专利名称：栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从栉孔扇贝内脏团中提取制备具有血管保护效应的活性物质——栉孔扇贝糖胺聚糖(SS-GAG)的方法，属于对海产品扇贝进一步综合加工利用的技术方法。
背景技术：
近年来扇贝养殖在我国发展迅速，主要有栉孔扇贝、海湾扇贝等品种。扇贝在加工后所得的下脚料——扇贝内脏团(也称扇贝裙边)大部分被丢弃，造成极大浪费，大量扇贝裙边资源函待开发利用。已知扇贝内脏团中含有多种成分，其中糖胺聚糖(GAG)是十分重要的活性物质。据国内外文献报道，海洋软体动物中含有多种GAG，如刺参、海星、鲨鱼、翡翠贻贝、马氏珠母贝等动物中的GAG，分别具有抗凝、降脂、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等生物活性。已引起人们对这类高分子活性物质的高度重视。有文献报道，从海湾扇贝的净边中提取出一种肝素样的GAG，具有抗凝活性。对于从栉孔扇贝内脏团中提取有血管保护效应的GAG的方法国内外未见有报道。
发明内容
本发明的目的是要提供一种从栉孔扇贝内脏团中提取制备具有保护血管效应的物质——栉孔扇贝糖胺聚糖的方法，所提取的糖胺聚糖之理化特征是呈微黄色粉末状，无臭无味、易潮解、易溶于水；为类肝素样氨基多糖，所含的氨基己糖主要为氨基半乳糖，己糖醛酸以艾杜糖醛酸为主；其硫酸基与羧酸基的比值为1.69∶1；所设计的制备方法，具有操作简单、反应条件温和、成本低廉、得率及纯度高、工艺有利于综合利用的特点。
本发明涉及的栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，是以近海养殖的栉孔扇贝内脏团为原料而制得，提取制备工艺如下将鲜品或冻品解冻后的栉孔扇贝内脏团称重，加水制成匀浆液，控制室温8～32℃，在匀浆液中加入蛋白酶，加热搅拌，反应4～5小时，得酶解液；将酶解液在离心机中离心，得离心液，弃去沉淀物；对离心液加二次乙醇溶液，形成沉淀，用离心机分离，得沉淀物，回收上清液乙醇；对沉淀物加蒸馏水配成水溶液后加热并加入活性炭搅拌，冷却后经离心，收集上清液，弃去沉，淀；对上清液抽滤，进一步除去活性炭及其吸附的蛋白质及色素，得清液；将清液用滤膜超滤，得分子量为5k～100k的滤液；将滤液冷冻干燥，即制得浅黄色粉末状精制栉孔扇贝糖胺聚糖。
本栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，在匀浆液中加入的蛋白酶为中性蛋白酶和胰蛋白酶，中性蛋白酶加入量为15～20g/kg匀浆液，胰蛋白酶加入量为5～10g/kg匀浆液中，反应温度为50℃，时间为4～5小时。
本栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，对离心液加2次乙醇溶液时，其加入的乙醇溶液浓度为90～95％，其终浓度为65～75％，反应时间为12小时。
本栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，所述的对沉淀物加蒸馏水配成水溶液时，制得的水溶液浓度为4～6％。
本栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，所述的对水溶液加热加活性炭，其活性炭加入量是活性炭重量与水溶液体积比为1～2％，其加热温度为80℃。
本的提取制备方法，所述的将清液超滤，其超滤先后应用100k和5k滤膜，最终得分子量为5k～100k的滤液。
本发明的制备方法，其优点之一在于该方法促进了栉孔扇贝的综合利用，以往栉孔扇贝加工扇贝柱后剩余的内脏团作为废料大部分被丢弃，而本制备方法是利用废弃物提取有药用价值的糖胺聚糖，其成本低廉，而且这种栉孔扇贝糖胺聚糖具有的血管保护效应是首次被发现证实。在提取糖胺聚糖的同时还可大量回收蛋白质，增加了其经济效益及药用价值。
本方法优点之二是提取方法简单、得率及纯度高。该方法采用中性蛋白酶和胰蛋白酶进行水解，较一种蛋白酶或胰匀浆水解更充分。该方法在栉孔扇贝内脏团匀浆液里直接加入蛋白酶进行水解，比起文献中提取多糖常用的先加丙酮脱脂制成丙酮粉，然后再进行酶解简单的多。
具体实施例方式实施例1称取新鲜栉孔扇贝内脏团2kg，在室温20℃条件下加水2升制成匀浆液，取匀浆液加入中性蛋白酶35g，胰蛋白酶10g，在50℃条件下电动搅拌5小时得酶解液；用5000转/分离心约四十分钟；取离心液，弃去沉淀物；对离心液加入95％乙醇，乙醇终浓度为70％，经搅拌后静置12小时，经6000转/分离心30分钟，得沉淀物，再加一次95％的乙醇溶液洗涤，6000/分离心30分钟，回收上清液(乙醇)，收集湿的沉淀物约85g；将沉淀物用蒸馏水配成5％溶液1700ml，加热至80℃，加入活性炭17g，搅拌30分钟；冷却后离心(6000转/分)30分钟，收集上清液，弃去沉淀；上清液经沙心漏斗抽滤，进一步去除活性炭及其吸附的蛋白质及色素，得清液；将清液用100k滤膜超滤，得滤过液体，再用5k滤膜继续超滤，得滤不过液体(分子量5k～100k)，经冷冻干燥，即得浅黄色粉末状的精制栉孔扇贝糖胺聚糖4.5g。
实施例2取已解冻的栉孔扇贝内脏团2kg，按实施例1方法提取制备栉孔扇贝糖胺聚糖，最终得4.0g栉孔扇贝糖胺聚糖。
实施例3按实施例1方法分不同时间、不同原料量提取制备栉孔扇贝糖胺聚糖，具体结果见表1。
表1对提取制备的栉孔扇贝糖胺聚糖进行了多项药效学实验，结果表明用本发明方法提取得到的栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用，对泡沫细胞形成有明显的抑制作用，对人血管内皮细胞损伤具有明显的保护作用。下面简要说明，作为对本发明效果的进一步证明。
(一)栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用血管平滑肌细胞(VSMCs)的移行与过度增生是动脉粥样硬化最基本的病理改变，也是冠脉成型术后再狭窄的主要原因。本实验观察了栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用以及对血管平滑肌细胞的合成分泌功能的影响。
1.栉孔扇贝糖胺聚糖对血管平滑肌细胞增殖活性的影响分别取家兔和大鼠的胸主动脉，采用胶原酶消化法和组织块贴壁法进行血管平滑肌细胞原代培养，待细胞贴壁、融合并长成致密单层后进行传代培养，取5-8代细胞进行实验。观察研究了栉孔扇贝糖胺聚糖对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管平滑肌细胞增殖活性的作用、对20％胎牛血清(FBS)诱导的血管平滑肌细胞增殖活性的作用、对血管平滑肌细胞的血小板衍化生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响、对血管平滑肌细胞增殖动力学的影响。实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖在50、100、200μg·mL-1浓度下，对20％FBS、bFGF所致的血管平滑肌细胞增殖均有明显抑制作用，并能逆转血管平滑肌细胞增殖时PCNA、PDGF的表达增强。栉孔扇贝糖胺聚糖可通过抑制血管平滑肌细胞S期的DNA合成、减少S期细胞从而阻抑血管平滑肌细胞的增殖。
2.栉孔扇贝糖胺聚糖对增殖的血管平滑肌细胞抗氧化功能的影响建立碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管平滑肌细胞增殖模型，采用酶法和硫代巴比妥酸法等方法测定各组细胞的培养液中SOD超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量及总抗氧化能力的变化，观察不同浓度栉孔扇贝糖胺聚糖对增殖的血管平滑肌细胞的抗氧化功能的影响。实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖(100ug/ml、200ug/ml)可增强血管平滑肌细胞的总抗氧化能力和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，减少过氧化物丙二醛的产生，提高细胞的抗氧化功能。
3、栉孔扇贝糖胺聚糖对增殖的血管平滑肌细胞内一氧化氮合酶(NOS)及一氧化氮(NO)含量的影响建立bFGF诱导的家兔血管平滑肌细胞增殖模型。采用硝酸还原酶法测定细胞内一氧化氮(NO)的含量，用比色法测定细胞内一氧化氮合酶(NOS)活力。实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖能够提高血管平滑肌细胞内NO的含量和NOS活性。
4、栉孔扇贝糖胺聚糖对增殖的血管平滑肌细胞内血小板源性生长因子A链(PDGF-A)mRNA表达的影响以原位杂交检测血管平滑肌细胞内PDGF-A mRNA的表达，应用DNAStar软件设计大鼠PDGF-A特异性cDNA寡核苷酸探针，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并经5’端地高辛标记，因其可与细胞浆内的PDGF-A mRNA发生特异性结合，通过地高辛检测试剂盒可检测到标本中的PDGF-A mRNA和其相对含量。结果显示，经100μg/ml和200μg/ml的SS-GAG孵育后的血管平滑肌细胞内的PDGF-A链mRNA阳性转录减弱，阳性细胞数量减少。
上述研究结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖可通过抑制细胞DNA合成、减少S期细胞、抑制血管平滑肌细胞内PDGF-A链基因转录和抑制血管平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化，从而抑制血管平滑肌细胞增殖；同时栉孔扇贝糖胺聚糖还可通过减少脂质过氧化物的产生或使过氧化物排出增多，从而使血管平滑肌细胞的抗氧化作用增强；另外，栉孔扇贝糖胺聚糖可提高血管平滑肌细胞的总NOS活力、增加NO合成和释放；以上作用均可有利于抑制动脉粥样硬化的形成，保护血管平滑肌细胞免受氧化损伤。
(二)栉孔扇贝糖胺聚糖对泡沫细胞形成的抑制作用泡沫细胞是动脉粥样硬化(AS)早期病理变化脂纹中的主要细胞病变。AS早期单核细胞首先粘附于血管内皮，然后迁移至内皮下分化为巨噬细胞，后者主要通过清道夫受体(SR)吞噬大量ox-LDL形成泡沫细胞，进而沉积形成AS斑块。血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异性的细胞有丝分裂原，具有促进细胞分裂增殖和血管构建的作用。在AS斑块组织中，VEGF表达明显增高，在AS早期发展中起重要作用。本实验以U937人类单核细胞为材料，建立由氧化低密度脂蛋白(LDL)诱导的单核细胞源性泡沫细胞模型，采用酶法和酶联免疫(ELISA)法研究栉孔扇贝糖胺聚糖对泡沫形成及VEGF表达的影响。实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖能够抑制泡沫细胞的形成，使细胞内的总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯降低，并逆转VEGF在泡沫细胞中的高表达从而发挥抗AS的作用。
(二)栉孔扇贝糖胺聚糖对人血管内皮细胞损伤的保护作用动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础，血管内皮细胞的损伤及其功能异常是动脉粥样硬化发生的始动、关键性环节。保护血管内皮细胞免受损伤是预防和治疗动脉粥样硬化的关键。本实验采用体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株(CRL-2480)，研究了SS-GAG对血管内皮细胞氧化损伤后增殖活性和合成分泌功能的影响。
1、栉孔扇贝糖胺聚糖对氧化损伤的血管内皮细胞增殖活性的影响通过形态学观察、细胞计数法、MTT法分别进行了栉孔扇贝糖胺聚糖对Fenton体系引发的细胞增殖活性损伤的影响、对多聚赖氨酸(PL)引发的细胞增殖活性损伤的影响、对OX-LDL损伤的血管内皮细胞形态和增殖活性的影响及对H2O2损伤的血管内皮细胞增殖活性的影响四个实验。综合上述实验结果可见，栉孔扇贝糖胺聚糖能明显改善四种氧化损伤造成的血管内皮细胞增殖活性的抑制，对正常血管内皮细胞的增殖活性也有促进作用，说明栉孔扇贝糖胺聚糖具有抗血管内皮细胞氧化损伤的能力，作用机理可能与其抑制活性氧(H2O2)的形成或直接清除已形成的活性氧有关，从而拮抗H2O2对血管内皮细胞的过氧化损伤作用而保护内皮细胞，更进一步说明了栉孔扇贝糖胺聚糖在防治动脉粥样硬化方面的重要作用。
2、栉孔扇贝糖胺聚糖对Fenton体系损伤的内皮细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)的影响建立Fenton体系内皮细胞损伤模型，观察栉孔扇贝糖胺聚糖对内皮细胞培养液中乳酸脱氢酶活力的影响。结果显示经Fenton体系损伤的对照组，LDH活力明显增高，说明氧自由基对内皮细胞有直接毒害作用，而栉孔扇贝糖胺聚糖可降低损伤对照组的LDH活力，提示栉孔扇贝糖胺聚糖具有抗氧化功能，可抑制氧自由基对细胞膜及线粒体的损伤，减轻脂质过氧化物及其代谢产物对内皮细胞的直接毒害作用。这也是栉孔扇贝糖胺聚糖抗动脉粥样硬化作用的机制之一。
3、栉孔扇贝糖胺聚糖对OX-LDL损伤的血管内皮细胞内一氧化氮和一氧化氮合成酶的影响建立血管内皮细胞OX-LDL损伤模型，采用硝酸还原酶法测定内皮细胞内NO的含量；运用化学比色法，测定细胞内NOS的活性。实验结果表明，OX-LDL可直接损伤血管内皮细胞，抑制其内皮细胞型NO合成酶(eNOS)的活性，直接或间接地抑制NO的合成与释放。栉孔扇贝糖胺聚糖能减轻OX-LDL的上述作用，进一步证明栉孔扇贝糖胺聚糖的对血管内皮细胞有保护作用。
4、栉孔扇贝糖胺聚糖对OX-LDL损伤的血管内皮细胞氧化酶系统和氧化产物的影响建立血管内皮细胞OX-LDL损伤模型，采用黄嘌呤氧化酶法，测定细胞内SOD的活性；用硫代巴比妥酸显色法，测定血管内皮细胞内丙二醛的含量。实验结果表明，OX-LDL造成的血管内皮细胞氧化损伤使其SOD活性受到抑制，而脂质过氧化物的代表性代谢产物MDA的生成却明显增加；三种剂量(50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml)的栉孔扇贝糖胺聚糖保护组内皮细胞内的SOD活性随栉孔扇贝糖胺聚糖的浓度的增加而逐渐恢复，同时丙二醛的含量也逐渐降低。因此可以认为栉孔扇贝糖胺聚糖对OX-LDL引发的血管内皮细胞脂质过氧化损伤有保护作用，从而进一步证明栉孔扇贝糖胺聚糖对血管内皮细胞的保护作用机理与其抗氧化作用有关。
5、栉孔扇贝糖胺聚糖对OX-LDL损伤的血管内皮细胞内前列环素I2和血栓素A2的影响建立血管内皮细胞OX-LDL损伤模型，采用放射免疫法测定血管内皮细胞的前列环素I2代谢产物含量和血栓素A2代谢产物含量。本实验结果显示，OX-LDL可抑制前列环素I2的合成，刺激血管内皮细胞分泌血栓素A2，打破前列环素I2-血栓素A2的平衡，因而促进了动脉粥样硬化的发生发展。栉孔扇贝糖胺聚糖可通过不同途径逆转上述结果，即通过升高前列环素I2水平，降低血栓素A2水平维持二者的平衡状态，从而阻止动脉粥样硬化(AS)的形成，这可能是栉孔扇贝糖胺聚糖抗动脉粥样硬化作用的重要机理之一。
6、栉孔扇贝糖胺聚糖对血管内皮细胞血管活性物质内皮素(ET)及血管紧张素II(AII)分泌的影响建立血管内皮细胞Fenton体系氧化损伤模型，采用放射免疫分析方法，利用均相竞争原理直接测定内皮细胞培养液中ET及AII的含量。本实验发现Fenton体系所产生的氧自由基可使内皮细胞分泌内皮素增加，而栉孔扇贝糖胺聚糖可明显抑制内皮细胞内皮素的分泌，且高浓度栉孔扇贝糖胺聚糖组内皮素分泌量明显低于低剂量组。
本实验还证实，氧自由基致内皮细胞损伤后，血管紧张素II的分泌也明显增加。据国内外文献报道，血管紧张素II有致炎作用，可促进血管内皮细胞产生粘附分子并刺激平滑肌细胞产生白细胞介素-6，参与AS的形成。血管紧张素还能使单核细胞趋化因子(MCP-1)升高，促进单核细胞与内皮细胞粘附及向血管浸润，血管紧张素II可激活平滑肌细胞(SMC)磷脂酰肌醇激酶，导致激活SMC有丝分裂，促进平滑肌细胞凋亡。血管紧张素II通过以上机制导致动脉粥样硬化的发展。本研究提示，栉孔扇贝糖胺聚糖抑制血管内皮细胞分泌血管紧张素II，所以，可能通过以上机制阻滞AS病变的发生和发展。
7、栉孔扇贝糖胺聚糖对氧化损伤引发的血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)表达的影响建立血管内皮细胞Fenton体系氧化损伤模型，采用酶联免疫方法，既双抗夹心ELLSA法检测VCAM-1。本实验结果显示，加入不同剂量的栉孔扇贝糖胺聚糖保护的内皮细胞VCAM-1的表达明显低于损伤对照组，且呈现出随栉孔扇贝糖胺聚糖剂量增加，VCAM-1表达依次降低的趋势，表明栉孔扇贝糖胺聚糖可抑制血管内皮细胞粘附分子-1表达，对血管内皮细胞损伤有防护作用，其作用随剂量增加而加强。
8、栉孔扇贝糖胺聚糖抑制血小板衍生生长因子B链(PDGF-BB)表达的研究建立血管内皮细胞Fenton体系氧化损伤模型，采用双抗夹心ELISA法测定PDGF-BB的表达量。研究发现内皮细胞在Fenton体系所产生的氧自由基刺激下，PDGF-BB表达明显增高，栉孔扇贝糖胺聚糖可抑制PDGF-BB的表达。已知血小板衍生生长因子(PDGF)是动脉粥样硬化时促进平滑肌增殖的最重要因子之一，PDGF在AS发生过程、血管壁炎症和修复中起关键作用。本研究显示栉孔扇贝糖胺聚糖抑制血管内皮细胞PDGF的产生，从而减弱了PDGF的致有丝分裂作用、促平滑肌增殖和转化的作用，因此有利于减弱和阻滞AS病灶的产生和发展，这可能是其抗动脉粥样硬化作用的重要机理之一。
综合上述实验结果表明，栉孔扇贝糖胺聚糖对血管内皮细胞损伤有良好的保护作用，说明栉孔扇贝糖胺聚糖的抗动脉粥样硬化作用可能与其保护内皮细胞，抑制血管内皮细胞受损后内皮素及血管紧张素II的分泌增加、逆转VCAM-1、PDGF-BB的表达增强、抗脂质过氧化、增加内皮型一氧化氮合成酶和前列腺素合成酶的活性等有密切关系。这为动脉粥样硬化和冠心病的防治提供了新的理论和实验依据。
权利要求
1.栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其特征在于其提取制备工艺如下将鲜品或冻品解冻后的栉孔扇贝内脏团称重，加水制成匀浆液，控制室温8～32℃，在匀浆液中加入蛋白酶，加热搅拌，反应4～5小时，得酶解液；将酶解液在离心机中离心，得离心液，弃去沉淀物；对离心液加二次乙醇溶液，形成沉淀，用离心机分离，得沉淀物，回收上清液乙醇；对沉淀物加蒸馏水配成水溶液后加热并加入活性炭搅拌，冷却后经离心，收集上清液，弃去沉淀；对上清液抽滤，进一步除去活性炭及其吸附的蛋白质及色素，得清液；将清液用滤膜超滤，得分子量为5k～100k的滤液；将滤液冷冻干燥，即制得浅黄色粉末状精制栉孔扇贝糖胺聚糖。
2.根据权利要求1所述的栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其特征在于在匀浆液中加入的蛋白酶为中性蛋白酶和胰蛋白酶，中性蛋白酶加入量为15～20g/kg匀浆液，胰蛋白酶加入量为5～10g/kg匀浆液中，反应温度为50℃。
3.根据权利要求1所述的栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其特征在于对离心液加2次乙醇溶液时，其加入的乙醇溶液浓度为90～95％，其终浓度为65～75％，反应时间为12小时。
4.根据权利要求1所述的栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其特征在于对沉淀物加蒸馏水配成水溶液时，制得的水溶液浓度为4～6％。
5.根据权利要求1所述的栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其特征在于对水溶液加热加活性炭搅拌，其活性炭加入量是活性炭重量与水溶液体积比为1-2％，其加热温度为80℃。
6.根据权利要求1所述的栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其特征在于将清液超滤，其超滤先后应用100k和5k滤膜，最终得分子量为5k～100k的滤液。
全文摘要
本发明涉及一种具有血管保护效应的活性物质——栉孔扇贝糖胺聚糖的提取制备方法，其提取制备工艺如下将栉孔扇贝内脏团称重，加水制成匀浆液，在匀浆液中加入蛋白酶，加热反应得酶解液；将酶解液在离心机中离心，弃去沉淀物，对离心液加二次乙醇溶液，形成沉淀；将分离后的沉淀物加蒸馏水配成水溶液后加热并加入活性炭，冷却后经离心，收集上清液，对上清液抽滤，得清液；将清液用滤膜超滤，得分子量为5k～100k的滤液；将滤液冷冻干燥即制得栉孔扇贝糖胺聚糖。该方法操作简单、反应条件温和、成本低廉、得率及纯度高，在提取糖胺聚糖的同时还可大量回收蛋白质，有利于栉孔扇贝内脏团的综合利用，提取的物质对于防治心脏血管性疾病有重要价值。
文档编号C12P19/04GK1746191SQ20041003565
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月7日 优先权日2004年9月7日
发明者刘赛, 刘晨光 申请人:青岛大学