为显色体系，并对该显色体系不同的pH条件进行了考察，从而确定了显色条件为AlCl3-HAc-NaAc (pH5. 5)，检测波长为405nm。下面结合实施例对本发明做进一步阐述。实例1青天葵药材总黄酮含量测定，具体操作步骤如下1.青天葵药材的水分测定参照《中国药典》(2010版)方法，用水分快速测定仪测定。粉碎药材，精密称取lg，置于具塞锥形瓶中，加50mL石油醚，超声30min，静置后过滤除去滤液，重复三次，挥干滤渣中的石油醚，精密加入70 %乙醇75mL，称定重量，超声60min， 放冷，用70%乙醇补足重量，摇勻，离心15min(转速为3000r · mirT1)，即得样品溶液。2.将芦丁对照品在110°C下加热至恒重。3.精密称取芦丁对照品35. OOmg,用甲醇溶解并定容至20mL，即得1. 75mg -πιΓ1的芦丁对照品溶液。精密量取1. 75mg .mr1的芦丁对照品溶液4mL置于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，即得0. 1400mg · mL—1的芦丁标准溶液。4.用吸量管分别精密吸取0. 1400mg -πιΓ1芦丁对照品溶液0. 0,1. 3,2. 5,3. 5,4. 5 和5. 5mL分别置于25mL容量瓶中，加0. Imol · ^1AlCl3溶液1. 5mL,加HAc-NaAc缓冲溶液(pH5. 5) lmL，W 70%乙醇稀释到刻度，摇勻，即得浓度分别为0. 0,7. 28、14、19. 6,25. 2、 30. 8yg· mL—1的对照品溶液。分别取上述溶液，以相应试剂为空白，使用上海凤凰光学72系列数显722型可见分光光度计(或具有相同功能的分光光度计)在405nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，溶液浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。5.精密量取步骤1所得样品溶液1. OmL，按步骤4操作，测定吸光度值。计算得青天葵药材总黄酮含量为1.8%。实例2青天葵提取物总黄酮含量测定，具体操作步骤如下1.精密称取提取物O.Olg，精密加入70%乙醇10mL，称定重量，超声60min，放冷， 用70%乙醇补足重量，摇勻，离心15min(转速为3000r · mirT1)，即得样品溶液。2.芦丁对照品的处理及芦丁对照品溶液的配制同实例1。3.精密量取步骤1所得样品溶液1. OmL,按实例1步骤4操作，测定吸光度值。计算得青天葵提取物总黄酮含量为86. 2%。
权利要求
1.一种总黄酮含量测定方法，其特征在于，是测定青天葵或青天葵提取物或与青天葵总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法，该方法系紫外可见分光光度法，用芦丁对照品配制成梯度标准溶液，青天葵药材或提取物配制成待测液，采用AlCl3-HAc-NaAc显色体系，在 405nm波长下，测定梯度标准溶液吸光度，建立标准曲线，再测定待测液吸光度，从标准曲线查出待测液浓度，最后根据配制溶液时的稀释倍数计算出青天葵药材或提取物的总黄酮含量，具体操作步骤如下1)青天葵药材粉碎，精密称定一定量药材，置于具塞锥形瓶中，加一定量石油醚，超声， 静置后过滤除去滤液，重复三次，挥干滤渣中的石油醚，加入70 %乙醇，称定重量，超声，放冷至室温，用70%乙醇补足重量，摇勻，离心，即得样品溶液；2)将芦丁对照品在110°C下加热至恒重；3)精密称取芦丁对照品、，用甲醇溶解并定容，即得芦丁对照品溶液。精密量取一定量此溶液置于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，即得芦丁标准溶液；4)用吸量管分别精密吸取芦丁标准溶液，置于25mL容量瓶中，加0.Imol · L-1AlCl3溶液，加HAc-NaAc缓冲溶液(pH5. 5)，加70%乙醇稀释到刻度，摇勻，即得一系列不同浓度的标准溶液；分别取上述溶液，以相应试剂为空白，在405nm波长处测定吸光度；以吸光度(A) 为纵坐标，溶液浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线；5)精密量取步骤⑴所得样品溶液1.OmL，按步骤(4)操作，测定吸光度值。计算样品总黄酮含量。
2.根据权利要求1所述的一种总黄酮含量测定方法，其特征在于所述采用 AlCl3-HAc-NaAc显色体系，要求的酸碱度为pH = 5. 5。
3.根据权利要求1所述的一种总黄酮含量测定方法，其特征在于所述青天葵药材提取时，样品量与提取溶剂用量为1 75，提取时间为60min。
全文摘要
本发明公开了一种总黄酮含量测定方法，具体是一种测定青天葵或青天葵提取物或与青天葵总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法。该方法系紫外可见分光光度法，用芦丁对照品配制成梯度标准溶液，青天葵药材或提取物配制成待测液，采用AlCl3-HAc-NaAc显色体系，在405nm波长下，测定梯度标准溶液吸光度，建立标准曲线。再测定待测液吸光度，从标准曲线查出待测液浓度，最后根据配制溶液时的稀释倍数计算出青天葵药材或提取物的总黄酮含量。与现有技术比较，本发明的优点是检测方法专属性、针对性强，结果准确可靠；精密度良好；稳定性良好；重复性好；准确度高。本发明可用于药材或提取物的质量控制。
文档编号G01N21/78GK102183517SQ201110054600
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者李福森, 苏志恒, 谢集照, 邱莉, 黄桂坤 申请人:广西医科大学