影响栉孔扇贝肌肉生长的主效snp标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体的说涉及影响扇贝肌肉生长的SNP 标记及其应用。
【背景技术】
[0002] f节孔扇贝（Chlamys farreri)属双壳纲（Bivalvia)珍珠贝目（Pterioida)扇贝 科（Pectinidae)，贝壳较大，成圆扇形。两壳略等，左壳稍凸而右壳较平。壳顶位于背缘，略 凸。两耳不等，前大后小，皆呈三角形；右壳前耳下方具有足丝孔和细栉齿。壳色有变化，多 呈浅褐、橙黄、紫褐等色，也有灰白和浅驼色的。两壳放射肋不同：左侧有粗肋10条左右，主 肋间还有小肋；右壳有20条粗肋，肋上皆有不规则的生长棘。贝壳内面颜色较浅，肌痕大而 圆，较明显。韧带褐色，位于三角穴的韧带槽中。外套薄，外套缘厚，具有许多发达的触手， 触手基部有许多外套眼。足丝极发达，细线状。
[0003] 七十年代以来，栉孔扇贝人工育苗成功，以及随后人工采苗技术的成熟与完善，栉 孔扇贝海水养殖己在我国山东、辽宁两省形成产业。但较为严重的是，近年来栉孔扇贝的海 水养殖业出现了病害流行、大规模死亡等严重问题。目前，对于栉孔扇贝大规模死亡的原 因尚不清楚，推测可能有以下原因导致：养殖密度过高，近海水域生态系统的不良变化如水 质变坏等，栉孔扇贝种质一定程度衰退等。为了增强栉孔扇贝的抗逆能力，提高其品质和质 量，保证栉孔扇贝养殖业的持续、健康和稳定发展，非常有必要研究和认识栉孔扇贝各自然 群体的遗传结构和遗传变异水平，为人们更有效地管理、利用和保护栉孔扇贝种质资源和 进行优良种质培育提供遗传学依据。
[0004] 栉孔扇贝在我国主要分布在辽宁省、山东省、江苏省等沿海地区，是具有重要经济 价值的海产资源。随着养殖规模的不断扩大，近年来，随着养殖的高密度、规模化、集约化和 工厂化生产的发展，病害不断爆发流行，造成大规模死亡，经济损失十分惨重。许多研究表 明遗传变异水平与生物的生长速度，抗病能力等生产性状密切相关，因此检测遗传变异水 平对于选择育种和人工增殖是很有意义的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记及其应用。
[0006] 本发明影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记位于栉孔扇贝MSTN基因如SEQ ID NO :1所示序列的7528bp处，此处碱基为G的扇贝个体的总重、闭壳肌重和软体重显著高于 此处为A的扇贝肌肉。
[0007] 本发明还提供用于检测上述影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记的引物，包括 正向引物 5 ' -CCAACCAAACGAGAAATCGG-3 ' 和反向引物 5 ' -ACGTATCCGTCAITTACCCC-3 '。
[0008] 本发明还提供上述影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记在鉴定肉质肥硕的扇 贝优势品种中的应用，其包括以下步骤：
[0009]一、提取扇贝闭壳肌组织基因组DNA ;
[0010] 二、以扇贝闭壳肌组织基因组DNA为模板，以引物F和R，PCR反应扩增 出扇贝MSTN基因片段；所述引物F为5' -CCAACCAAACGAGAAATCGG-3'，引物R为 5' -ACGTATCCGTCATTTACCCC-3'
[0011] 三、检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中7528bp处的碱基为G，则待测扇贝属 于肉质肥硕的扇贝优势品种。
[0012] 本发明的有益效果：
[0013] 1、本发明提供的分子遗传标记不受扇贝的年龄和雌雄等限制，可大大加快扇贝的 育种进程。
[0014] 2、本发明的检测方法准确。
【附图说明】
[0015] 图1为栉孔扇贝的基因组DNA1%琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0016] 图2为引物M-5聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0017] 图3为引物M-7聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0018] 图4为引物M-5扩增产物AA和BB基因型7528bp处突变的测序峰图；
[0019] 图5为引物M-7扩增产物CC和DD基因型9397bp处突变的测序峰图。
【具体实施方式】
[0020] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0021] 一：本实施方式影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记位于栉孔扇 贝MSTN基因如SEQIDNO: 1所示序列的7528bp处，此处碱基为G的扇贝个体的总重、闭壳 肌重和软体重显著高于此处为A的扇贝肌肉。
【具体实施方式】 [0022] 二：本实施方式用于检测影响栉孔扇贝肌肉生长的主 效SNP标记的引物，包括正向引物5' -CCAACCAAACGAGAAATCGG-3'和反向引物 5' -ACGTATCCGTCATTTACCCC-3'。
【具体实施方式】 [0023] 三：本实施方式影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记在鉴定肉质 肥硕的扇贝优势品种中的应用，其包括以下步骤：
[0024] 一、提取扇贝闭壳肌组织基因组DNA;
[0025] 二、以扇贝闭壳肌组织基因组DNA为模板，以引物F和R，PCR反应扩增 出扇贝MSTN基因片段；所述引物F为5' -CCAACCAAACGAGAAATCGG-3'，引物R为 5' -ACGTATCCGTCATTTACCCC-3'
[0026] 三、检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中7528bp处的碱基为G，则待测扇贝属 于肉质肥硕的扇贝优势品种。
[0027] 为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
[0028] 实验样本：103个栉孔扇贝（一龄），采自大连市旅顺养殖场。
[0029] 1、扇贝闭壳肌组织基因组DNA的提取
[0030] 取一块扇贝闭壳肌组织（约0.Ig)置入I. 5ml离心管内，用小剪刀将其剪碎，加入 500y1组织DNA提取液，再加入蛋白酶K至终浓度20yg/ml，55°C水浴消化2-3小时。苯 酸、苯酸：氯仿（1:1)和氯仿各抽提一次，每次12000r/min离心lOmin，最后将上清移到另 一个离心管中。加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，可见有絮状物析出为DNA。用体积分 数70 %的乙醇溶液洗涤两次，凉干后，加入TE缓冲溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度 20yg/ml，37 °C温育Ih，至4°C冰箱保存备用。将提取的基因组DNA经1 %琼脂糖凝胶电泳 检测，用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度。
[0031] 所述组织DNA提取液由lOOmmol/L EDTA (pH8. 0)、2 %十二烷基肌氨酸钠和 10mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)组成。
[0032] 2、引物序列与PCR扩增
[0033] (I)MSTN基因引物设计
[0034] 根据GenBank上栉孔扇贝MSTN(DQ_988329)基因的序列，在其DNA序列上共设计 了 7对引物。采用引物设计软件Primer5.0设计引物。引物设计的标准是：引物长度为 (20±2)bp，GC含量在50%~75%之间，Tm值为51°C，引物内不出现发夹结构。引物委托 上海生工公司合成。其引物序列、PCR产物大小及退火温度见表3-1。
[0035] 表3-1如MSTN基因引物DNA序列信息
[0036]
[0037] (2) PCR反应体系
[0038] 反应总体积为25 y L，具体如下：
[0039]
[0040] PCR反应程序：94°C预变性5min，94°C变性30s，51°C退火30s，72°C延伸30s，共28 个循环，再72°C延伸7min，4°C保存。得到的PCR产物在I. 5%琼脂糖凝胶下电泳。
[0041] (3)聚丙烯胶电泳
[0042] 10 %非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)的配制
[0043] 配制10 %非变性聚丙烯酰胺凝胶30ml，其成分如下：
[0044]
[0045] 制胶步骤：
[0046] ①玻璃板的清洗：用试管刷沾上洗涤剂把玻璃板擦洗干净后，用清水冲洗干净，晾 干备用。
[0047] ②凝胶的灌制：玻璃板清洗干净后，用胶条将两块板子底部封住，然后用夹子固定 好。将配制好的胶液沿着梳子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的空隙中，然后立即插入梳子。如 果出现气泡，可以轻轻敲玻璃板，使气泡溢出。一般聚合30min便可聚合完全。如