专利名称：肽聚糖免疫增强剂及其生产方法
技术领域：
本发明涉及产业化生产养殖鱼虾饲料添加剂技术的改进，具体讲是一种肽聚糖免疫增强剂及其生产方法。本发明利用微生物发酵技术，产业化生产鱼虾饲料用多糖类免疫增强剂。
背景技术：
在当前的水产养殖中，普遍存在过度追求产量、忽视质量的现象。结果导致养殖密度过大，水质污染加重，从而造成病害时常发生，特别是近几年来，水产养殖动物中病毒病大规模暴发，给水产养殖业造成了巨大损失。因此，控制疾病的发生对水产养殖业可持续发展具有重要意义。在水产病害防治领域中，传统上是采用抗生素来预防和控制病害的发生。这样的传统做法存在诸多弊端，如滥用抗生素而造成抗生素污染，进而使病害生物产生抗药性，或者由于滥用药物，而造成药物残留超标等负面效应。单纯靠抗生素药物对防治病毒病是根本没有效果的。再众所周知，接种疫苗是水产养殖中预防疾病的有效措施，可是由于免疫反应具有特异性，一种疫苗只能特异性地预防相应的某种疾病，而且由于现阶段疫苗的制备及其在实际生产中的广泛应用仍存在着困难。
有一种肽聚糖广泛存在于部分革兰氏阴性菌和大部分革兰氏阳性菌细胞壁中，其是由聚糖链、肽亚单位和间肽桥组成的大分子聚合物。例如，双歧杆菌细胞壁肽聚糖含量约为细胞壁干重的50-80％，这种肽聚糖能对鱼类和对虾免疫系统产生免疫调节作用。低剂量肽聚糖的多种有益的生物学功能越来越引起人们的重视，特别是其免疫调节功能逐渐被人们所利用。由于自然界中菌种的多样性，组成其细胞壁的肽聚糖的结构也不尽相同，也决定了提取的肽聚糖的活性的差异较大，同样，不同的菌种单位发酵液中细菌产量高低也不尽相同。鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的生产目前仅限于实验室小规模生产，其成本高，产品批次之间质量相差较大，而且整体质量不稳定。在水产养殖中，有关免疫激活剂的研究与应用，在国际上目前都还处在初始阶段，许多技术不成熟，且缺乏有效的技术指标来评价其应用的效果。
发明内容
本发明的目的就是要应用发酵工艺、酶工程等生物技术，进行鱼虾肽聚糖免疫增强的产业化生产，可以实现减少污染、提高效率、降低成本、提高质量，利于肽聚糖制剂进一步在养殖生产中的广泛利用，提供一种成本更低的产业化生产鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的技术。
本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种肽聚糖免疫增强剂。所述的免疫增强剂具有如下的物化参数，色泽为淡褐色的液体，粘度3.2-5.0，比重1.021-1.042；该免疫增强剂按W/V比含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量8-10％；其余为水。
一种所述肽聚糖免疫增强剂的生产方法，所述的生产方法按如下步骤进行经培养菌种接种一级种子培养——二级种子罐厌氧培养；当种子液OD450＝1.2时，即每毫升种子液的细菌数量在1.1-1.4×108个时，即可接种于初始发酵罐，并在发酵过程中每间隔2小时通入适量氮气；在菌体生长至以756UV-VIS分光光度计于450nm处测量菌液OD值在1.0-1.4时终止发酵；以此发酵液为种子液接种于n个发酵罐，其每罐接种量为5-12.5％；继续培养，当以756UV-VIS分光光度计于450nm处测量发酵液OD值在1.0-1.4时终止发酵，此发酵液为目的发酵液；再经离心分离取菌体，再转至后处理罐中，加入消化缓冲液进行菌体后处理将该后处理罐中的后处理液加热加压至0.07KPa/106℃灭菌20min，再加入溶菌酶在37℃下消化24小时；当溶菌酶消化完成后，向该后处理罐内加入半胱氨酸至终浓度为5.5mmol/L，并补充EDTA至其终浓度为1.1mmol/L，之后加入木瓜蛋白酶，并在65℃下消化24小时；最终获得主要含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量为8-10％的液体肽聚糖制剂。
所述的消化缓冲液，其为含有0.1mmol/L EDTA、pH6.2的磷酸盐缓冲液；该消化缓冲液的投料比是以其体积与分离收集的湿菌重量的比为2——3∶1加入到分离收集的湿菌体中的。
所述的溶菌酶，其是以每升后处理液加入1-5克的投料比加入溶菌酶。
所述的木瓜蛋白酶，其是以每升该处理液加入5-10克的投料比加入木瓜蛋白酶。
所述的培养菌种，其是双歧杆菌选自嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)，或分叉双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，或青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolesentis)，或婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
本发明的优点，比照现有技术其是可以连续发酵。在第1个发酵罐发酵完成后，向罐内通入氮气将发酵液压至其它n个已注入发酵液并灭菌处理的发酵罐连续发酵，用于提高发酵产量。根据实际生产需要确定双歧杆菌的产量，通常以双歧杆菌湿菌重量为添加量参照指标。当发酵产量达到需要量时，终止发酵。将发酵液逐步注入储液罐，连续流离心机分离菌体。在本发明的技术中，在双歧杆菌发酵完成后，直接进行菌体后处理。首先将与发酵液分离的菌体移入发酵罐，加入消化缓冲液，菌体与消化缓冲液的比值是1∶2-3(W/V)，消化缓冲液为包含EDTA的pH6.2的磷酸盐缓冲液。本发明中菌体的处理分为两步进行，一是溶菌酶消化，二是蛋白酶消化，最终获得主要含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量为8-10％的液体肽聚糖制剂。就鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的通常用途而言，液体制剂具有效果好、使用方便的优点。
本发明与现有实验室小型发酵技术相比，本发明的鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的产业化生产技术具有连续生产、产量高、生产成本低的优点。如果采用小型发酵罐实验室发酵，酸沉降和离心相结合收集菌体，多步酶消化法制备肽聚糖粗制物，每1升发酵液平均可获得4g肽聚糖制剂。使用本技术每吨发酵液的平均发酵产量为8kg，即每1升发酵液可获得8g肽聚糖制剂。这不仅是体现在单位产量和单位物质成本的差别，而且最大的差别还是体现在生产量上的差别和由于菌体细胞壁中脂磷壁酸，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰胞壁酸等其它成分，如分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，也可对对虾和贝类免疫系统产生一定的免疫调节作用和鱼类，对虾和贝类的营养成分。以生产200吨对虾肽聚糖饲料为例，200吨免疫饲料需肽聚糖制剂40公斤(以湿菌重量计)。采用本发明技术，从种子液培养到最终菌体处理完成需要一周的时间既可生产40公斤肽聚糖制剂。如果在实验室发酵以17升PVC发酵罐生产，以日生产量2罐计算，不间断生产需要将近一年的时间！使用本发明肽聚糖制剂的免疫增强剂可以弥补化学药物和疫苗的不足，它比化学药物安全性高，比疫苗应用范围广，另外本发明肽聚糖制剂的免疫增强剂和疫苗的混合使用也能增强疫苗的疗效。本发明肽聚糖制剂的免疫增强剂的功能是多方面的，在甲壳动物中，可活化血淋巴中的吞噬细胞，提高吞噬病原菌能力；刺激血淋巴中抗菌、溶菌活力的产生或升高；激活酚氧酶原系统产生识别信号及介导吞噬等；在鱼类中，可激活嗜中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬作用；激活淋巴细胞产生或分泌淋巴因子以协调体液免疫和细胞免疫；刺激抗体的产生和补体的生成等。使用免疫增强剂不但可以提高养殖鱼虾生产性能和防治疾病的作用，而且具有无污染，无抗药性和无残留等优点。
具体实施例方式
在本发明的技术中，使用的发酵装置为通用型发酵设备，主要设备条件包括蒸汽锅炉，0.25-6吨发酵罐n+1个，及其锅炉与发酵连接的管道，压力表，温度表，连续流离心机等。补充氮气罐，用来平衡发酵罐内外压力并维持厌氧条件。
在本发明的技术中，发酵罐和管道的清洗和灭菌后，首先经培养菌种接种一级种子培养——二级种子罐厌氧培养；当种子液OD450＝1.2时，即每毫升种子液的细菌数量在1.1-1.4×108个时，即可接种于初始发酵罐。当发酵罐内压力降至0.02KPa开始向罐内通氮气，以维持正压；发酵罐内温度降至37℃时，开始接种种子液，接种量控制在5-12.5％；发酵温度为35-37℃，发酵过程中每2-4小时搅拌1次，并通适量氮气。并在发酵过程中每间隔2小时通入适量氮气；在向第1个发酵罐(0.25吨)内注入混匀的发酵液，并尽量增加发酵液体积，仅留少许空间；之后发酵液加热加压灭菌，并关闭所有空气开关，在空气过滤器的进气端直接接入氮气管；在菌体生长至以756UV-VIS分光光度计于450nm处测量菌液OD值在1.0-1.4时终止发酵；此发酵液为目的发酵液；再经离心分离取菌体，再转至后处理罐中，加入消化缓冲液进行菌体后处理将该后处理罐中的后处理液加热加压至0.07KPa/106℃灭菌20min，再加入溶菌酶在37℃下消化24小时；当溶菌酶消化完成后，向该后处理罐内加入半胱氨酸至终浓度为5.5mmol/L，并补充EDTA至其终浓度为1.1mmol/L，之后加入木瓜蛋白酶，并在65℃下消化24小时，最终获得具有优良物化参数的免疫增强剂。本发明的免疫增强剂的物化参数所采用的相对分子量的测定方法为高效凝胶渗透色谱法，脂肪的测定方法参照GB/T5009.6-2003，核糖核酸的测定方法为蛋白酶消化、CTAB孵育、酚/氯仿/异戊醇抽提法，总固形物含量的测定方法参照GB/T5009.3-2003。
具体实施例如下实施例1对虾苗种培育用肽聚糖制剂的生产及使用效果
在本发明实施例中，采用的主要设备条件是250升发酵罐，总体积250升，工作体积240升。所用的发酵液成分包含1％葡萄糖，1％乳糖，1％胰蛋白胨，0.6％酵母膏，0.6％牛肉膏，0.1％吐温-80，1％Na2HPO4，0.6％KH2PO4和0.05％MgSO4，pH 6.5。
取-70℃低温保存的嗜热双歧杆菌冻干粉1支，其是双歧杆菌选自嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)，或分叉双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，或青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolesentis)，或婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。经斜面培养基活化后，挑选单菌落接种于液体培养基，37℃培养24小时后进行扩大培养形成种子液，当种子液细菌浓度达到1×108个细菌/ml(OD590＝1.2)即可接种于发酵罐。在发酵过程中定时取样，使用756UV-VIS分光光度计于450nm处测量培养菌液OD值，获得双歧杆菌生长曲线。测定结果显示双歧杆菌于接种后15h开始进入指数生长期，并于21h后进入平台期。发酵24小时后，停止发酵，将发酵液逐步注入储液罐，连续流离心机分离菌体，离心速度16000rpm，流速100L/H。将与发酵液分离的菌体移入发酵罐，加入消化缓冲液，菌体与消化缓冲液的比值是1∶2或1∶3(W/V)，消化缓冲液为包含0.1mmol/L EDTA的pH6.2的磷酸盐缓冲液；加热加压至0.07KPa/106℃灭菌20min；每升加入溶菌酶5g，37℃消化24小时。溶菌酶消化完成后，向罐内加入半胱氨酸至终浓度为5.5mmol/L，并补充EDTA至终浓度为1.1mmol/L，加入木瓜蛋白酶至每升5g，65℃消化24小时。获得具有如下物化参数的免疫增强剂色泽为淡褐色的液体，粘度3.2，比重1.042；该免疫增强剂按W/V比含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5％，脂肪0.3％，核糖核酸0.01％，总固形物含量10％；其余为水；约2000g(以湿菌重量计算)，-20℃冻存。
凡纳对虾苗种培育池3个，育苗有效水体50立方米，同天布卵，密度为每立方米20万粒。自蚤状幼体I期1#池每日投喂的幼体饵料中添加了0.01％的上述肽聚糖制剂，2#池按每立方米0.2g在水体中泼洒上述肽聚糖制剂，3#池每日投喂普通饵料。日常管理见对虾育苗操作规程。分别在Z1期、M1期及PL1期计数幼体存活尾数，计算Z1-M1期、Z1-PL1期及M1-PL1期幼体成活率。结果显示与对照池相比，在幼体的两个发育阶段(Z1-M1期和M1-PL1期)及整个幼体发育阶段(Z1-PL1)，肽聚糖制剂经浸浴和口服两种作用方式均能提高幼体的成活率。生产统计数据见表1。
表1肽聚糖制剂应用于凡纳对虾育苗生产的统计数据(成活率％)
实施例2大菱鲆室内水泥池养殖用肽聚糖免疫增强剂的生产和应用效果采用与实施例1基本相同的步骤进行本实施例，不同的是发酵24小时后终止发酵，向罐内通入氮气，将发酵液压至2个体积为1000升的二级发酵罐，每罐接种量为12.5％，进行二次发酵。最终获得具有如下物化参数的免疫增强剂色泽为淡褐色的液体，粘度4.2，比重1.030；该免疫增强剂按W/V比含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.8％，分子量小于20KD的蛋白质6％，脂肪0.4％，核糖核酸0.015％，总固形物含量9％；其余为水；约16kg(以湿菌重量计算)，-20℃冻存。
选用黄海水产研究所生产的“海力”牌海水养殖鱼用配合饲料(粉料)为原料，新鲜小杂鱼制成鱼糜作为粘合剂(鱼糜添加量为40％)。将上述肽聚糖制剂加入原料及鱼糜的混合物中充分混匀，浓度为0.1％，用小型制粒机制成直径为7mm的湿颗粒饵料，于-18℃冻存，饲喂前将其解冻。
大菱鲆工厂化养殖池4个，养殖有效水体30立方米，放苗时单位体重45克，密度300尾/立方米。2个鱼池每日投喂添加了0.1％上述肽聚糖制剂的免疫饲料，2个鱼池每日投喂普通饲料。日常管理见大菱鲆养殖技术规范。分别在使用免疫饲料的1个月、2个月和3个月测定其血液的白细胞总数和白细胞吞噬率，测定其血清的溶菌酶活性和补体活性，测量增重率，统计成活率。结果显示与对照池相比，肽聚糖制剂经口服可提高大菱鲆免疫能力、增重率和成活率(表2)。
表2饲料中添加肽聚糖制剂大菱鲆血液免疫指标及生长的变化
实施例3凡纳对虾养殖生产用肽聚糖制剂的生产和应用效果采用与实施例1基本相同的步骤进行本实施例，不同的是第1个发酵罐发酵的同时，向另外1个5吨发酵罐内注入混匀的发酵液，加热加压至0.07KPa/106℃灭菌20min；关闭所有空气开关，在空气过滤器的进气端直接接入氮气管；当发酵罐内压力降至0.02KPa开始向罐内通氮气，以维持正压；发酵罐内温度降至37℃时即可接入第1个发酵罐内已发酵完成的发酵液；接种后的培养条件，菌体分离和消化同实施例1，最终获得具有如下物化参数色泽为淡褐色的液体，粘度5.0，比重1.042；该免疫增强剂按W/V比含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5％，分子量小于20KD的蛋白质5％，脂肪0.3％，核糖核酸0.02％，总固形物含量8％；其余为水的液态免疫增强剂。该免疫增强剂消化结束后，向发酵罐内注入20％(w/w)已灭菌处理的大豆渣为载体，一并注入干燥机，喷雾干燥前浓度25％，进风与出风温度分别在195℃和85℃，烘干后收集获得以小分子蛋白和低聚肽聚糖为主要活性成分的固体肽聚糖制剂约40kg(以湿菌重量计算)，4℃保存。
在对虾基础饲料中添加0.02％上述肽聚糖制剂，粉碎混匀后制成颗粒免疫饲料。
凡纳对虾高位养殖池22个，养殖面积0.33-0.67公顷不等，放苗40-80万尾不等，养殖周期80-120d，养殖虾达到上市规格(100-130尾/Kg)开始捕大留小分批上市。从放苗开始投喂免疫饲料，7天一个循环，其中4天连续投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料。(表3，表4)。
表3全程使用免疫饲料养殖池的统计数据 表4未使用免疫饲料养殖池的统计数据
结果到养殖期术，对虾平均成活率为78.32％，1/15公顷产量为509Kg。比其它全程投喂基础饲料的养殖池对虾平均成活率57.44，提高20.88％，产量提高19.25％，经济效益显著。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
1.一种肽聚糖免疫增强剂，其特征在于所述的免疫增强剂具有如下的物化参数，色泽为淡褐色的液体，粘度3.2-5.0，比重1.021-1.042；该免疫增强剂按W/V比含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量8-10％；其余为水。
2.一种按照权利要求1所述肽聚糖免疫增强剂的生产方法，所述的生产方法按如下步骤进行经培养菌种接种一级种子培养——二级种子罐厌氧培养；其特征在于当种子液OD450＝1.2时，即每毫升种子液的细菌数量在1.1-1.4×108个时，即可接种于初始发酵罐，并在发酵过程中每间隔2小时通入适量氮气；在菌体生长至以756UV-VIS分光光度计于450nm处测量菌液OD值在1.0-1.4时终止发酵；以此发酵液为种子液接种于n个发酵罐，其每罐接种量为5-12.5％；继续培养，当以756UV-VIS分光光度计于450nm处测量发酵液OD值在1.0-1.4时终止发酵，此发酵液为目的发酵液；再经离心分离取菌体，再转至后处理罐中，加入消化缓冲液进行菌体后处理将该后处理罐中的后处理液加热加压至0.07KPa/106℃灭菌20min，再加入溶菌酶在37℃下消化24小时；当溶菌酶消化完成后，向该后处理罐内加入半胱氨酸至终浓度为5.5mmol/L，并补充EDTA至其终浓度为1.1mmol/L，之后加入木瓜蛋白酶，并在65℃下消化24小时；最终获得主要含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量为8-10％的液体肽聚糖制剂。
3.根据权利要求2所述肽聚糖免疫增强剂的生产方法，其特征在于所述的消化缓冲液，其为含有0.1mmol/L EDTA、pH6.2的磷酸盐缓冲液；该消化缓冲液的投料比是以其体积与分离收集的湿菌重量的比为2-3∶1加入到分离收集的湿菌体中的。
4.根据权利要求2所述肽聚糖免疫增强剂的生产方法，其特征在于所述的溶菌酶，其是以每升后处理液加入1-5克的投料比加入溶菌酶。
5.根据权利要求2所述肽聚糖免疫增强剂的生产方法，其特征在于所述的木瓜蛋白酶，其是以每升该处理液加入5-10克的投料比加入木瓜蛋白酶。
6.根据权利要求2所述肽聚糖免疫增强剂的生产方法，其特征在于所述的培养菌种，其是双歧杆菌选自嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)，或分叉双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，或青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolesentis)，或婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
全文摘要
本发明是一种肽聚糖免疫增强剂。其色泽为淡褐色，粘度3.2－5.0，比重1.021－1.042；其含1.5－2.0％的活性成分肽聚糖，5－8％的蛋白质，0.3－0.5％的脂肪，0.01－0.02％的核糖核酸，8－10％的总固形物，其余为水。该免疫增强剂的生产方法如下经培养菌种接种一级种子培养—二级种子罐厌氧培养；即可接种于初始发酵罐，并在发酵过程中每间隔2小时通入适量氮气；在菌液OD值1.0－1.4时终止发酵；再接种于n个发酵罐，继续培养，当发酵液OD值在1.0－1.4时，以此发酵液为目的发酵液；再经分离取菌体，再转至后处理罐，加入消化缓冲液行菌体后处理，再加入溶菌酶消化处理，再加入半胱氨酸并补充EDTA处理，之后加入木瓜蛋白酶消化处理；最终获得上述组分的液体肽聚糖制剂。
文档编号C12P1/00GK1739790SQ20051004464
公开日2006年3月1日 申请日期2005年8月31日 优先权日2005年8月31日
发明者宋晓玲, 王秀华, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所