专利名称：一种有效提高苦荞麦总黄酮含量的组培方法
技术领域：
本发明涉及一种荞麦的组织培养方法，特别是涉及一种可有效提高荞麦总黄酮含量的组培方法。
背景技术：
荞麦是一种药食同源的植物，有苦荞和甜荞两种。由于苦荞麦其籽粒、根、莖、叶及花等多种器官中都含有大量黄酮类物质，因而被誉为“降血糖、降血压、降血脂”的三降食品。随着其营养价值和药用价值的不断发现，苦荞麦植物资源越来越受到人们的青睐。但由于苦荞麦植物具有自花授粉的特点，因而导致其在农业生产育种上存在人工杂交难以成功，这也是当前苦荞麦在育种方面难以获得高产优良品种的重要原因。组织培养可在一定程度上解决苦养麦在育种上所遇到的问题。目前已有以苦荞麦茎段、叶片、叶柄为外植体培养其愈伤组织的报道。 大量研究表明，在植物细胞的悬浮培养过程中，通过加入最终目的化合物的前体物，可以大大提高悬浮培养细胞的次生代谢物含量。目前还未见采用前体饲喂技术来显著提高苦荞麦组培物中总黄酮含量的报道。
发明内容
本发明的目的在于一种有效提高苦荞麦总黄酮含量的组培方法，该方法通过在荞麦细胞的液体培养中添加特定的前体物来有效提高荞麦培养物中的总黄酮含量。为达到上述目的，本发明采用的解决方案包括如下步骤(I)外植体的处理选取生长健康和无病虫害的苦荞茎段作为外植体，并进行消毒处理；(2)愈伤组织的诱导培养取消毒后的外植体，吸干表面的水分后切成O. 5cm
I.5cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA O. I 2. 0mgL+2，4_D I 6mgL+IAAO ImgL+鹿糖20 60 gL-1+琼脂5. O 7. O g .I71中进行培养,培养条件为pH值5. 5 6. 8、每天光照8 16小时、光照强度1000 2000 lx、培养温度18 28°C ；(3)愈伤组织的悬浮培养切取生长15 25天的愈伤组织，以10 50 g · Γ1的接种量接入到添加有前体饲喂物的液体培养基MS+6-BA1. O 2. OmgL^+NAAO. I O. 5mgL—1+鹿糖20 60 gL_1+Vc 100 300 mg L—1中进行悬浮培养,培养条件为pH值5. 5
6.5，培养温度18 24° C、每天光照8 12小时、光照强度600 1000 lx，摇床转速为120 140r/min，所述前体饲喂物为乙酸钠或酵母提取物，乙酸钠的加入量为I 10 mgL,酵母提取物的加入量为O. 5 5gL。将上述悬浮培养25天后的愈伤组织细胞从培养液中滤出，用干燥滤纸拭干材料表面水分后，称取重量，即为鲜重；生物量增殖倍数=(收获量鲜重一接种量鲜重)/接种量鲜重。将上述培养的荞麦愈伤组织细胞置于55°C的烘箱中烘干至恒重，并用分光光度法对荞麦组培物中黄酮含量进行检测，测定样品通过显色后在500nm处直接测定吸光度，并计算出组培物中黄酮的含量。上述步骤(I)中所述消毒处理是指将苦荞茎段用浓度为O. 1%的升汞消毒3 8分钟，再用无菌水清洗3 5次。上述步骤(I)中的苦荞茎段选用靠近苦荞麦植株顶芽端的幼嫩茎段。上述步骤(3)中的愈伤组织选择生长旺盛、质地较疏松且无褐变产生的愈伤组织。本发明是具有这样一个思路由于黄酮的生物合成包含乙酸丙二酸途径和莽草酸途径，而黄酮的A环是乙酸经乙酸丙二酸途径合成，因此，喂饲前体物乙酸钠是合成黄酮的直接前体，因而添加适宜浓度的乙酸钠，可以明显地提高荞麦悬浮培养细胞中次生代谢产物黄酮的合成。而饲喂的前体物酵母提取物，作为一种生物性诱导剂可通过活化苯丙烷 类途径中的一系列关键酶，如苯丙氨酸解氨酶(PAL )、肉桂酸4-羟化酶(CA4H)和香豆酸-CoA联结酶(4CL)等能促使黄酮类化合物的积累。因此本发明采用前体饲喂技术，通过在苦荞麦茎段细胞的悬浮培养液中，添加乙酸钠或酵母提取物等黄酮合成类物质的代谢中间产物可有效提高苦荞麦培养细胞中的总黄酮含量，为进一步大规模开展荞麦植物次生代谢产物的生产奠定了基础，也为进一步研究荞麦植物中黄酮次生代谢的分子调控提供了重要的技术支持。
具体实施例方式实施例I(I)外植体的处理选取生长健康和无病虫害的靠近苦荞植株顶芽端的第I 2个幼嫩茎段作为外植体，用浓度为O. 1%的升汞消毒4分钟，再用无菌水清洗4次；(2)愈伤组织的诱导培养取消毒后的外植体，吸干表面的水分后切成O. 6cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 1.0mgL+2,4-D 5mgL+IAA O. 5mgL+蔗糖35gL—1+琼脂6. O g -Γ1中进行培养，培养条件为ρΗ值6. O、每天光照12小时、光照强度1500lx、培养温度25°C，培养15天统计，愈伤组织的诱导率为100% ；(3)愈伤组织的悬浮培养切取生长20天的生长旺盛、质地较疏松且无褐变产生的愈伤组织，以30 g · Γ1的接种量接入到添加有乙酸钠的液体培养基MS+6-BA1. OmgL^+NAAO. 2 mgL4+蔗糖 ZSgl^+Vc 200 mg Γ1 中进行悬浮培养，培养条件为 pH值6. 0，培养温度22° C、每天光照10小时、光照强度800 lx，摇床转速为130r/min，所述乙酸钠的加入量为5 mg / L，即每升培养基中加入5mg乙酸钠；(4)培养物生物量增殖倍数的计算在进行悬浮培养25天后，将培养液中的愈伤组织细胞从培养液中滤出，用干燥滤纸拭干材料表面水分后，称取重量，并计算出荞麦细胞的生物量增殖倍数为2. 71，比未添加任何前体饲喂物的对照组生物量增殖倍数2. 03高出了 33. 50% ；(5)培养物中总黄酮含量的测定将培养的荞麦组织细胞置于55°C的烘箱中烘干至恒重，并用分光光度法在500 nm处测定吸光度，进一步计算出培养物中的总黄酮含量为5. 04%，比未添加任何前体饲喂物的对照组总黄酮含量3. 30%高出了 52. 73%。实施例2(I)外植体的处理选取生长健康和无病虫害的靠近苦荞植株顶芽端的I 2个苦荞茎段作为外植体，用浓度为O. 1%的升汞消毒6分钟，再用无菌水清洗3次；(2)愈伤组织的诱导培养取消毒后的外植体，吸干表面的水分后切成I. O cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA O. 5mgL+2,4-D 2mgL+蔗糖50 gL—1+琼脂6. Og · L—1中进行培养，培养条件为pH值5. 8、每天光照10小时、光照强度1200 lx、培养温度25 0C ；(3)愈伤组织的悬浮培养切取生长24天的愈伤组织，以40 g -Γ1的接种量接入到添加有乙酸纳的液体培养基MS+6-BA1. 5mgL kNAAO. 4 mgL k鹿糖30 gL ^Vc 150mg L1中进行悬浮培养，培养条件为pH值6. 0，培养温度22° C、每天光照10小时、光照强度800Ix,摇床转速为130r/min,所述乙酸钠的加入量为5 mg / L,即每升培养基中加入5mg乙酸钠；(4)培养物生物量增殖倍数的计算在进行悬浮培养25天后，将培养液中的愈伤组织细胞从培养液中滤出，用干燥滤纸拭干材料表面水分后，称取重量，并计算出荞麦细 胞的生物量增殖倍数为2. 51 ；(5)培养物中总黄酮含量的测定将培养的荞麦组织细胞置于55°C的烘箱中烘干至恒重，并用分光光度法在500 nm处测定吸光度，进一步计算出培养物中的总黄酮含量为
4.84%ο实施例3将实施例I步骤(3)中的乙酸钠的加入量改为10 mg / L，其它步骤同实施例1，在培养25天后测得荞麦细胞的生物量增殖倍数为2. 15，比未添加任何前体饲喂物的对照组生物量增殖倍数2. 03高出了 5. 91% ;而测定培养物中的总黄酮含量为5. 46%，比未添加任何前体饲喂物的对照组总黄酮含量3. 30%高出了 65. 45%。由此说明，在荞麦细胞的液体培养基中，当添加的乙酸钠前体饲喂物浓度提高到10 mg / L时，对荞麦细胞生物量增殖没有明显地增高，但对提高荞麦细胞中的总黄酮含量有却明显地促进作用。实施例4将实施例I步骤(3)中的前体饲喂物改为酵母提取物，加入量为2 g/L，其它步骤同实施例I。在培养25天后测得荞麦细胞的生物量增殖倍数为2. 65，比未添加任何前体饲喂物的对照组生物量增殖倍数2. 03高出了 30. 54% ;而测得的总黄酮含量为5. 26%,比未添加任何前体饲喂物的对照组总黄酮含量3. 30%高出了 59. 39%。实施例5将实施例3步骤(3)中的酵母提取物的加入量改为5 g/L的，其它步骤同实施例
3。在培养25天后测得荞麦细胞的生物量增殖倍数为2. 09，比未添加任何前体饲喂物的对照组生物量增殖倍数2. 03仅高出了 2. 96% ;而测得的总黄酮含量为4. 96%，比未添加任何前体饲喂物的对照组总黄酮含量3. 30%高出了 50. 30%,比较可看出本实施例的生物量增殖倍数和总黄酮含量均低于实施例3。
权利要求
1.一种有效提高苦荞麦总黄酮含量的组培方法，其特征在于包括如下步骤 (1)外植体的处理选取生长健康和无病虫害的苦荞茎段作为外植体，并进行消毒处理； (2)愈伤组织的诱导培养取消毒后的外植体，吸干表面的水分后切成0.5cm I. 5cm的长度，然后接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 0. I 2. 0mg*L+2,4-D I 6mg*L+IAA0 lmg*L+鹿糖20 60 g*!/1+琼脂5. 0 7. 0 g L4中进行培养，培养条件为pH值5.5 6. 8、每天光照8 16小时、光照强度1000 20001x、培养温度18 28°C ； (3)愈伤组织的悬浮培养切取生长15 25天的愈伤组织，以10 50g -r1的接种量接入到添加有前体饲喂物的液体培养基MS+6-BA1. 0 2. 0mg*L_1+NAA0. I 0. 5 mg*!/1+蔗糖20 60 g^U1+Nc 100 300 mg七1中进行悬浮培养，培养条件为pH值5. 5 6. 5， 培养温度18 24° C、每天光照8 12小时、光照强度600 1000 lx，摇床转速为120 140r/min，所述前体饲喂物为乙酸钠或酵母提取物，乙酸钠的加入量为I 10 mg / L，酵母提取物的加入量为0. 5 5g/L。
2.根据权利要求I所述的一种有效提高荞麦总黄酮含量的组培方法，其特征在于步骤(I)中所述消毒处理是指将苦荞茎段用浓度为0. 1%的升汞消毒3 8分钟，再用无菌水清洗3 5次。
3.根据权利要求I所述的一种有效提高荞麦总黄酮含量的组培方法，其特征在于步骤(I)中的苦荞茎段选用靠近苦荞麦植株顶芽端的幼嫩茎段。
4.根据权利要求I所述的一种有效提高荞麦总黄酮含量的组培方法，其特征在于步骤(3)中所述愈伤组织为生长旺盛、质地较疏松且无褐变产生的愈伤组织。
全文摘要
本发明公开了一种有效提高苦荞麦总黄酮含量的组培方法，该方法采用前体饲喂技术，通过在荞麦细胞悬浮培养中添加黄酮类物质的代谢中间产物乙酸钠或酵母提取物，不仅能显著提高荞麦培养细胞中的总黄酮含量，而且还对其组培物的生物量增殖产生明显的促进作用。本发明可为进一步大规模开展荞麦植物次生代谢产物的生产奠定基础，从而可更好的实现荞麦植物有效组份的快速生产，同时也可为进一步研究荞麦植物中黄酮次生代谢的分子调控提供重要的技术支持。
文档编号A01H4/00GK102960246SQ20121047320
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者王跃华, 赵钢, 宋超, 孙雁霞, 段有丽, 陈丽, 邬晓勇, 吴佳靓, 覃泽娇, 王朝君, 熊云翔 申请人:成都大学