专利名称：：栉孔扇贝g-型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法
技术领域：
：本发明属于水产生物
技术领域：
中的贝类分子标记辅助育种技术，是一种能在贝类抗病品种培育中应用的贝类抗病相关基因标记及其辅助育种方法。
背景技术：
：我国的扇贝养殖业在经过最初阶段的蓬勃发展以后，逐渐暴露出了许多亟待解决的问题。长期的近亲繁育、累代养殖导致了近交衰退，使得栉孔扇贝生长缓慢、抗逆性降低。再加上病害肆虐、环境恶化等因素，扇贝养殖业经常发生大规模死亡事件，造成巨大经济损失。因此，加快育种核心前沿技术的研究和抗逆优良品种的选育己成为保障扇贝养殖业持续发展的关键。但由于目前国内外对贝类抗病机理及抗病功能基因的研究较少，缺乏抗病相关的分子标记，导致贝类抗病品种培育的研究进展缓慢，很大程度上制约了扇贝养殖业稳定、健康和可持续发展。贝类机体免疫防御反应分为细胞免疫和体液免疫。参与体液免疫的因子很多，溶菌酶是其中十分重要的一员。溶菌酶是一类具有杀菌作用和免疫功能的效应分子，在机体的天然免疫中发挥重要作用(ChengandRodrick,1975)。自1999年报道了第一种贝类溶菌酶基因序列后，先后从冰岛扇贝、贻贝、美洲牡蛎和栉孔扇贝等贝类中获得了溶菌酶基因的全长序列。研究表明，溶菌酶具有广谱的抗菌效应，参与机体多种免疫反应，能改善和增强巨噬细胞的吞噬能力和消化功能(Biggaretal.,1977);并在溶菌过程中形成一个水解体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而实现机体的免疫防御(ChengandRodrick，1975;Chengetal.,1975)。研究还发现，溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用形成复合物，使侵入体内的病毒失活。此外，溶菌酶可诱导调节机体其它免疫因子的合成与分泌，协同其它免疫因子(抗菌肽等)进行免疫防御(Chalketal.，1994;Patrzykatetal.，2001)。对于缺少特异性免疫的无脊椎动物来说，溶菌酶是其免疫体系中非常重要的一个环节(Lee,2000;Sotelo-Mundo,2003);而对于水生无脊椎动物而言，由于其生存环境中富含各种各样的潜在病原，溶菌酶的免疫防御功能就显得尤为重要。目前研究表明，在鱼类、昆虫等多种物种中溶菌酶表达水平的升高与免疫力的增强密切相关(CaipangCM,2007;ChengAC,2008)，但其多态性与贝类抗病力强弱之间的关系研究仍未见报道。
发明内容-本发明的目的是筛选出栉孔扇贝抗病相关的G-型溶菌酶基因标记，建立相应的栉孔扇贝分子标记辅,助育种方法，为梓孔扇贝抗病品种培育提供基因标记和技术方法。本发明的技术内容为一、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记，包括1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆；2、抗病群体和敏感群体的制备；3、抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选；4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛査；二、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记辅助育种方法。一、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记，包括1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆；2、抗病群体和敏感群体的制备；3、抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选；4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛查。1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆参照分子克隆所述方法从栉孔扇贝闭壳肌中提取总DNA;根据已知的G-型溶菌酶基因序列在其启动子区设计引物，克隆得到一段762碱基的DNA序列，连入T载体后进行测序，获得其核苷酸序列。2、抗病群体和敏感群体的制备采用人工感染途径获得抗病群体和敏感群体；即从不同海区和养殖场收集扇贝个体之后，用病原菌浸泡感染，根据死亡时间判断对病原菌感染抵抗能力，将扇贝分为抗病群体和敏感群体。3、抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选对5个个体的IO个克隆进行了测序，发现了10处多态性位点；PCR扩增42个敏感个体和40个抗病个体的G-型溶菌酶启动区序列后，针对-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G转换分别选用TaqI和HapII对PCR产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，各发现两种基因型，-754II，-754ID，-391M和-391AG;其中-754ID和_754II个体在抗病群体和敏感群体中出现的频率无显著差异,而-391AA个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体，-391AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体。因此，-391AA被认为是疾病敏感相关的G-型溶菌酶基因标记，而-391AG被认为是抗病相关的G-型溶菌酶基因标记。4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛査取栉孔扇贝全血lu1作为模版，PCR扩增G-型溶菌酶基因启动区序列，用H印II对产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳分型后，参照图谱3-B选择-391AG个体作为抗病个体。二、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记辅助育种方法以在抗病群体中高频出现的G-型溶菌酶基因型作为抗病相关G-型溶菌酶基因标记。将携带这种抗病基因标记的栉孔扇贝进行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的G-型溶菌酶基因启动区序列，研究其多态性；同时进行病原微生物感染实验，研究抗病相关G-型溶菌酶基因标记的遗传规律及其与栉孔扇贝抗病力的关系，从中筛选出既含有抗病G-型溶菌酶基因标记，抗病力又显著提高的贝苗进行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品种。本发明与已有技术相比其特点为本发明采用功能基因组技术，以栉孔扇贝为材料首次发掘了我国养殖贝类抗病相关G-型溶菌酶基因标记，初步建立了栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记辅助育种技术，该技术具有操作简便快捷、选育效率高、周期短等特点，为贝类抗病品种的培育开辟了新的分子育种技术途径，对养殖贝类抗病品种的选育具有重要理论意义和应用价值。图l:栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列图2:栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区多态性位点图3:栉孔扇贝G-型溶菌酶基因不同基因型的酶切图谱图4:栉孔扇贝抗病群体及敏感群体中G-型溶菌酶不同基因型的分布频率以及相应的卡方检验具体实施例方式下面以栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选及其辅助育种技术的建立为例，对本发明的技术内容进行详细说明。一、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记，包括1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆；2、抗病群体和敏感群体的制备；3、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选；4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛査。1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆参照分子克隆所述方法从梓孔扇贝闭壳肌中提取总DNA;根据已知的G-型溶菌酶基因序列在启动区设计引物CFLyspl(5'-GCTGAGTAGACTGGAACAAGCGGMTGA-3')和CFLysp2(5'-MGACGAGTGAAGGCCGGGGAGTAGGT-3')，克隆得到一段762碱基的DNA序列，连入T载体后进行测序，获得其核苷酸序列(图l)。2、抗病群体和敏感群体的制备采用人工感染途径获得抗病群体和敏感群体；即从不同海区和养殖场收集扇贝个体，用鳗弧菌浸泡感染，根据死亡时间判断扇贝对鳗弧菌感染的抵抗能力，将扇贝分为抗病群体和敏感群体。3、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选对5个个体的10个克隆进行了测序，发现了10处多态性位点(图2);PCR扩增42个敏感个体和40个抗病个体的G-型溶菌酶启动区序列后，针对-754TATCTCGATCAGG插入/缺失及-391A/G分别选用TaqI和HapII对PCR产物进行酶切。对于-754插入型等位基因，TaqI酶切后会产生大小分别为36,37,43，80，147,419bp的6个片段，而对于-754缺失型等位基因则会产生大小分别为43，60,80，147,419bp的5个片段。用HapII酶切之后，-391A型等位基因产生长度为16,79，102，565bp的4个片段，而-391G型等位基因则产生长度为16,79,102，240,325bp的5个片段。酶切产物经鄉聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，在这两处位点各发现两种基因型，-754II，-754ID,-391AA和-391AG(图3)。抗病群体和敏感群体中不同基因型出现的频率见图4。经卡方检验分析后发现，-754ID和-75411个体在抗病群体和敏感群体中出现的频率无显著差异，而-391AA个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体，-391AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体(表l)。因此，-391M被认为是疾病敏感相关的G-型溶菌酶基因标记，而-391AG被认为是抗病相关的G-型溶菌酶基因标记。表1:梓孔扇贝G-型溶菌酶不同基因型在抗病群体和敏感群体中分布频率的卡方检验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛査:取栉孔扇贝全血1H1作为模版，以CFLyspl和CFLysp2为引物PCR扩增G-型溶菌酶启动区序列，用HapII对产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳分型后，参照图谱3-B选择-391AG个体作为抗病个体。二、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记辅助育种方法以在抗病群体中高频出现的G-型溶菌酶基因型-391AG作为抗病相关G-型溶菌酶基因标记。将携带这种抗病相关基因标记的栉孔扇贝进行繁殖，培育后代，克隆获得后代中的G-型溶菌酶基因，研究其多态性；同时进行病原微生物感染实验，研究抗病相关G-型溶菌酶基因标记的遗传规律及其与扇贝抗病力的关系，从中筛选出既含有抗病相关G-型溶菌酶基因标记，抗病力又提高的贝苗，进行多代繁殖和培育后即可建立抗病优良品种。序列表<110>中国科学院海洋研究所<120〉栉孔扇贝G-型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法<140>〈141〉2008-04-02<薩1〈170〉Patentlnversion3.2<210>1<211>762<212>腿<213>梓孔扇贝(Chlamysfarreri)〈400>1gctgagtagactggaacsagcggeiatgaagtstctcgatc3gggat8c33sacscagtgc60cttgccgtgactcgaacccggaactcttctgtcacatgcttagcgtcctaccattcgact120agcgcacattgagctagtcattttattgaaaatctgtcttaggtacataattaagttaag180tttatttctggatcaggactattaaaaaacagacctctataccagactccaataaataca240aaataaataataaagttctttgagtaccccttacattaatctgttttgggatgtttgtat300ctctatgtgcttctgcatatggatctgtacgtaactttttgttaggtttttaccactact360tgttttcatttacagctagttacgagttaaatgcatgctagtccgggcaaacaggagtta420ttccccctcgcaatatcaaacctcttttcatttaaattatgaagttaagttattgagatt480tattaacccctgtgatggttgaatEitgaaataaatatgaaat犯atgcatttgtcgaata540tcacattggcttatgtggaagttaaactaaattscgtatatattatcataatttcacgat600tatgc犯tgatttttgtgtttcctgacagtagtgaataatgaccggacacgt朋gcaatei660caattcgtgactgaccaaactcgaccttagtgtaaataattctaaatataaatatttatc720tgtctaagataagagacctactccccggccttcactcgtctt76权利要求1、一种栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记，其特征在于它的技术内容包括以下四个方面1)栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆；2)抗病群体和敏感群体的制备；3)抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选；4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查。1)栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆参照分子克隆所述方法从栉孔扇贝闭壳肌中提取总DNA；根据已知的G-型溶菌酶基因序列在其启动子区设计引物，克隆得到一段762个碱基的DNA序列，连入T载体后进行测序，获得其核苷酸序列。2)抗病群体和敏感群体的制备采用人工感染的方法获得抗病群体和敏感群体；即从不同海区和养殖场收集栉孔扇贝个体，用病原菌浸泡感染，根据死亡时间判断扇贝对病原菌感染抵抗能力，将扇贝分为抗病群体和敏感群体。3)抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选对来自5个个体的10个克隆进行了测序，发现了10处多态性位点；PCR扩增42个敏感个体和40个抗病个体的G-型溶菌酶启动区序列后，针对-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G转换分别选用TaqI和HapII对PCR产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，各发现两种基因型，-754II，-754ID，-391AA和-391AG；其中-754ID和-754II个体在抗病群体和敏感群体中出现的频率无显著差别，而-391AA个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体，-391AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体。因此，将-391AA作为疾病敏感相关的G-型溶菌酶基因标记，而将-391AG作为抗病相关的G-型溶菌酶基因标记。4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查取栉孔扇贝个体全血1μl作为模版，PCR扩增G-型溶菌酶基因启动区序列，用HapII对产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳分型后，选择-391AG个体作为抗病个体。2、一种G-型溶菌酶基因辅助育种方法，其特征为以在抗病群体中高频出现的G-型溶菌酶基因型作为抗病相关G-型溶菌酶基因标记；将携带这种抗病相关基因标记的栉孔扇贝进行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的G-型溶菌酶基因启动区序列，研究其多态性；同时进行病原微生物感染实验，研究抗病相关G-型溶菌酶基因标记的遗传规律及其与梓孔扇贝抗病力的关系，从中筛选出既带有抗病相关G-型溶菌酶基因标记，抗病力又显著提高的贝苗进行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品种。全文摘要本发明是一种栉孔扇贝G-型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法，属于水产生物
技术领域：
中的贝类分子标记辅助育种技术，其主要内容包括栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆，抗病和敏感群体的制备，抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选，抗病个体的快速筛查以及基因标记辅助育种技术的建立。本发明克隆了栉孔扇贝G-型溶菌酶基因的启动区序列，并筛选了其多态性位点。其中-391AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体，因此，以-391AG作为栉孔扇贝抗病相关的G-型溶菌酶基因标记，建立了抗病相关基因标记辅助育种方法。本发明具有针对性强、选育效率高、操作简便快捷等特点，适用于贝类抗病相关标记的筛选和抗病优良品种的选育。文档编号A01K67/00GK101255477SQ200810015048公开日2008年9月3日申请日期2008年4月2日优先权日2008年4月2日发明者宋林生,凌李,赵建民申请人:中国科学院海洋研究所