专利名称：一种富含dha的华贵栉孔扇贝新品系的培育方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种贝类遗传育种研究中选择育种和遗传改良技术，具体地说，是一种富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系的培育方法及其应用。
背景技术：
二十二碳六烯酸(DHA)，俗称“脑黄金”，是人体必需的一种长链多价不饱和脂肪酸，是大脑细胞膜的重要构成成分，参与脑细胞的形成和发育，对神经细胞轴突的延伸和新突起的形成有重要作用，可维持神经细胞的正常生理活动，参与大脑思维和记忆形成过程。DHA还是视网膜光受体中最丰富的长链多价不饱和脂肪酸，是视网膜的重要构成成分，对促进视网膜组织的发育，促进视功能的发展，改善视敏锐性等具有重要作用。DHA同维生素、矿物质一样也是人体的必需营养物质，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%。因此，对胎婴儿智力和视力发育至关重要，同时也可有效地预防老年 痴呆、视力衰退等。近年研究表明，DHA还能够降低胆固醇、抑制血小板聚集，从而预防心血管疾病。此外，DHA还具有很强的抗氧化功能，能够提高机体免疫力、阻止肿瘤细胞的增生。然而，人体不能够自己合成DHA，必须从食物中获得。因此，如何提高食物中的DHA含量越来越引起人们的重视。华贵柿孔扇贝(Chlamys nobilis Reeve)以其贝壳具有橙色、橙紫色、紫色、褐色等多种绚丽的色彩而闻名，以营养丰富、味道鲜美、肉质细嫩而著称，其闭壳肌制成的干品俗称“干贝”，是著名的海产八珍之一。已有研究表明，通过人工选育能够培育出色泽美观、商品价格高的新品种。鉴于DHA对人类健康的重要作用和人类对其需求的日益增加，如果能够培育出既美观又富含DHA的贝类新品种，其产品价格将被成倍地提高。这样不仅解决了目前华贵栉孔扇贝养殖业遭遇的产品价格贱、产值低等问题，而且也可以进一步丰富我国海水养殖业的多品种需求。在贝类，利用人工选择改良生长、存活等性状一直都有大量的报道，但一直没有利用人工选择培育富含DHA的贝类新品种的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系的培育方法，该方法经过2代定向选育，培育的新品系性状稳定，色泽美观贝壳、闭壳肌、外套膜均为橙色，而且体内组织还富含DHA。本发明的富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系的培育方法包括选种、培育第一代(Fl代)家系和培育第二代(F2代)新品系，其特征在于，选种步骤为选择年龄为1-2龄、健康且性腺发育饱满，贝壳、闭壳肌和外套膜的颜色均为橙色的雌、雄种贝；培育F2代新品系的步骤为从Fl代家系中筛选贝壳、闭壳肌、外套膜的色泽纯度均达95%以上的橙色家系作为种贝，建立F2代家系和群体，培育出性状稳定、富含DHA的橙色F2代新品系。其中，培育Fl代家系的步骤包括单个个体催产、单配授精建立Fl代家系、Fl代幼虫培育、Fl代稚贝养成。具体地，该培育方法包括下列步骤(I)选种选择年龄为1-2龄、健康且性腺发育饱满，贝壳、闭壳肌和外套膜的颜色均为橙色的雌、雄种贝；(2)单个个体催产将(I)中雌、雄种贝阴干后，向所述雌、雄种贝的卵巢和精巢内注射5-羟色胺溶液，使雌、雄种贝产卵、排精，分别收集卵子和精子；(3)单配授精建立Fl代家系用单个个体少量的精子与单个个体全部的卵子进行单配授精，孵化受精卵至D形幼虫，收集幼虫，建立Fl代家系；(4) Fl代幼虫培育、Fl代稚贝养成； (5)培育F2代新品系对Fl代家系进行颜色纯度检查，从Fl代家系中筛选贝壳、闭壳肌、外套膜的色泽纯度均达95%以上的橙色家系作为种贝，按步骤(2) (4)通过家系内单配交配和随机交配建立F2代家系和群体，培育出性状稳定、富含DHA的橙色F2代新品系O上述培育方法中，步骤(2)为将(I)中雌、雄种贝阴干后，向所述雌、雄种贝的卵巢和精巢内注射5-羟色胺溶液，再立即将雌、雄种贝单个地放入盛有砂滤海水的不同容器中，该雌、雄种贝产卵、排精后分别收集卵子和精子。步骤(4)为Fl代幼虫培育、Fl代稚贝养成将(3)中收集的幼虫分别放入培育桶中进行培育，幼虫培育的初始密度为2-3个/ml，水温为23-28°C，盐度为28-33，每天全换水一次，连续充气；幼虫馆料第I周为球等鞭金藻(Isochrysis galbana), I周后为球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和青岛大扁藻(Platymonas subcordiformis. (wille)Hazen)(体积比为1:1);日投饵量随幼虫的生长而逐渐增加，第I天总投饵量为3000-4000个藻类细胞/ml/天，5天后逐渐增加到每天总投饵量50000-60000个藻类细胞/ml/天，投饵次数第I天为2次/天，5天后逐渐增加到6次/天；每天取样镜检幼虫的摄食和生长情况，每两天对幼虫培养密度进行定量，并通过调节培养水体以使每个培育桶中的幼虫密度基本一致，幼虫培育期间不加抗生素，当20% -30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2000-3000粒苗，当水体中的浮游幼虫全部附着变态后，继续在室内培养一周，然后将附有稚贝的棕绳放入聚乙烯网中，做好标记后，在天气晴朗的下午出池，挂到海上进行稚贝养成；稚贝放到海上养殖后，定期检查稚贝的生长和存活情况，及时分苗并更换养殖笼，随着稚贝的生长，养殖密度由初始的300-400个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密度为30-40个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目，由孔径I. 3cm的养殖笼更换为3cm的养殖笼。步骤(5)为培育F2代新品系对Fl代家系进行颜色纯度检查，在扇贝生长到3-4cm时，检查每个家系中贝壳颜色；在扇贝生长到5-6cm时，检查每个家系中闭壳肌颜色和外套膜颜色；WF1代家系中筛选贝壳、闭壳肌、外套膜的色泽纯度均达95%以上的橙色家系做为种贝，按步骤(2广(4)通过家系内单配交配和随机交配建立F2代家系和群体，培育出性状稳定、富含DHA的橙色F2代新品系。其中，步骤(2)中5-羟色胺溶液的浓度为0.02-lmM，注射量为O. 1-0. 5ml/枚种贝。
步骤(3)中孵化的水温为23_28°C，盐度为28-33。优选地，步骤(2)中5-羟色胺溶液的浓度为O. 06mM，注射量为O. 3ml/枚种贝。优选地，步骤(3)中孵化的水温为26°C，盐度为30。优选地，步骤(4)中幼虫培育的初始密度为3个/ml，水温为26°C，盐度为30。日投饵量第I天总投饵量为3500个藻类细胞/ml/天，5天后逐渐增加到总投饵量为55000个藻类细胞/ml/天。当30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2500粒苗。养殖密度由初始的350个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密度为35个/层。优选地，步骤(5)中对Fl代家系进行颜色纯度检查，在扇贝生长到3. 5cm时，检查每个家系中贝壳颜色；在扇贝生长到5. 5cm时，检查每个家系中闭壳肌颜色和外套膜颜色。 对培育出的富含DHA的橙色F2代新品系进行DHA含量测定测定的组织包括闭壳肌和外套膜。从橙色F2代新品系中各取15个雌性个体和雄性个体，活体解剖取其闭壳肌和外套膜，真空冷冻干燥并研磨粉碎，然后按Folch等的A simple method forthe isolationand purification of total lipids from animal tissues.J BiolChemj 1957，226，497—509 的方法提取总脂肪;再按 Morrison 等的 Preparation offattyacid methyl esters and dimethylacetals from lipids with boronfIuoride-methanoI.J Lipid Res, 1964，5，600-608的方法进行甲酯化，然后用气相色谱测定闭壳肌和外套膜中的DHA含量。同时从养殖群体中也各取15个其他壳色的雌性个体和雄性个体作为对照，活体解剖取其闭壳肌和外套膜，按上述程序测定闭壳肌和外套膜中的DHA含量。本发明的另一目的是提供上述培育方法在其他贝类新品种培育中的应用。华贵栉孔扇贝是我国南方沿海重要的海水养殖种类之一，其普通群体中绝大多数个体的贝壳是褐色的、闭壳肌和外套膜是白色的，其闭壳肌的DHA平均含量在
20.0%-22. 5%、外套膜的DHA平均含量在18. 0%_20. 0% ;但存在极少数(〈1%)个体不但贝壳为橙色，其闭壳肌、外套膜也均为橙色，这种橙色的闭壳肌、外套膜等组织中DHA的含量较高，其闭壳肌的DHA平均含量在22. 5%-24. 0%、外套膜的DHA平均含量在22. 0%-23. 0%。通过测定连续选育Fl和F2选育家系中的DHA含量，发现DHA能够稳定地遗传。本发明的培育方法培育出的华贵栉孔扇贝F2代新品系富含更高含量的DHA，并且也能够稳定遗传，可用其来直接繁育富含DHA的华贵栉孔扇贝。本发明的富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系的培育方法的优点如下I)本发明的培育方法通过2代选育就能够获得理想的目标性状，加速了新品系培育进程。2)本发明从感官色泽、营养角度培育养殖贝类新品系，开辟了贝类品种培育的新途径，为其他贝类新品种的培育起到了示范作用。3)本发明的培育方法培育的新品系性状稳定，色泽美观贝壳、闭壳肌、外套膜均为橙色，而且体内组织还富含DHA，F2代新品系闭壳肌和外套膜组织中的DHA含量分别提高了 10%以上和20%以上，更有利于人类的健康，具有显著的经济价值、保健价值和药用价值，提高了产品的附加值，市场销售价格成倍增长，增加了养殖企业和养殖户的收入，市场前景广阔。4)本发明的培育方法培育出的富含DHA的华贵栉孔扇贝F2代新品系能够稳定遗传，可用其来直接繁育富含DHA的华贵栉孔扇贝。5)通过本发明的培育方法可提高扇贝的质量和市场价格，有效地遏制养殖业产品价格贱、产值低等问题，为扇贝养殖业的发展提供一条新途径。、6)本发明的培育方法不需要通过转基因、药物处理等复杂技术，在短时间内即可培育出新品系，且对生物和环境安全没有影响。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。DHA含量检测测定的组织包括闭壳肌、外套膜两部分。从Fl代家系或F2代新品系或其他壳色的养殖群体中随机各取15个雌性个体和雄性个体，活体解剖取其闭壳肌和外套膜，真空冷冻干燥并研磨粉碎，然后按Folch等(1957)方法提取闭壳肌和外套膜中的 总脂肪；再按Morrison等(1964)的方法对脂肪进行甲酯化，然后用气相色谱测定闭壳肌和外套膜中的DHA含量。实施例I时间2008年4月-2010年4月，地点汕头大学南澳临海海洋生物试验站。种贝I龄，壳长58. 2mm、壳高62. 4臟、壳宽20. 2mm、活体重34. 8g。通过选种，单个个体催产、单配授精建立Fl代家系、Fl代幼虫培育、Fl代稚贝养成、培育F2代新品系，测定DHA含量得到富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系，其操作步骤为(I)选种2008年4月，挑选年龄为I龄，健康且性腺发育饱满，贝壳、闭壳肌和外套膜的颜色均为橙色的雌、雄种贝各24个，所有种贝来自于同一个养殖群体。(2)单个个体催产将(I)中雌、雄种贝阴干10分钟后，用微量注射器向每枚种贝的卵巢或精巢内注射O. 06mM的5-羟色胺溶液O. 3ml，再立即将雌、雄种贝单个地放入盛有砂滤海水的不同容器中，10分钟后产卵、排精，分别收集卵子和精子。(3)单配授精建立Fl代家系用单个个体少量的精子与单个个体全部的卵子进行单配授精，受精卵放在60L的塑料桶中孵化。孵化的水温为26°C，适宜盐度为30。受精后18 24h，D形幼虫孵出，收集幼虫后分别放入220L的培育桶中进行幼虫培育，共建立起9个Fl代家系。从Fl代家系中随机取15个雌性个体和雄性个体，活体解剖取其闭壳肌和外套膜，真空冷冻干燥并研磨粉碎，然后按Folch等(1957)方法提取闭壳肌和外套膜中的总脂肪；再按Morrison等(1964)的方法对脂肪进行甲酯化，然后用气相色谱测定闭壳肌和外套膜中的DHA含量。其中，闭壳肌的DHA含量为23. 05%±0. 36%，外套膜的DHA含量为22. 45%±0. 23%。(4) Fl代幼虫培育、Fl代稚贝养成将(3)中收集的幼虫分别放入培育桶中进行培育，幼虫培育的初始密度为3个/ml，水温为26°C，盐度为30，每天全换水一次，连续充气；幼虫馆料第I周为球等鞭金藻(Isochrysis galbana), I周后为球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和青岛大扁藻(Platymonas subcordiformis. (wille)Hazen)(体积比为 I I)；日投饵量随幼虫的生长而逐渐增加，第I天总投饵量为3500个藻类细胞/ml/天，5天后逐渐增加到每天总投饵量为55000个藻类细胞/ml/天，投饵次数第I天为2次/天，5天后逐渐增加到6次/天；每天取样镜检幼虫的摄食和生长情况，每两天对幼虫培养密度进行定量，并通过调节培养水体以使每个培育桶中的幼虫密度基本一致。幼虫培育期间不加抗生素，而是适时地添加8ppm大蒜浸出液用来预防水体中病原微生物的繁殖。当30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2500粒苗。当水体中的浮游幼虫全部附着变态后，继续在室内培养一周，然后将附有稚贝的棕绳放入60目的聚乙烯网中，做好标记后，在天气晴朗的下午出池并挂到海上进行稚贝养成。共培育Fl代稚贝55.8万粒。稚贝放到海上养殖后，进入Fl代稚贝养成阶段。定期检查稚贝的生长和存活情况，并及时分苗、更换养殖笼。随着稚贝的生长，养殖密度有初始的350个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密度为35个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目、由孔径
I.3cm的养殖笼更换为3cm的养殖笼。到2009年4月，共生产I龄Fl代成贝44. 6万枚。
(5)培育F2代新品系对Fl代家系进行颜色纯度检查，包括贝壳颜色、闭壳肌颜色和外套膜颜色。在扇贝生长到3. 5cm时，检查所有Fl代家系中贝壳颜色、橙色个体平均达94% ;在扇贝生长到5. 5cm时，检查闭壳肌的颜色和外套膜的颜色，闭壳肌是橙色的个体平均达90%，外套膜是橙色的个体平均达100%。2009年4月，从贝壳、闭壳肌、外套膜的色泽纯度均达95%以上的Fl代家系中筛选雌、雄种贝各25枚，壳长57. 6mm、壳高60. 6mm、壳宽20. 4臟、活体重33. 6g。按步骤(2广
(4)通过家系内单配交配和家系内随机交配共建立起8个F2家系和I个F2群体。到2010年4月，共生产出F2代橙色成贝176万枚。(6) DHA含量检测测定的组织包括闭壳肌、外套膜两部分。从F2代新品系中各取15个雌性个体和雄性个体，活体解剖取其闭壳肌和外套膜，真空冷冻干燥并研磨粉碎，然后按Folch等(1957)方法提取闭壳肌和外套膜中的总脂肪；再按Morrison等(1964)的方法对脂肪进行甲酯化，然后用气相色谱测定闭壳肌和外套膜中的DHA含量。同时，从养殖群体中也各取15个褐壳色的雌性个体和雄性个体作为对照，活体解剖取其闭壳肌和外套膜，按上述程序测定闭壳肌和外套膜中的DHA含量。F2代新品系闭壳肌和外套膜的DHA含量分别为23. 82%±0. 77%和22. 98%±0. 59%，对照组闭壳肌和外套膜的DHA含量分别为
21.36%土 I. 07%和18. 88%±0. 71%。F2代新品系闭壳肌和外套膜组织中的DHA含量分别被提高了 11. 52% 和 21. 72%。以上实施例说明，通过2代连续选育不仅能够使新品系的感官色泽(质量性状)得到纯化，而且通过测定连续选育世代的DHA含量，发现DHA含量(数量性状)也能够稳定遗传、并且能够通过选育得到提高；通过选种、单个个体催产和单配授精等技术能够快速地培育出富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系。本发明的培育方法培育出的富含DHA的华贵栉孔扇贝F2代新品系能够稳定遗传，可用其来直接繁育富含DHA的华贵栉孔扇贝。虽然，上文中已经用一般性说明具体实施方式
及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，如凡通过感官色泽(质量性状)与DHA含量(数量性状)培育贝类新品系的方法，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系的培育方法，该培育方法包括选种、培育Fl代家系和培育F2代新品系，其特征在于，选种步骤为选择年龄为1-2龄、健康且性腺发育饱满，贝壳、闭壳肌和外套膜的颜色均为橙色的雌、雄种贝； 培育F2代新品系的步骤为从Fl代家系中筛选贝壳、闭壳肌、外套膜的色泽纯度均达95%以上的橙色家系作为种贝，建立F2代家系和群体，培育出性状稳定、富含DHA的橙色F2代新品系。
2.根据权利要求I所述的培育方法，其特征在于，培育Fl代家系的步骤包括单个个体催产、单配授精建立Fl代家系、Fl代幼虫培育 、Fl代稚贝养成。
3.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，该培育方法包括下列步骤 (1)选种选择年龄为1-2龄、健康且性腺发育饱满，贝壳、闭壳肌和外套膜的颜色均为橙色的雌、雄种贝； (2)单个个体催产将(I)中雌、雄种贝阴干后，向所述雌、雄种贝的卵巢和精巢内注射5_羟色胺溶液，使雌、雄种贝产卵、排精，分别收集卵子和精子； (3)单配授精建立Fl代家系用单个个体少量的精子与单个个体全部的卵子进行单配授精，孵化受精卵至D形幼虫，收集幼虫，建立Fl代家系； (4)Fl代幼虫培育、Fl代稚贝养成； (5)培育F2代新品系对？1代家系进行颜色纯度检查，从Fl代家系中筛选贝壳、闭壳肌、外套膜的色泽纯度均达95%以上的橙色家系作为种贝，按步骤(2) (4)通过家系内单配交配和随机交配建立F2代家系和群体，培育出性状稳定、富含DHA的橙色F2代新品系。
4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，步骤(2)中5-羟色胺溶液的浓度为0.02-lmM，注射量为0. 1-0. 5ml/枚种贝。
5.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，步骤(3)中孵化的水温为23-28°C，盐度为28-33。
6.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，在步骤(4)中，Fl代幼虫培育的初始密度为2-3个/ml，水温为23-28°C，盐度为28-33，幼虫饵料第I周为球等鞭金藻，I周后为球等鞭金藻和青岛大扁藻(体积比为1:1);日投饵量随幼虫的生长而逐渐增加，第I天总投饵量为3000-4000个藻类细胞/ml/天，5天后逐渐增加到每天总投饵量50000-60000个藻类细胞/ml/天，投饵次数第I天为2次/天，5天后逐渐增加到6次/天；当20% -30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2000-3000粒苗； Fl代稚贝养成时养殖密度由初始的300-400个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密度为30-40个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目，由孔径I. 3cm的养殖笼更换为3cm的养殖笼。
7.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，步骤(2)中5-羟色胺溶液的浓度为0.06mM,注射量为0. 3ml/枚种贝。
8.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，步骤(3)中孵化的水温为26°C，盐度为30。
9.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，在步骤(4)中，幼虫培育的初始密度为3个/ml，水温为26°C，盐度为30，日投饵量第I天总投饵量为3500个藻类细胞/ml/天，5天后逐渐增加到每天总投饵量55000个藻类细胞/ml/天，当30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2500粒苗；养殖密度由初始的350个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密度为35个/层。
10.权利要求I至9中任一项所述的育种方法在其他贝类新品种培育中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系的培育方法及其应用。该培育方法包括选种、培育F1代家系和培育F2代新品系，经过2代定向选育，培育出富含DHA的华贵栉孔扇贝新品系。本发明还提供了所述育种方法在其他贝类新品种培育中的应用。本发明从感官色泽、营养角度培育养殖贝类新品系，培育的华贵栉孔扇贝新品系不仅色泽美观，贝壳、闭壳肌和外套膜均为橙色，而且体内组织富含DHA，具有显著的经济价值、保健价值和药用价值，市场前景广阔。
文档编号A01K61/00GK102960276SQ20121047268
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者郑怀平, 刘合露, 张涛, 张博 申请人:汕头大学