专利名称：栉孔扇贝两个微卫星标记cfeem003和cfeem007的快速检测方法
技术领域：
本发明属于栉孔扇贝DNA分子遗传标记技术，是一种快速检测栉孔扇贝两个微卫星位点CFEEMOO3和CFEEMOO7的方法。
背景技术：
在真核生物基因组中，存在着由1-6个碱基对组成的简单重复序列(SimpleSequence Repeats)，简称SSRs，又称之为微卫星DNA(Microsatellite DNA)。随着分子标记的发展，微卫星标记已经成为国际上主流的标记技术之一。微卫星标记有诸多优点，如随机分布在整个基因组中，多态性高；可通过PCR迅速扩增，需要的DNA样品量较少，并且重复性好；孟德尔式遗传，共显性标记。因此，微卫星标记在遗传图谱的构建、遗传多样性分析和种质鉴定等方面得到广泛的应用。
已有国内外学者在多种海洋和水产生物中筛选出多个微卫星标记。徐鹏等利用PCR法快速筛选了中国对虾含有微卫星的重组阳性克隆。Yue等从ESTs和利用构建富集文库的方式成功筛选了鲤鱼(Cyprinus carpio L.)的28个多态性标记。在扇贝的微卫星研究中，仅报道了从海湾扇贝和栉孔扇贝EST数据库中筛选成功的几个位点。Roberts等对29个海湾扇贝EST-SSRs设计引物扩增时发现，其中8个位点没有得到扩增产物或者特异性产物，13个位点没有多态性，筛选成功的位点仅有8个。李红蕾等搜索了栉孔扇贝6935条ESTs，发现42条序列含有微卫星，选取了其中的7条序列设计引物，其中仅有3对引物有望在以后的工作中加以应用。而栉孔扇贝基因组来源的微卫星标记以及微卫星标记在栉孔扇贝分子遗传学分析中的应用至今没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种栉孔扇贝微卫星标记的快速检测方法。主要利用建立的栉孔扇贝微卫星富集文库中含有微卫星的阳性克隆，在核心重复序列两端设计特异性引物进行PCR扩增，从而快速的检测栉孔扇贝每个个体在此微卫星区域的遗传变异，获得栉孔扇贝在该位点的多态性图谱，通过图谱直观、准确地检测出每个个体的基因型。
本发明是按照以下操作步骤完成的首先提取栉孔扇贝闭壳肌的基因组DNA并稀释备用；菌落原位杂交法筛选构建的栉孔扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆进行测序，在其微卫星核心重复序列两端设计特异性引物；使用该引物对栉孔扇贝不同地理群或者栉孔扇贝群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；用产物出现的条带进行分析，利用软件Quantity One准确快速地确定每个个体的基因型，并获得栉孔扇贝的遗传多态性图谱。
两个阳性克隆的序列为CFEEM003CAATGAGTGGGTAATACTCTACTCGATGGAAAAAGTGGAAGGTTGAAGCCCCCAACACAACACACACACACACACACACACGCTTGCTTACGACAGACATGCFEEM007AGTGTTTTATACAGAGGTTTTACGGTAAAAGACCATGACAACTGACACAAGTGCATTATACAGAGGTTTTACGGTACAAGATCATGTAGACATTCTCTGAGGATACGGGAGCAGTAGAAAAAACACACAACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTACCAGTTATGCCCAGACGCCGCGTACAATAAACAAAACATTGTTTAGCTGATAAGTTAGAAAAACGAAATACCATTCTGTCACAACAAATGTGCACGCAGACGTATTTATAACATAATCTGTATTTTACTTCTTACCCAAGATATAGCATGCACACTGTCTGCTTGCGAAAGAAAACAAAATGAGATTACTCAGAGGG其中两个微卫星重复的核心重复序列为CFEEM003(CA)2(AC)11；CFEEM007(TC)13。
两个位点的核心序列两端设计的特异性引物序列分别为CFEEM003正向引物5’-ATG AGT GGG TAA TAC TCT ACT CG-3’；CFEEMOO3反向引物5’-CAT GTC TGT CGT AAGCAA GC-3’，退火温度60℃。CFEEM007正向引物5’-TTC TCT GAG GAT ACG GGA GC-3’；CFEEM007反向引物5’-GTT TAT TGT ACG CGG CGT C-3’，退火温度60℃。
提取栉孔扇贝基因组DNA，将其稀释为20ng/μl，每个PCR反应体系中加入2μl，反应体系为20μl。
对栉孔扇贝不同地理群体或者栉孔扇贝个体的基因组DNA进行PCR扩增，其PCR反应条件为40ng栉孔扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶(Promega)。使用这两对引物时设置的PCR程序参数为95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准(pUC19/HaeIII)。电泳2-3小时后用溴化乙锭(浓度为0.15mg/mL)染色，凝胶成像系统上紫外成像并对电泳谱带进行分析。利用软件Quantity One对每个个体带进行快速准确的基因型确定。
应用上述方法，可以检测栉孔扇贝的每个个体在此微卫星区域的遗传变异情况。通过电泳图谱和Quantity One软件分析结果，能够准确、方便、快捷地判读出每个个体在上述两个位点的等位基因的大小以及每个个体的基因型。
具体实施例方式下面通过实施例详细叙述本发明。
首先提取栉孔扇贝的基因组DNA备用；然后用菌落原位杂交法筛选已构建的栉孔扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆测序，再在微卫星核心重复序列的两端设计引物；并使用该引物对栉孔扇贝不同群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，再用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用已有的软件Quantity One准确快速地确定每个个体的基因型，从而获得栉孔扇贝的遗传多态性图谱，准确地检测出每个个体的基因型，从而快速的检测栉孔扇贝每个个体在此微卫星位点的遗传变异。
1、栉孔扇贝基因组DNA的提取取扇贝闭壳肌约0.1克，加入500μlSTE裂解缓冲液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-Cl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl 10％的SDS，以及5μl 20mg/ml的蛋白酶K，56度处理，直到裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250μl)、氯仿/异戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μlNaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10分钟。将核酸沉淀于管底。70％7醇(1000μl)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发。加入100μl的无菌水和少量RNase A，4度直到DNA全部溶解。紫外分光光度计定量稀释成20ng/μl备用。
2、根据富集文库—菌落原位杂交的结果，阳性克隆测序，其序列为CFEEM003CAATGAGTGGGTAATACTCTACTCGATGGAAAAAGTGGAAGGTTGAAGCCCCCAACACAACACACACACACACACACACACGCTTGCTTACGACAGACATGCFEEM007AGTGTTTTATACAGAGGTTTTACGGTAAAAGACCATGACAACTGACACAAGTGCATTATACAGAGGTTTTACGGTACAAGATCATGTAGACATTCTCTGAGGATACGGGAGCAGTAGAAAAAACACACAACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTACCAGTTATGCCCAGACGCCGCGTACAATAAACAAAACATTGTTTAGCTGATAAGTTAGAAAAACGAAATACCATTCTGTCACAACAAATGTGCACGCAGACGTATTTATAACATAATCTGTATTTTACTTCTTACCCAAGATATAGCATGCACACTGTCTGCTTGCGAAAGAAAACAAAATGAGATTACTCAGAGGG3、微卫星引物的设计在栉孔扇贝微卫星富集文库基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。由于微卫星核心重复序列重复次数不同，使扩增产物产生了长度的变化而呈现多态性，这是检测微卫星位点的多态性的根源所在。引物设计采用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物设计采用以下严谨度(1)引物长度为19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度大于50度；(4)预期PCR产物长度为100-250bp。根据测序结果，两个位点的特异性PCR引物序列为CFEEM003正向引物5’-ATG AGT GGG TAA TAC TCT ACT CG-3’；CFEEM003反向引物5’-CAT GTCTGT CGT AAG CAA GC-3’，退火温度60℃。CFEEM007正向引物5’-TTC TCT GAG GAT ACGGGA GC-3’；CFEEM007反向引物5’-GTT TAT TGT ACG CGG CGT C-3’，退火温度60℃。
4、PCR扩增PCR反应体系的组成为40ng栉孔扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反应为30个循环，每个循环包括95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
5、PCR产物的检测PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准(pUC19/HaeIII)。电泳完毕后用溴化乙锭(浓度为0.15mg/mL)染色，紫外观察成像并对电泳谱带进行分析。
综上所述，本发明具有以下特点微卫星标记的核心是根据微卫星重复两端的侧翼序列设计特异性引物，因此本发明的核心是特异性PCR引物；本发明可以准确、方便、快捷地判读出栉孔扇贝PYMSE005位点的每个等位基因的大小以及每个个体的基因型。操作简单，方法简便，结果稳定直观；本发明主要应用于栉孔扇贝遗传图谱的构建、不同地理群体遗传多样性分析和种质鉴定等方面的研究。
权利要求
1.一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法，其特征在于首先提取栉孔扇贝闭壳肌的基因组DNA稀释备用；然后菌落原位杂交法筛选已构建的栉孔扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆进行测序，在其微卫星核心重复序列两端设计特异性引物；接着使用该引物对栉孔扇贝不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；最后利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，即获得栉孔扇贝的遗传多态性图谱。
2.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法，其特征在于两个阳性克隆的序列为CFEEM003CAATGAGTGGGTAATACTCTACTCGATGGAAAAAGTGGAGGGGGGGGGGGGAGGTTGAAGCCCCCAACACAACACACACACACACACACACACGCTTGCTTACGACAGACATGCFEEM007AGTGTTTTATACAGAGGTTTTACGGTAAAAGACCATGACAACTGACACAAGTGCATTATACAGAGGTTTTACGGTACAAGATCATGTAGACATTCTCTGAGGATACGGGAGCAGTAGAAAAAACACACAACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTACCAGTTATGCCCAGACGCCGCGTACAATAAACAAAACATTGTTTAGCTGATAAGTTAGAAAAACGAAATACCATTCTGTCACAACAAATGTGCACGCAGACGTATTTATAACATAATCTGTATTTTACTTCTTACCCAAGATATAGCATGCACACTGTCTGCTTGCGAAAGAAAACAAAATGAGATTACTCAGAGGG
3.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法，其特征在于两个微卫星重复的核心重复序列分别为CFEEM003(CA)2(AC)11；CFEEM007(TC)13。
4.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法，其特征在于在其心序列两端设计的特异性引物序列分别为CFEEM003正向引物5’-ATG AGT GGG TAA TAC TCT ACTCG-3’；CFEEM003反向引物5’-CAT GTC TGT CGT AAG CAA GC-3’，退火温度60℃。CFEEM007正向引物5’-TTC TCT GAG GAT ACG GGA GC-3’；CFEEM007反向引物5’-GTT TAT TGT ACG CGG CGT C-3’，退火温度60℃。
5.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法，其特征在于提取栉孔扇贝的基因组DNA，将其稀释为20ng/μl，每个PCR反应体系中加入2μl，反应体系为20μl。
6.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法，其特征在于对栉孔扇贝不同地理群体或者栉孔扇贝个体的基因组DNA进行的PCR扩增，其PCR反应条件为40ng栉孔扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶；使用这两对引物时设置的PCR程序参数为95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
7.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法，其特征在于PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准——pUC19/HaeIII；电泳2-3小时后用浓度为0.15mg/mL的溴化乙锭染色，凝胶成像系统上紫外成像并对电泳谱带进行分析；最后利用软件Quantity One确定每个个体在上述两个位点的等位基因的大小以及每个个体的基因型。
全文摘要
一种栉孔扇贝两个微卫星标记CFEEM003和CFEEM007的快速检测方法。首先提取栉孔扇贝的基因组DNA备用；然后用菌落原位杂交法筛选已构建的栉孔扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆测序，再在微卫星核心重复序列的两端设计引物；并使用该引物对栉孔扇贝不同群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，再用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用已有软件准确快速地确定每个个体的基因型，获得栉孔扇贝的遗传多态性图谱。本发明应用于栉孔扇贝遗传图谱的构建、不同群体或养殖群体的遗传多样性分析和种质鉴定等方面的研究。能够准确、方便、快捷地判读出每个等位基因的大小和每个个体的基因型。
文档编号C12Q1/68GK1793382SQ20051004479
公开日2006年6月28日 申请日期2005年9月23日 优先权日2005年9月23日
发明者包振民, 胡景杰, 汪小龙, 战爱斌, 惠敏 申请人:中国海洋大学