栉孔扇贝g型溶菌酶基因和编码蛋白及其克隆方法

专利名称：栉孔扇贝g型溶菌酶基因和编码蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及G型溶菌酶，特别是栉孔扇贝G型溶菌酶基因(cDNA全序列和氨基酸序列)及从栉孔扇贝cDNA中克隆出栉孔扇贝溶菌酶的克隆方法。
背景技术：
溶菌酶是由弗莱明在1922年发现的(Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.1922)。该酶全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能水解细菌细胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解，故又称胞壁质酶，即N-乙酰胞壁质糖苷聚糖水解酶。有些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌、伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。溶菌酶是一种广泛存在于自然界动物、植物和微生物中的小分子碱性蛋白，在机体中起非特异防御机制。正是用于溶菌酶的抗菌作用，无论在工业还是医学上都具有重要的应用价值。首先溶菌酶可药用，具抗菌、清除局部坏死组织、止血、消肿、消炎及恢复组织功能等作用，在医学上可用来制消炎药等。在食品工业上可用作防腐剂，还可添加在牙膏中作为防治龋齿的药用牙膏。在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于存作细胞壁，制备无菌体提取液。
溶菌酶可分为四型c型(鸡卵清溶菌酶，chicken egg-white lysozyme，cly)、g型(鹅卵清溶菌酶，goose egg-white lysozyme，gly)、i型(invertebratelysozyme)、噬菌体溶菌酶。大部分溶菌酶都属于c型，cly由130个氨基酸残基组成，相对分子质量为14700。gly最早是由Jolles和Canfield发现的，约含有185个氨基酸残基，相对分子质量为21000。Olsen，Nilson等报道的贝类i型溶菌酶与c型溶菌酶有一定的同源性。噬菌体溶菌酶位于各种噬菌体内，对溶解宿主菌起重要作用，它含有164个氨基酸残基，相对分子质量为18700。目前在无脊椎动物中还没有g-溶菌酶的报道，相关海洋生物报道的有Savan报道的鲤鱼g-lysozyme，Rogerio报道的白虾c-lysozyme，FengLiu报道的斑马鱼c-lysozyme，Hikima报道的牙鲆g-lysozyme，以及Olsen，Nilson等报道的与cly具有同源性的贝类i-lysozyme。
溶菌酶在海洋贝类抵御病原菌感染中扮演重要的角色，并且由于其此独有的低温、高盐作用环境可使之区别于现有的哺乳动物溶菌酶，具有重要的应用前景，它可应用于海洋生物医药、海洋生物免疫、水产品低温保存和运输等不同领域。

发明内容
本发明利用构建cDNA文库、EST分析、3’和5’RACE技术，对栉孔扇贝G型溶菌酶基因进行了研究，首次从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因，该基因可以用于溶菌酶基因的体外重组表达和基因转移，为医药产品开发、扇贝免疫学研究、遗传选育和改良、病害防治以及保鲜品和防腐剂的开发奠定了基础。
本发明从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因，它具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列；其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因的方法包括(1)栉孔扇贝总RNA的提取及mRNA的纯化；(2)栉孔扇贝cDNA文库构建；(3)栉孔扇贝cDNA文库EST序列的大规模测定；(4)栉孔扇贝EST序列的同源性分析及栉孔扇贝G型溶菌酶基因片段的筛选；(5)用基因特异性引物CFLyzF 5′-CATCCGCTACCACTCCTGTC-3′和CFLyzR 5’-CAACTACGTCATTGCTGTAGTC-3’进行3’和5’RACE克隆到栉孔扇贝G型溶菌酶基因cDNA全长序列。
所述的栉孔扇贝总RNA的提取是从感染了鳗弧菌的栉孔扇贝血淋巴中提取总RNA。
本发明克隆得到的栉孔扇贝G型溶菌酶基因，该基因cDNA全长829bp，有一个600bp的开放阅读框，编码200个氨基酸，5’非编码区长21bp，3’非编码区长208bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴；该基因在扇贝免疫防御方面具有重要功能。
本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA 3’和5’快速扩增技术(RACE)从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因，可用于溶菌酶的重组表达和基因转移，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础。所制得的栉孔扇贝G型溶菌酶基因的序列可在栉孔扇贝遗传选育中的应用；也可在细菌、酵母和昆虫细胞系中的表达；同时其重组表达产物也可在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用。
具体实施例方式
实施例1.一种克隆得到的栉孔扇贝G型溶菌酶基因，具有以下序列(1)序列表中SEQ ID NO.1的信息序列特征长度829碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线形来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)序列描述GCACGAGGCTAGATTCCAACGATGAACCCACTGGCAGTACTCACACTTCTTGCTATCAGCACTGGTGCCTGGGCAGCGTCCTACACCTGCCATGGTGACGTCACACGACTTCATCCCCATGGACAACACAATAGAGGTGTCGCTGCATCCAACCGTGGCGTAGATTACGATTACCATGACCTGTTAGCCAAGAAAAGTTGTTACGAAGCATCAGGCGCACGACACTGTATTCAGCCGTCTGTGATTGCCGCCTTGGCCAGTCGAGAATCACGTGGAGGGCGTCTTCTGACGTCAACAGGAGGATGGGGAGATCATCACCATGCCTACGGTATATTACAGTGTGACATCCGCTACCACTCCTGTCAGCAGTACGCTTGGAACAGTTGTGAACACATAGAACAAATGGTGAAGGAGGTCCTTGTGGCATACATCGGTCAGGTGGCGCGTAAACATCCCACGTGGTCACGAGATCAGCAACTCCAAGGTGGTATCGCCGCCTACAACTCCGGAGTTGGCAACGTCCAGACCTGGGCCCACCTCGACGTCGGCACAACCGGAAATGACTACAGCAATGACGTAGTTGCGCGTGCTAAACACCTTATTTCAAGCCACGGCTGGCATTAAATGCGATTAAGCACGAAAGAGAGCCACCCATGCTAATTTCAAGATATAATATTCAAAAGAGCGATATTTTTACTTTGAAGAGATAATCGTTTTAAGGACAGGACATAGAAATCATGCATTGTTGGTAATGGCTTGCATATTACAGTAATAAACGGTTGTACTAATGTTCTTCAAAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)序列表SEQ ID NO.2的信息序列特征长度200个氨基酸类型氨基酸链型单链拓扑结构线形来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)序列描述MNPLAVLTLLAISTGAWAASYTCHGDVTRLHPHGQHNRGVAASNRGVDYDYHDLLAKKSCYEASGARHCIQPSVIAALASRESRGGRLLTSTGGWGDHHHAYGILQCDIRYHSCQQYAWNSCEHIEQMVKEVLVAYIGQVARKHPTWSRDQQLQGGIAAYNSGVGNVQTWAHLDVGTTGNDYSNDVVARAKHLISSHGWH实施例2.栉孔扇贝G型溶菌酶基因的克隆1)栉孔扇贝总RNA的提取和mRNA的纯化用注射器从感染了鳗弧菌的栉孔扇贝的闭壳肌中采集血淋巴，4℃ 700g离心10分钟，利用Invitrogen公司的Trizol试剂并参照其说明提取总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。
2)栉孔扇贝cDNA文库构建利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和ZAP-cDNASynthesis Kit(Stratagene)并参照使用说明进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit对大于100bp的酶切片段进行回收，与Invetrogen公司Uni-ZAP XR vector载体连接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从Uni-ZAPXR Vector上体外切割pBluescript成为质粒文库。
3)栉孔扇贝cDNA文库EST序列的大规模测定从文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据。
4)栉孔扇贝EST序列的同源性分析及栉孔扇贝G型溶菌酶基因片段的筛选将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，根据相似性分析结果寻找出与G型溶菌酶基因同源的EST序列。
5)栉孔扇贝G型溶菌酶基因cDNA全长序列的克隆利用3’和5’RACE技术克隆栉孔扇贝G型溶菌酶基因cDNA全长序列，根据与G型溶菌酶基因同源的EST序列设计基因特异性引物CFLyzF 5′-CATCCGCTACCACTCCTGTC-3’和CFLyzR 5’-CAACTACGTCATTGCTGTAGTC-3’，分别利用载体通用引物T3、T7与CFLyzF、CFLyzR进行3’和5’末端的扩增，PCR产物用1.5％琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，转化XL1-blue菌株，挑选阳性克隆提取质粒，用CFLyzF和CFLyzR引物和载体引物进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定。测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列；3’端PCR扩增所用体系以及反应条件25μl反应体系2.5μl 10×PCRbuffer，1.0μl MgCl2(2.5mM)，2.0μl dNTP(2.5mM)，1μl引物CFLyzF(10pmol/μl)，1μl引物T7(10pmol/μl)，16.3μl of PCR-grade water，0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)，1μl cDNA模板。
反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸55秒，共进行31个循环，最后72℃延伸10分钟。
5’端PCR扩增所用体系以及反应条件25μl反应体系2.5μl 10×PCRbuffer，1.0μl MgCl2(2.5mM)，2.0μl dNTP(2.5mM)，1μl引物CFLyzR(10pmol/μl)，1μl引物T3(10pmol/μl)，16.3μl of PCR-grade water，0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)，1μl cDNA模板。
反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸55秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟。
实施例3.栉孔扇贝G型溶菌酶基因的序列在栉孔扇贝遗传选育中的应用根据实施例1中序列表中SEQ ID NO.1的序列设计PCR和RT-PCR引物，对栉孔扇贝不同个体G型溶菌酶基因的部分序列进行扩增和序列测定，比较不同个体在G型溶菌酶基因序列上的差异，同时比较不同个体G型溶菌酶基因mRNA表达水平的差异，以此指导栉孔扇贝的遗传选育。
实施例4.栉孔扇贝G型溶菌酶基因的重组表达及重组表达产物的应用根据序列表SEQ ID NO.2中栉孔扇贝G型溶菌酶对应cDNA序列设计引物，引入两个不同的限制性内切酶突变位点，然后克隆到pQE系列，pET系列，pGEX-4T系列，pPIC系列，pGAPZ等系列表达载体，再将构建成的重组表达载体转化大肠杆菌和酵母，筛选阳性克隆并以IPTG或甲醇诱导重组蛋白的表达。利用亲和层析对表达产物进行多级纯化，获得体外表达的重组栉孔扇贝G型溶菌酶。该产品可作为药物、饲料添加剂、防腐剂和保鲜剂使用。
栉孔扇贝SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120>栉孔扇贝G型溶菌酶基因和编码蛋白及其克隆方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>829<212>DNA<213>栉孔扇贝(Chlamys farreri)<220>
<221>CDS<222>(22)..(621)<223>
<400>1gcacgaggct agattccaac g atg aac cca ctg gca gta ctc aca ctt ctt 51Met Asn Pro Leu Ala Val Leu Thr Leu Leu1 5 10gct atc agc act ggt gcc tgg gca gcg tcc tac acc tgc cat ggt gac 99Ala Ile Ser Thr Gly Ala Trp Ala Ala Ser Tyr Thr Cys His Gly Asp15 20 25gtc aca cga ctt cat ccc cat gga caa cac aat aga ggt gtc gct gca147Val Thr Arg Leu His Pro His Gly Gln His Asn Arg Gly Val Ala Ala30 35 40tcc aac cgt ggc gta gat tac gat tac cat gac ctg tta gcc aag aaa195Ser Asn Arg Gly Val Asp Tyr Asp Tyr His Asp Leu Leu Ala Lys Lys45 50 55agt tgt tac gaa gca tca ggc gca cga cac tgt att cag ccg tct gtg243Ser Cys Tyr Glu Ala Ser Gly Ala Arg His Cys Ile Gln Pro Ser Val60 65 70
栉孔扇贝att gcc gcc ttg gcc agt cga gaa tca cgt gga ggg cgt ctt ctg acg 291Ile Ala Ala Leu Ala Ser Arg Glu Ser Arg Gly Gly Arg Leu Leu Thr75 80 85 90tca aca gga gga tgg gga gat cat cac cat gcc tac ggt ata tta cag 339Ser Thr Gly Gly Trp Gly Asp His His His Ala Tyr Gly Ile Leu Gln95 100 105tgt gac atc cgc tac cac tcc tgt cag cag tac gct tgg aac agt tgt 387Cys Asp Ile Arg Tyr His Ser Cys Gln Gln Tyr Ala Trp Asn Ser Cys110 115 120gaa cac ata gaa caa atg gtg aag gag gtc ctt gtg gca tac atc ggt 435Glu His Ile Glu Gln Met Val Lys Glu Val Leu Val Ala Tyr Ile Gly125 130 135cag gtg gcg cgt aaa cat ccc acg tgg tca cga gat cag cga ctc caa 483Gln Val Ala Arg Lys His Pro Thr Trp Ser Arg Asp Gln Gln Leu Gln140 145 150ggt ggt atc gcc gcc tac aac tcc gga gtt ggc aac gtc cag acc tgg 531Gly Gly Ile Ala Ala Tyr Asn Ser Gly Val Gly Asn Val Gln Thr Trp155 160 165 170gcc cac ctc gac gtc ggc aca acc gga aat gac tac agc aat gac gta 579Ala His Leu Asp Val Gly Thr Thr Gly Asn Asp Tyr Ser Asn Asp Val175 180 185gtt gcg cgt gct aaa cac ctt att tca agc cac ggc tgg cat 621Val Ala Arg Ala Lys His Leu Ile Ser Ser His Gly Trp His190 195 200taaatgcgat taagcacgaa agagagccac ccatgctaat ttcaagatat aatattcaaa681agagcgatat ttttactttg aagagataat cgttttaagg acaggacata gaaatcatgc741attgttggta atggcttgca tattacagta ataaacggtt gtactaatgt tcttcaaaac801caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 829<210>2<211>200<212>PRT<213>栉孔扇贝(Chlamys farreri)<400>2Met Ash Pro Leu Ala Val Leu Thr Leu Leu Ala Ile Ser Thr Gly Ala1 5 10 15Trp Ala Ala Ser Tyr Thr Cys His Gly Asp Val Thr Arg Leu His Pro20 25 30His Gly Gln His Asn Arg Gly Val Ala Ala Ser Asn Arg Gly Val Asp35 40 45
栉孔扇贝Tyr Asp Tyr His Asp Leu Leu Ala Lys Lys Ser Cys Tyr Glu Ala Ser50 55 60Gly Ala Arg His Cys Ile Gln Pro Ser Val Ile Ala Ala Leu Ala Ser65 70 75 80Arg Glu Ser Arg Gly Gly Arg Leu Leu Thr Ser Thr Gly Gly Trp Gly85 90 95Asp His His His Ala Tyr Gly Ile Leu Gln Cys Asp Ile Arg Tyr His100 105 110Ser Cys Gln Gln Tyr Ala Trp Asn Ser Cys Glu His Ile Glu Gln Met115 120 125Val Lys Glu Val Leu Val Ala Tyr Ile Gly Gln Val Ala Arg Lys His130 135 140Pro Thr Trp Ser Arg Asp Gln Gln Leu Gln Gly Gly Ile Ala Ala Tyr145 150 155 160Asn Ser Gly Val Gly Asn Val Gln Thr Trp Ala His Leu Asp Val Gly165 170 175Thr Thr Gly Asn Asp Tyr Ser Asn Asp Val Val Ala Arg Ala Lys His180 185 190Leu Ile Ser Ser His Gly Trp His195 200
权利要求
1.栉孔扇贝G型溶菌酶基因，其特征在于具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
2.一种权利要求1所述的栉孔扇贝G型溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种权利要求1所述的栉孔扇贝G型溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于，包括(1)栉孔扇贝总RNA的提取及mRNA的纯化；(2)栉孔扇贝cDNA文库构建；(3)栉孔扇贝cDNA文库EST序列的大规模测定；(4)栉孔扇贝EST序列的同源性分析及栉孔扇贝G型溶菌酶基因片段的筛选；(5)利用3‘和5’RACE技术克隆栉孔扇贝G型溶菌酶基因cDNA全长序列。
4.按照权利要求3所述的栉孔扇贝G型溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于，所述的栉孔扇贝总RNA的提取是从感染了鳗弧菌的栉孔扇贝血淋巴中提取总RNA。
全文摘要
本发明涉及G型溶菌酶，特别是栉孔扇贝G型溶菌酶基因和编码蛋白及其克隆方法；栉孔扇贝G型溶菌酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明克隆到的栉孔扇贝G型溶菌酶基因有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在扇贝免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重组表达和基因转移，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础。
文档编号C12N9/36GK1763201SQ20041005065
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月22日 优先权日2004年10月22日
发明者宋林生, 邹慧斌, 胥炜, 相建海 申请人:中国科学院海洋研究所