专利名称：一种具杀菌活性的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及栉孔扇贝肽聚糖IH别蛋白(Cf-PGRP)基因编码 区的体外重组表达技术，活性重组蛋白的分离纯化，以及重组蛋白对枯草芽孢杆菌、藤黄微 球菌、大肠杆菌的杀菌抑菌作用研究；还涉及到该重组蛋白作为一种新型抗菌药物及免疫增 强剂，饲料添加剂生产中的应用价值。
背景技术：
非己识别是固有免疫的起始歩骤，也是免疫学研究的根本问题。无脊椎动物缺少获得性 免疫，因此，固有免疫的非己识别对无脊椎动物具有至关重要的意义。同时，由于微生物种 类繁多，并经常发生变异，也增加了非己识别的复杂性。固有免疫非己识别的研究主要是从 Janeway和Medzhitov在1998年提出的病原体相关分子模式和模式识别受体这两个概念的 基础上发展起来的。
病原体相关分子模式(PAMPs)是一类或几类病原体所共有、对其生存绝对必要且宿主机 体没有的保守成分。它包括G'菌的脂多糖(LPS)、类脂A， G+菌的肽聚糖(PGN)、脂磷壁 酸(LTA)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM),分枝杆菌和疏密螺旋体的脂蛋白与脂肽，酵母菌 和支原体的某些成分等。
PAMP是固有免疫识别的理想靶标，而且数量并不多，因此宿主通过有限数量的胚系编 码基因就能够识别很多类的微生物。这类由胚系基因编码的，在机体内不断进化识别PAMP 的受体，即被称为模式识别受体(PRRs)。模式识别受体和病原体相关分子模式这两个概念的 提出及后续的研究实例，揭示了固有免疫识别分子的作用本质就是通过识别病原体所特有保 守性分子模式而区别对宿主机体有害或无害物质，并选择合适方式清除有害物质，因而具有 重要的免疫生物学意义。
肽聚糖识别蛋白家族(PGRPs)是重要的模式识别受体，从昆虫到人类均高度保守，根 据结构的差异，肽聚糖识别蛋白可以分为三个亚家族长型亚家族(L)、中间型亚家族(I) 和短型亚家族(S)。短型PGRP基因属于分泌型胞外蛋白，具有典型的信号肽，分子量在20kDa 左右，PGRP结构域紧接在信号肽之后，成熟蛋白只具有1个PGRP结构域。
第一个PGRP蛋白是在家蚕的血淋巴中发现的，它能与肽聚糖结合并能激活酚氧化酶级联 反应。在对哺乳动物和昆虫PGRP的研究发现，PGRP对肽聚糖有很强的亲和力，起着胞内或胞外识别分子的功能，它能激活Toll、 Imd、酚氧化酶的激活途径，从而引起黑化反应、抗菌 肽的活化及促进细胞吞噬等功能。
PGRP蛋白的杀菌机制有两种 一种是由于PGRP与肽聚糖不可逆的结合，从而干扰细菌 细胞壁的合成；另一种是一些PGRP具有酰胺酶活性，可以降解肽聚糖，从而破坏细胞壁使菌 体破裂，这种杀菌作用类似丁-青霉素。人的PGRP-S、 PGRP-Ia和PGRP-ip有抗菌作用，其他 哺乳动物PGRPs也被报道有杀菌或抑菌活性。DziarskiR等发现大鼠的PGRP-S具有抑制革兰氏 阳性菌生长的作用，PGRP-S基因敲除后的大鼠对革兰氏阳性歯的易感性增加。在人的PGRPs 4个成员中，人们只发现PGRP-L具有酰胺酶活性，人PGRP-LCys的一个突变体能够使PGRP-L 丧失酰胺酶活性。GeliusE等发现大鼠的PGRP-L也具有酰胺酶活性。SashchenkoLP等发现大 鼠PGRP-S与体液或淋巴细胞内的Hsp70能形成一个稳定的细胞毒素复合体，在极低的浓度下 就能导致机体死亡。KappelerSR等发现骆驼的PGRP识别乳酸菌，在链球菌感染时能够上调 其表达，但在乳腺发炎的情况下却不出现此现象，这似乎说明了在骆驼奶中这种蛋ft的主要 作用是抑制乳酸菌的生长。
本发明中的怖孔扇贝Cf-PGRP为短型肽聚糖识别蛋tl,其重组产物对革兰氏阳性菌具有 很强的抗菌功能。目前，肽聚糖识别蛋白的结构和功能在昆虫和哺乳动物中己得到一定程度 的研究，但在水产养殖动物中的研究还很少。PGRPs在水产养殖动物中的研究，有利于更好 的揭示固有免疫作用的途径及其工作机制，广谱抗菌药物和免疫增强剂的筛选提供指导。
发明内容
栉孔扇贝作为软体动物的代表，在进化上比较原始，研究其模式识别作用具有重要的意 义。本发明对栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白(Cf-PGRP)基因编码区进行原核重组，旨在确认其 蛋白功能，以深入研究Cf-PGRP受体蛋白的杀菌抑菌活性及其广谱性，为抗菌药物和免疫增 强剂的筛选提供指导。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是在Cf-PGRP基因编码区的两端分别设计含 有限制性酶切位点的引物，通过PCR技术，扩增编码区基因并将其克隆到pET-32a表达载体中， 随后转入宿主细胞BL21 (DE3) plysS中实现原核体外重组表达。重组产物经His-tog融合蛋白 纯化试剂盒纯化和透析复性后，表现出以下活性
1、生长抑制实验中，为了更好观察菌量生长变化，加菌量为10^iL对数生长期菌悬液。 实验中
1)低浓度的Cf-PGRP蛋白对革兰氏阳性菌的繁^^在抑制作用，高浓度则具有杀灭作 用。当培养基中含有50ng/mL的重组蛋白时，藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌的生长明显受到了抑制；当培养基中含有80ng/mL的重组蛋白时，藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌几乎无法生长， 菌液澄清，6小时抑菌率高达诉.58。/。和98.69%。
2)该Cf-PGRP蛋白对一些革兰氏阴性菌也有一定抗菌作用。当培养基中含有50ng/mL的 重组蛋白时，大肠杆菌的生长影响不大当培养基中含有80吗/mL的重组蛋白时，大肠杆菌 的生长受到明显抑制，6小时抑菌率为75.47%。
2、在另一个实验中，对数生长期菌稀释l X 104倍，测得重组蛋白对藤黄微球菌、枯草芽 孢杆菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为2ng/mL 、 2jig/mL、 4pg/mL。
图l:栉孔扇贝重组Cf-PGRP对藤黄菌生长的影响
图2:栉孔扇贝重组Cf-PGRP对枯草芽胞杆菌生长的影响
图3:栉孔扇贝重组Cf，PGRP对大肠杆菌生长的影响
具体实施例方式
下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。 实验例l:
本发明的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP基因编码区体外原核重组表达，包括下列步 骤
1、 重组载体的构建
本发明中釆用的重组载体为Novagen公司的pET原核表达系统。
通过PCR技术，使用5'末端分别添加了及z加H I和M>f I特定酶切位点的基因特异性引物 Pl(5'"GGATCCATTACAGCTGATTACCTGATAAC-3,)、 P2 (S'-GCGGCCGCTTAAGGGCATCCCGGAC-S" 扩增栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP的编码区片段。反应条件为:首先94C预变性5分钟, 然后进入下列循环94"变性30秒，60r退火30秒，72"延伸30秒，共进行30个循环， 最后72"延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD18-T simple载体连接，构建亚克隆。 转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用BomHI-iVirfI双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化i5^PJ 盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经同样双 酶切的表达载体pET-32a连接，完成载体的构建。上述实验操作的具体方法请参照《分子克 隆第三版》。
2、 重组蛋白的表达
本研究中使用的重组表达菌株为BL21(DE3)-plysS。使用构建好的重组载体转化表达宿主 菌，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200mlSOB培养基中 220rpm， 37"C培养至OD600=0.5-0.7。加入IPTG,使终浓度达到lmmol/mL,继续培养5h。4t:， 5000rpm,离心10min,收集菌体，于-20'C冻存备用。取lml菌液离心，弃去上清后， 加入80jiL水和20pL 5x蛋白上样缓冲液，100匸煮沸2分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达 产物。
3、重组蛋白的纯化与复性
本发明中重组蛋白的纯化采用TOYOBO公司MagExtractor His-Tag试剂盒。变性状态下 的具体操作步骤如下
在吸附液中加入尿素，使尿素浓度达到8M,并调节pH到8.0。菌体加入吸附液后，加 入5MNaCl，使终浓度达到3M;于冰浴中超声波破碎至菌液澄清，12000 rpm离心lmin，回 收上清。上清中加入磁珠，室温下剧烈震荡lCK30min,离心分离磁珠，弃去上清。加入洗净 液，使用震荡器搅拌10sec，稍离心分离磁珠。加入溶出液，室温下剧烈震荡1 10min,瞬间 高速分离，回收上清，得到纯化蛋白。
变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽，lmM EDTA、 50mM Tris-HCl、 50mM NaCl、 10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始 的6M逐渐替换到4M、 3M、 2M、 0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。用BCA 法测得透析后重组蛋白的浓度为lmg/mL。
实施实例2:
低浓度的Cf-PGRP蛋白对革兰氏阳性菌的繁殖存在抑制作用，高浓度则具有杀灭作用。 此蛋白对一些革兰氏阴性菌也有一定的抗菌作用。在开发广"l普抗菌类药物、免疫增强剂和词 料添加剂等方面具有潜在应用。
对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的生长抑制实验取无菌试管36支，排成三排， 每管加入lmLSOB液体培养基和10nL对数生长期菌悬液，再向试管中加入终浓度为50ng/mL 和80ng/mL的重组蛋白、Tris—HC1对照溶液，37"220卬m培养，观察Oh、 3h、 6h、 9h、 22hODfi00 值的变化，每个样品设三个重复，根据3次测得结果取平均值作图。实验表明，低浓度的 Cf-PGRP蛋白对革兰氏阳性菌的繁殖存在抑制作用，高浓度则具有杀灭作用，此蛋白对一些 革兰氏阴性菌也具有一定的抗菌作用。6小时测得80pg/mL的重组蛋白对藤黄微球菌、枯草芽 孢杆菌、大肠杆菌的抑菌率分别为诉.58%、 98.69%、 75.47%。
实施实例3:藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌最小抑菌浓度的测定。
细菌371C培养节OD600-0.5,稀释l X 10 咅与终浓度范闱在0ng/mL、 lng/mL、 2jig/mL、 4jig/mL、 8ng/mL、 16ng/mL 、 32pg/mL、 64pg/mL的重组蛋白、Tris—HCl对照溶液共孵育30min， 倒入SOB平板培养，平板室温下培养18h后，不允许任何肉眼可见菌落生长的最小蛋白浓度即 最小抑菌浓度(MIC),每个样品设三个重复。结果重组蛋白对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为2pg/mL、 2ng/mL、 4pg/mL。
图示为重组肽聚糖识别蛋白在50pg/mL和80pg/mL两种浓度对藤黄微球菌、 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌生长的抑制作用。
SEQIDNo.l的信息 序列特征
长度252个氨基酸 类型氨基酸 链型单链 拓扑结构线形
特性分子量为27.88 kDa,等电点为8.69，其中编码序列的1-21位为信号肽序列，成熟
肽分子量为25.60kDa，等电点为8.77，具有一个保守的PGRP结构域和位于羧基末端的三
个锌离子结合位点。
来源栉孔扇贝(CWflW^/flWf)
序列描述
GHRDVRDTDCPGNALYKNMSSWTHFHIHGPGCP序列表
<110>中国科学院海洋研究所
<120〉 一种具有杀菌活性的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的制备及应用 <140>
<141〉 2008-10-23
<160> 1
<170> Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 252
<212> PRT
<213> 梓孔扇贝(Chlamys farreri) <220><221> BINDING <222> (83) . (225)
<400〉 1
Met Glu Lys Ser Leu Trp Thr Scr Cys Lou Val Va] Leu Leu l,cu Scr
15 10 15
Pro Thr Cys Leu Ser lie Thr Ala Asp Tyr Leu I]e Thr GJy Pro Arg
20 25 30
Asp Asp Lys Cys Ala Ala Leu Gly Gly lie Cys Gin Asn Asp Asn Gin
35 40 45
Tyr Cys Thr G]y Ser Tyr Phe Scr Asn Lys Cys A La Gly l)ro Val Thr
50 55 60
Thr Arg Cys Cys Thr Lys Asn lie Thr lie Arg Asp Thr Lys Glu Cys 65 70 75 80
Lys Asn Val Met lie lie Ser Arg Asp Ser Trp G]y Ala Arg Arg Pro
85 90 95
Val Lys Va] Leu Pro Leu Lys Thi" Pro Val Gly Asp Phe Phe Leu His 100 105 U0His Thr Asp Thr Lys Asn Cys Thr Thr Ala Lys Asn Cys [le Ser I]e
115 120 125
Val Lys Ser lie Gin Gin Tyr His Met Asn Asp Lys Asn Trp Trp Asp
130 135 140
lie Ala Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Asp Gly出s V"l Tyr' Glu Gly 145 150 155 160
Arg Gly Trp Lys Thr Val Gly Ser His Thr Arg Gly Cys Asn Asp Lys
165 170 175
Ser Leu Ala Ala Ser Met lie Gly Asn Phe Asn Asp Val Leu Pro Asn
180 185 190
Ala Ala Ala I,cu Ser Scr Val Lys Arg Leu Tlr Scr 「ys Gly Val Glu
195 200 205
lie Gly Arg Leu Ser Pro Asn Tyr Ser Leu Phe Gly His Arg Asp Val
210 215 220
Arg Asp Thr Asp Cys Pro Gly Asn Ala Leu Tyr Lys Asn Met Ser Ser 225 230 235 240
Trp Thr His Phe His lie His Gly Pro Gly Cys Pro 245 250
权利要求
1、一种栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP基因编码蛋白，其特征在于含有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列。
2、 一种根据权利要求1所述的栉孔扇贝重组肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP的制备方法，其特征在 于(1)利用带有限制性酶切位点的引物Pl和P2扩增栉孔扇贝Cf-PGRP基因编码区片断(2)将pET32a载体与PCR扩增产物经fe/zH I和AbH双酶切，连接后转化表达菌株BL21 (DE3) plysS; (3)测序鉴定重组子并进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白， 经纯化、复性后得到具有活性的肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP。
3、 一种权利要求l所述的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP的应用。其特征在于栉孔扇贝 肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP可作为广谱抗菌类药物治疗细菌感染，或用于免疫增强剂、保健品、 饲料添加剂的生产。
全文摘要
本发明涉及栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白(Cf-PGRP)基因的体外重组表达技术及其功能鉴定。栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白具有序列SEQ ID NO.1中氨基酸序列。本发明利用体外重组表达技术获得了栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白Cf-PGRP，该重组蛋白具有广谱性的杀菌效果，对革兰氏阳性菌的杀灭作用显著，对革兰氏阴性菌也有一定的抗菌作用，在开发广谱抗菌类药物、免疫增强剂和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
文档编号C07K14/705GK101619102SQ200910130448
公开日2010年1月6日 申请日期2009年4月7日 优先权日2008年12月16日
发明者姚雪梅, 宋林生, 婉 王, 王玲玲, 盖云超, 苏建国, 赵建民, 邱丽梅 申请人:中国科学院海洋研究所