专利名称：抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种由杂交瘤细胞分泌的抗栉孔扇贝(Chlamys farreri)颗粒血细胞 的单克隆抗体及其制备方法，属于贝类细胞免疫学技术领域。
背景技术：
贝类缺乏免疫球蛋白和特异性免疫，其免疫防御过程是由血细胞和血淋巴中的体 液因子协同完成。血细胞通过自溶、聚集、吞噬、包囊、胞吐、氧化杀伤等方式，达到识别、包 裹和清除外来异物的目的；血细胞还能通过释放溶菌素、凝集素、调理素等物质来调理辅 助体液因子免疫，其在贝类抵御外界环境刺激及外来病原微生物侵袭的过程中起着关键作用。目前贝类血细胞的分类大多根据形态及其染色亲和性，胞质中细胞器的多寡、颗 粒的有无而将其分为两大类透明血细胞和颗粒血细胞。透明血细胞细胞质染色很淡，几乎 不含颗粒或含微量颗粒，极少或完全没有细胞器。颗粒血细胞细胞质中含有数量不等的染 色颗粒，颗粒为由单层或双层膜包裹的球形小体，其内部含有丰富的活性物质，如髓过氧化 物酶、酸性磷酸酶、吞噬素、溶菌酶、葡糖苷酸酶等。大量研究表明无论是透明血细胞还是颗 粒血细胞其在抵御病原入侵和机体免疫修复过程中发挥着重要作用。有些研究认为当贝类 受寄生虫入侵时，颗粒血细胞会大量聚集，通过脱颗粒的方式释放活性物质等来改变和调 理寄生虫表面分子结构，并形成包绕寄生虫的内芽瘤或包囊；而透明血细胞则在造血作用 中较为重要，造血组织肿瘤状物的增生就来源于透明血细胞。但是，这两类血细胞在功能和 发生等问题中的作用和地位，一直没有确切的定论，主要是因为没有合适的分子标记物跟 踪其发生和参加免疫反应的过程。单克隆抗体因其特异性强、灵敏度高、无交叉性等特点被 成功应用于医学、高等动物免疫细胞的定位、发生、分化研究中。最近，应用该技术来研究牡 蛎血细胞的形态、结构特性，对虾血细胞的分类、免疫特性和贻贝免疫力的报道不断出现。 因此制得抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体，有助于研究颗粒血细胞在扇贝胚胎发育中 的发生、分化和分布，以及颗粒血细胞与其它类型血细胞免疫功能上的转换和差异。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单 克隆抗体；本发明的另一个目的是提供所述抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体的制备方法。本发明的任务是由以下技术方案实现的研制了一种抗栉孔扇贝颗粒血细胞 的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为杂交瘤细胞株《17，保藏号为CCTCC NO C201042，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年04月21日的杂交瘤 细胞分泌的。长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该 培养基中即含有大量由该杂交瘤细胞分泌的抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体。该单克 隆抗体能与栉孔扇贝颗粒血细胞特异性结合，并与其他组织细胞无交叉反应。
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一种抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制备方法，其步骤如下抽取栉孔扇贝 血淋巴经离心得到全血细胞；经介质密度梯度分离法得到栉孔扇贝颗粒血细胞；以颗粒血 细胞为抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞；经间接免疫荧光法 筛选、克隆、进一步筛选得到一株能分泌抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞 OT7 ；其分泌的抗体即为抗颗粒血细胞的单克隆抗体，经流式免疫荧光法验证其特性。所述的介质密度梯度分离法是Percoll介质梯度离心法将栉孔扇贝全血细胞悬 液置于不连续Percoll梯度的顶层，离心分离所得的自上而下的第三层细胞即为颗粒血细 胞。所述的间接免疫荧光法是将细胞融合后所得的杂交瘤细胞培养上清液与栉孔扇 贝全血细胞悬液或血滴片反应；继而加入异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠抗体；用荧光 显微镜在原位的暗视野与明视野下镜检，筛选抗颗粒血细胞的单克隆抗体，即单克隆抗体 6H7。所述的流式免疫荧光法是将单克隆抗体6H7与栉孔扇贝全血细胞悬液于培养板 孔中反应；继而加入异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠抗体；用流式细胞仪检测验证单克 隆抗体6H7所抗的细胞群确为颗粒血细胞群。本发明的优点在于由杂交瘤细胞6H7分泌的抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗 体能与栉孔扇贝颗粒血细胞特异性结合。长势良好的该杂交瘤细胞具有大小均一，外观饱 满，浑圆透亮，分裂旺盛，能无限分泌单一、纯净抗体的特点。该杂交瘤细胞在培养基中常规 培养2-3天，培养基中即含有了大量灵敏度高，效价好，特异性抗栉孔扇贝颗粒血细胞，且 与其他组织细胞无交叉性的单克隆抗体。抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制得为研究 颗粒血细胞在扇贝胚胎发育中的发生、分化和分布，以及颗粒血细胞与其它类型血细胞免 疫功能上的转换和差异提供重要的技术手段。本发明的抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制备方法是将经Percoll介质梯 度离心分离所得的颗粒血细胞(而非全血细胞)作为抗原免疫BALB/c小鼠；细胞融合、间 接免疫荧光法筛选、克隆、筛选得到抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体；所得的单克隆抗 体再经流式免疫荧光法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现 有免疫学检测筛选方法的作用和效果。
图1为本发明的经Percoll分离后三层细胞带流式检测和吉姆萨染色的结果图。图2为本发明的单克隆抗体6H7间接免疫荧光检测的结果图。图3为本发明的单克隆抗体6H7流式免疫荧光检测的结果图。图1所示A，B，C分别为经Percoll介质梯度离心分离后所对应的自上而下的第 一层，第二层，第三层细胞带悬液的流式检测结果；a，b，c分别为第一层，第二层，第三层细 胞带悬液制成的血滴片的吉姆萨染色结果。其中G为颗粒血细胞；H为透明血细胞。图2所示A为栉孔扇贝全血细胞悬液与单克隆抗体6H7反应后荧光(暗视野)检 测的结果；B为原位视野下微分干涉(明视野)检测的结果。其中G为颗粒血细胞；H为透 明血细胞。图3所示A为未经单克隆抗体6H7反应(阴性对照)的血细胞悬液流式检测的散点图；B为经单克隆抗体6H7反应的血细胞悬液流式检测的散点图；a为A图对应的荧光 值波峰图；b为B图对应的荧光值波峰图。其中红色点线为颗粒血细胞G ；绿色点线为透明 血细胞H;N为阴性；P为阳性。
具体实施例方式下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1 :PerColl介质不连续密度梯度分离栉孔扇贝全血细胞l.Percoll 市售原液与 10 倍浓度的抗凝剂(0. 14M NaCl,3mM KCl,8mM Na2HP04, 1. 5mMKH2P04, 20mM EDTA, pH 7. 4)按体积比 9 1 的比例配制 Percoll 应用液，再将 Percoll 应用液用抗凝剂稀释至不同的梯度50 % (v/v)，40 %，30 %，20 %和10 %，每种梯度2ml，置 于Percoll离心管中，4°C静置过夜；2.取8-10只活力健康、体质正常的栉孔扇贝，用灭过菌的干净注射器从闭壳肌抽 取血淋巴，按体积比为1 :1与预冷抗凝剂混勻，混合液于4°C，760g，离心lOmin，得到的全血 细胞沉淀再经抗凝剂重悬，调节全血细胞悬液浓度为107cells/ml ；3.取部分全血细胞悬液滴加到干净的载玻片上，30 u 1/片，置湿盒中沉降45min， 使其自然形成单层细胞的血滴片。之后再经过滤海水冲洗，室温干燥，甲醇固定5min，所得 的全血细胞血滴片于-20°C冻存，供间接免疫荧光法中筛选阳性杂交瘤细胞之用；4.将全血细胞悬液铺于Percoll梯度上，置水平转子离心机中2500rpm，4°C，离心 30min ；5.用含长细针头的干净注射器依次取出Percoll梯度中自上而下形成的三层独 立细胞带，2500rpm, 4°C，离心lOmin去除Percoll介质，所得的各层细胞带沉淀再用抗凝剂
重悬；6.各层细胞带悬液经200目筛绢网过滤后，用流式细胞仪检测各层细胞带中透明 血细胞和颗粒血细胞的比例；同时取部分各层细胞带悬液制作单层细胞滴片，吉姆萨染色 染色，观察各层细胞带的形态。流式细胞仪检测结果如图1中A，B，C所示第一层，第二层，第三层细胞带中G和 H的比例依次为45 55，11 89，90 10 ；吉姆萨染色结果如图1中a，b，c所示第一层 细胞带中颗粒血细胞和透明血细胞均大量存在，且存在比例也较为一致，第二层细胞带主 要为透明血细胞，而第三层细胞带则主要为颗粒血细胞。实施例2 制备抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体1.免疫小鼠取经Percoll分离后的第三层细胞带悬液为抗原免疫4周龄雌性BALB/c小鼠。每 次免疫剂量为0. 1ml，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后2次免疫间隔为1周， 前2次为腹腔注射，后2次为尾静脉注射。(1)基础免疫第三层细胞带悬液与福氏完全佐剂等比体积混勻作抗原；(2)加强免疫第三层细胞带悬液与福氏不完全佐剂等比体积混勻作抗原；(3) 二次加强免疫第三层细胞带悬液作抗原；(4)融合前三天的扩增免疫第三层细胞带悬液作抗原。2.细胞融合
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(1)脱颈椎法处死免疫小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用 RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；(2)分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液lOOOrpm离心3min，弃去上清液，脾细胞沉 淀用RPMI-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用含有HAT的RPMI_1640(含10%胎牛血清) 选择性细胞培养液重悬；(3)取细胞密度约为3X107的，处于对数生长期的P3-X63_Ag8Ul骨髓瘤细胞， lOOOrpm离心3min，去上清液后，用RPMI-1640溶液重悬；(4)将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均勻后，lOOOrpm离心3min，完全吸去上清 液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混勻成糊状；用吸管吸取预温到37°C的聚乙二醇 溶液1ml，滴加到离心管内，在lmin内加完；然后在37°C水浴静置5min ；(5)继续滴加已经预温到37°C的RPMI-1640溶液15ml，使PEG稀释而失去作用；(6)补加RPMI-1640溶液至40ml，经lOOOrpm离心3min，弃去上清液；(7)将细胞沉淀用3ml 37°C的RPMI-1640 (含10%胎牛血清)细胞培养液重悬，冻 存 2ml。(8)将剩下的1ml细胞悬液加入(2)制成的胸腺细胞悬液，混合均勻后滴加到96 孔培养板中；(9)将培养板放入37°C，C02浓度为4. 5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞 生长情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。3.筛选和克隆(1)筛选融合后，等到杂交瘤细胞群落长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始 检测，采用间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞，步骤如下①取杂交瘤细胞培养上清液为第一抗体，滴加在全血细胞血滴片上，37°C湿盒中 孵育45min ；②取出血滴片，用0. 01M磷酸盐缓冲液洗3次，5min/次；③洗完后，将异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠抗体，滴加在血滴片上，37°C湿 盒中避光孵育45min ；④取出血滴片，用0. 01M磷酸盐缓冲液洗3次，5min/次；⑤洗完后，避光干燥，甘油封片，在放大400倍的荧光显微镜下观察。将能使血滴片上的细胞呈现明亮的黄绿色荧光的阳性杂交瘤细胞群落记录，作进
一步克隆。(2)克隆采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞群落进行克隆，步骤如下①脱颈椎法处死小鼠，无菌取出胸腺后，在100目网筛上研磨，用RPMI-1640溶液 吹下形成单细胞悬液；②将胸腺细胞悬液lOOOrpm离心3min，细胞沉淀用RPMI-1640细胞培养基(含 10%的胎牛血清)重悬；③待克隆的阳性杂交瘤细胞孔用血球计数板计数，再用RPMI-1640细胞培养基以 10的整次倍稀释，取100个阳性杂交瘤细胞，加入含有胸腺细胞的RPMI-1640细胞培养基悬 液中；④细胞悬液用滴管吹打均勻，滴加到96孔培养板，使每孔平均含有一个阳性杂交瘤细胞，置于37°C，C02浓度为4. 5%的培养箱中培养；⑤1-2周后再将克隆过的培养板中的各孔杂交瘤培养上清液分别收集，与栉孔扇 贝全血细胞悬液反应，用间接免疫荧光法筛选抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体。结果筛选克隆得到1株抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体6H7 (图2)，该单克隆 抗体能与颗粒血细胞特异性结合，但却不与透明血细胞反应。4.冻存将能分泌单克隆抗体6H7的杂交瘤细胞转移到24孔培养板中培养，待其处于对数 生长期时，用滴管吹打均勻形成细胞悬液，取900 yl的细胞悬液与100 yl的冻存液(二甲 基亚砜)混勻，置于2ml冻存管中。将冻存管装入盛有棉花的小盒内，置于-80°C超低温冰 箱中，12h后，浸入液氮内长期保存。实施例3 流式免疫荧光法验证单克隆抗体6H7的特性1.取一干净的24孔培养板，选2孔，每孔加入细胞浓度为107cellS/ml的栉孔扇 贝全血细胞悬液1ml，继而分别加入1ml的单克隆抗体6H7和骨髓瘤培养上清液(阴性对 照)，37°C孵育lh，边孵育边吹勻；2.将培养孔中的细胞悬液转移至离心管中，4°C，760g，离心5min，细胞沉淀用抗 凝剂重悬、离心洗涤3次；3.将细胞悬液再转移至24孔培养板中，再往每孔中加入50 yl的异硫氰荧光素 (FITC)标记的羊抗鼠抗体，37°C避光孵育lh，边孵育边吹勻；4.将培养孔中的细胞悬液再次转移至离心管中，4°C，760g，离心5min，细胞沉淀 用抗凝剂重悬、离心洗涤3次；5.细胞悬液经200目筛绢网过滤后，经流式细胞仪检测。流式免疫荧光法检测结果如图3所示经流式检测的全血细胞悬液明显可分为两 群颗粒血细胞群和透明血细胞群。全血细胞悬液在阴性对照中，荧光值较低；而经单克隆 抗体6H7反应后，荧光值显著增加，阳性率高达86. 8%，其中颗粒血细胞群高达71. 8%，而 透明血细胞群仅为15. 0%，表明单克隆抗体6H7主要与颗粒血细胞群特异性结合。本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行 修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
一种抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为小鼠杂交瘤细胞株6H7，保藏号为CCTCC NOC201042，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年04月21日的杂交瘤细胞分泌的。
2.一种如权利要求1所述的抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制备方法，其特征在 于所述的方法包括如下步骤抽取栉孔扇贝血淋巴经离心得到全血细胞；经介质密度梯度 分离法得到栉孔扇贝颗粒血细胞；以颗粒血细胞为抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠 的脾细胞和骨髓瘤细胞；经间接免疫荧光法筛选、克隆、进一步筛选得到一株能分泌抗栉孔 扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞6H7 ；其分泌的抗体即为抗颗粒血细胞的单克隆 抗体。
3.根据权利要求2所述的抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制备方法，其特征在于 所述的介质密度梯度分离法是Percoll介质梯度离心法将栉孔扇贝全血细胞悬液置于不 连续Percoll梯度的顶层，离心，自上而下形成的第三层细胞即为颗粒血细胞。
4.根据权利要求2所述的抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制备方法，其特征在于 所述的间接免疫荧光法是将细胞融合后所得的杂交瘤细胞培养上清液与栉孔扇贝全血细 胞悬液或血滴片反应；继而加入异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠抗体；用荧光显微镜在 原位的暗视野与明视野下镜检，筛选抗颗粒血细胞的单克隆抗体，即单克隆抗体M17。
5.根据权利要求2所述的抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制备方法，其特征在于 所述的杂交瘤细胞6H7分泌的单克隆抗体经流式免疫荧光法验证其特性。
6.根据权利要求5所述的抗栉孔扇贝颗粒血细胞单克隆抗体的制备方法，其特征在于 所述的流式免疫荧光法是将单克隆抗体6H7与栉孔扇贝全血细胞悬液于培养板孔中反应； 继而加入异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠抗体；用流式细胞仪来检测验证单克隆抗体 6H7所抗的细胞群确为颗粒血细胞群。
全文摘要
本发明公开了一种抗栉孔扇贝颗粒血细胞的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为小鼠杂交瘤细胞株6H7，保藏号为CCTCC NOC201042，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年04月21日的杂交瘤细胞分泌的。长势良好的该杂交瘤细胞具有大小均一，外观饱满，浑圆透亮，分裂旺盛的特点，其在培养基中常规培养2-3天，培养基中即含有了大量纯度高、效价好、特异性强的单克隆抗体。经间接免疫荧光法和流式免疫荧光法检测，结果显示该单克隆抗体能与栉孔扇贝颗粒血细胞特异性结合。本发明可用于研究颗粒血细胞在扇贝胚胎发育中的发生、分化和分布，以及颗粒血细胞与其它类型血细胞免疫功能上的转换和差异。
文档编号C12N5/20GK101863979SQ20101019143
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者战文斌, 林听听, 绳秀珍, 婧 邢 申请人:中国海洋大学