专利名称：栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因及其 部分序列体外重组表达技术，具体地说是从栉孔扇贝cDNA文库中克隆出栉孔扇贝丝氨酸蛋 白酶抑制剂CfKZSPI的全长cDNA序列，并对其编码的一个Kazal结构域进行了原核重组表 达；还涉及到该重组产物对胰蛋白酶的抑制活性，以及作为多种蛋白酶的抑制剂在人类相关 疾病的治疗及词料添加剂生产中的潜在应用价值。
背景技术：
无脊椎动物天然免疫一般经过三个步骤 一是非己的识别，二是信号的调整和放大，三 是产生各种目的基因的转录以激活细胞和效应物反应系统来杀死和清除病原体。丝氨酸蛋白 酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂是信号调整和放大的载体，在无脊椎动物的天然免疫中起着核心作 用。丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂的协同作用不但直接调控免疫信号转导和级联放大， 还可激活无脊椎动物的一些其它免疫防御体系，如黑化反应、血液凝结等。扇贝养殖是我国海水养殖和沿海地区经济发展的支柱性产业，但从1994年以来，养殖贝 类开始出现大规模死亡现象，经济损失十分惨重。养殖贝类病害的不断爆发及病因的多样性 迫切要求从扇贝自身的免疫防御机制入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。鉴于丝 氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂在无脊椎动物的天然免疫中起的核心作用，对其研究将有 助于阐明扇贝免疫级联反应的机制，为扇贝天然免疫机理的阐明奠定基础，从而服务于我国 的扇贝养殖产业。同时，丝氨酸蛋白酶抑制剂在医学上也具有很好的利用价值。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑 制剂具有较强的抑制丝氨酸蛋白酶的功能，如从药用水蛭中发现的胰蛋白酶抑制齐ljhimdin， 及从昆虫Rhodnius prolixus中发现的包括两个Kazal型结构域的凝血酶抑制剂rhodniin，都具有 较强的抑制凝血酶的功能。水蛭来源的胰蛋白酶抑制剂LDTI，能够抑制HIV-1的复制，可以 用于艾滋病的防治。从人体中发现的具有15个Kazal结构域的LEKTI基因变异将导致Netherton 综合症的发生，患者患有先天性鱼鳞癣，头发干燥，免疫缺陷，IgE升高，精神萎靡。近几年 的研究还发现，人体内Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的减少与胰腺癌、胃癌及肺癌等疾病的发 生密切相关。因此，从招孔扇贝中克隆出Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，并对其重组表达 蛋白的抑制活性进行深入研究，将有助于开发天然的海洋药物用于人类疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的是从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，为进一步研究栉孔扇贝 防御机制提供基础，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发医药产品和饲料 添加剂奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为-一种栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因，具有序列表SEQ IDNo.l中碱基序列。 其是从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA序列，该序列全长1788bp， 包括1527bp的开放阅读框，编码509个氮基酸，5'非编码区长97bp， 3，非编码区长164bp， 有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在栉孔扇贝免疫防御方面发挥着重要作用。 利用pET-32a(十)表达载体在大肠杆菌Rosetta-gami表达菌株中重组表达了该蛋白的 一个Kazal 结构域，表达产物对胰蛋白酶具有明显的抑制活性。当重组蛋白与胰蛋白酶以分子摩尔比为 1: 1比例混合时，接近卯％的胰蛋白酶活性被抑制。其编码蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，分子量为52961.68 Da，等电点为7.02， 其中编码序列的l一22位为信号肽序列，成熟肽分子量为50647.78Da,等电点为7.30，具有 12个典型的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域。每个结构域都能形成3对二硫键， 一个 a-螺旋结构和3个p-折叠结构。
本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从栉孔扇贝 中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码C一 末端Kazal型结构域的基因片断并将其克隆到pET32a表达载体中，在大肠杆菌Rosetta-gami 中实现了原核体外重组表达。重组产物经His-tag融合蛋白纯化试剂盒MagExtractor His-Tag NPK-700(TOYOBO公司)纯化和透析复性后，对胰蛋白酶具有明显的抑制活性。当重组蛋白 与胰蛋白酶以分子摩尔比为1: 1比例混合时，接近90%的胰蛋白酶活性被抑制。本发明可为 进一步研究栉孔扇贝免疫防御机制提供基础，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育奠定 基础，同时为进一步开发医药产品提供了更多的选择。本发明利用构建的栉孔扇贝cDNA文库，采用RACE技术及体外重组表达技术，对栉孔 扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI进行了研究，从梓孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂 CfKZSPI的cDNA序列，该基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重组技术表达了具有 较强蛋白酶抑制活性的重组蛋白。
图示为本发明柞孔扇贝Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂一个结构域的重组蛋白rCfKZSPI对#g、 insulin lmg 、氢化可酸松100ug、霍乱毒素10ug、转铁蛋白lmg、亚硒 酸钠lug、 GCLCM 10ml、青霉素5X103111 、链霉素5X103 IU。 试验例1本发明无血清培养基效果试验下面部分大写字母所代表的意思MTT (噻唑兰)、SDS(十二烷基磺酸钠)、 细胞OD值(细胞光密度值)、PCM(增殖细胞核抗原)、ABCG2 (the ATP-binding cassette transporter) 、 Cx43(连接因子43)、 CK3 (细胞角蛋白3) 、 CK12 (细胞 角蛋白12)。首先，比较了角膜缘干细胞在有血清培养基和无血清培养基中的增殖活性。 将lml原代角膜缘干细胞悬液，以每孔5.0乂103细胞数接种于96孔培养板，再 分别加入有血清培养基和无血清培养基，每组24孔，标准条件下培养并于倒置 相差显微镜下观察细胞的形态和生长情况。培养24h后，每天各组取3孔，加 入MTT液(50 mg MTT溶于IO mlPH7. 2的PBS中，过滤除菌)，37。C孵育6 h， 然后吸出100 W液体，再加100 W甲月赞溶解剂十SDS十二烷基磺酸钠液SDS10 g溶解于100 ml的四蒸水中，用10 mol/L HQ调至为0. 01 mol/L的HC1 ) 37 。C过夜，在酶标仪(型号Elx800UV)上测OD值(双波450 nm、 490 nm),持 续8d，纵坐标为每天所测OD值的平均值，横坐标为天数，绘制细胞生长曲线， 对各组OD值进行差异显著性检验。结果表明，在两种培养基中所测平均细胞光 密度值无显著差异(P>0.05)，在两种培养基中细胞均保持很强的增殖能力， 细胞在两种培养基中的生长趋势保持一致(图1)，在两种培养基中细胞均保持 很强的增殖能力，细胞在两种培养基中的增殖能力没有显著差异。再者，将角膜缘干细胞接种在无血清条件培养基中，4-5天后角膜缘干细 胞呈铺路石样生长，这些细胞体积小，胞体透亮，折光性强，核质比高(图2)。
据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach .程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13 (准确率大 于95%)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体的操作参照《基因表达序列标 签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。4. 栉孔扇贝EST序列的同源性分析及丝氨酸蛋白酶抑制剂基因片段的筛选将获得的全 部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons,分别将所获的Contigs 与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，具体的操作参照《基因表达 序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。根据相似 性分析结果寻找出与丝氨酸蛋白酶抑制剂基因同源的EST序列。5. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长序列的克隆根据与丝氨酸蛋白酶抑制 剂基因同源的EST序列设计基因特异性引物F1(ATGTGGCTGTTGCATGTAATGG) 禾口 R1(ATGGTAATTGCCCTTGTAGA)，分别利用载体通用引物 T3(AATTAACCCTCACTAAAGGG) 、 T7 (GTAATACGACTCACTATAGGGC)进行3' 和5'末端的扩增，PCR产物用1.0%琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(大连'i 生物工程有限公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物 工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年) 的方法转化大肠杆菌XLl-blue，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)、 RV-M (GAGCGGATAACAATTTCACAC AGG)进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定，测得的序列经CLUSTER 分析拼接后得到全长序列。 3'端PCR PCR扩增所用体系以及反应条件 25 nl反应体系 2.5 nl 10 x PCR buffer1 nl MgCl2 (2.5 mM)2 pi dNTP (2.5 mM)1 pi引物CfKZSPIF (10 pmol/pl) 1 pi弓l物T7 primer (10 pmol/(il) 16.3 [xl of PCR-grade water 0.2 |il (1 U) Taq polymerase (Promega) 1 ^ cDNA文库模板反应在PTC-IOO Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中进行，反应条件
为首先94。c预变性5分钟；然后进入下列循环94。c变性30秒，59 °c退火30秒,72 'C延伸60秒，共进行30个循环；最后72'C延伸10分钟。 5'端PCR扩增所用体系以及反应条件25 pl反应体系2.5 pl 10 x PCR buffer1 |il MgCl2 (2.5 mM)2 nl dNTP (2.5 mM)1 ^引物CfKZSPIR(lO pmol4d) 1 pi弓|物T3 primer (10 pmol/pl) 16.3 jj! of PCR-grade water 0.2 (xl (1 U) Taq polymerase (Promega) 1 cDNA模板。反应在PTC-IOO Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中进行，反应条 件为首先94'c预变性5分钟；然后进入下列循环94"变性30秒，59 °c退火30秒, 72'c延伸90秒，共进行30个循环；最后72。c延伸10分钟。将3'RACE和5'RACE的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(大 连宝生物工程有限公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生 物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年) 的方法转化大肠杆菌XLl-bhie，挑选阳性克隆提取质粒，送上海鼎安生物科技有限公司 测序，测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。 6.栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的体外重组表达通过PCR技术，在正向引物切位点(阴影部分所示)及一个6XHis的蛋白标签(下划线所示)，在反向引物(AAPCTTTCAACCTCTACAAGGGCAA)中引入Hind III酶切位点(阴影部分所示) 扩增丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI中的C端Kazal结构域，反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中进行，反应条件为首先94°c预 变性5分钟，然后进入下列循环94。C变性30秒，60 °C退火30秒，72。C延伸30秒， 共进行30个循环，最后72'c延伸10分钟。按照《分子克隆第三版》的方法先将其克隆 到pMD-18T载体，转化感受态细胞Top10，将阳性克隆扩大培养后提取质粒，Mscl-Hind III双酶切后，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)纯化酶切后的目的基因 产物，连入同样经Mscl-ffindin双酶切过的pET-32a ( + )表达载体中，转化大肠杆菌 Rosetta-gami，测序确认表达框的正确性。将表达菌株在SOB液体培养基中培养至OD值 达到0.6-1.0，加入终浓度为lmM的IPTG诱导4小时，取lml菌液离心，弃去上清后， 加入80W水和2(V15X蛋白上样缓冲液，10(TC煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表 达产物。离心保存剩余菌体沉淀，利用His-tag融合蛋白纯化试剂盒MagExtractorHis-Tag NPK-700(TOYOBO公司)，按照其操作步骤纯化蛋白，SDS-PAGE检测纯化的表达产物。 变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、1mM EDTA、 50mM Tris-HCl、 50mMNaCl、 10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起 始的6M逐渐替换到4M、 3M、 2M、 0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。 复性后的重组产物采用先将重组蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶孵育，再测量剩余酶活的方法， 来检测重组Kazal型胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制作用(参考文献HergenhahnHG, Aspan A， S6derha11 K. Purification and characterization of a high-Mr proteinase inhibitor of prophenol oxidase activation from crayfish plasma. Biochem J 1987;248(1):223 _ 8)。
实施实例2:重组表达产物在蛋白酶抑制剂药物生产，人类各种相关疾病如胃癌，胰腺癌， 肺癌等疾病的治疗，及词料添加剂的生产中存在的潜在应用。
图示为本发明栉孔扇贝Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂一个结构域的重组蛋白rCfKZSPI对胰蛋白酶的抑制作用 图。
(1) SEQIDNo. 1的信息序列特征 长度1788碱基对 类型核酸 链型双链 拓扑结构线形 分子类型DNA特性名称CDS (98 —1624) 来源栉孔扇贝(C7 /"w;^/arren)序列描述AA AAAAAAAAAAAAAAA (2) SEQIDNo.2的信息 序列特征长度509个氨基酸 类型氨基酸 链型单链 拓扑结构线形特性分子量为52961.68 Da，等电点为7.02，其中编码序列的1一22位为信号肽序列， 成熟肽分子量为50647. 78Da，等电点为7. 30，具有12个典型的Kazal型丝氨酸蛋 白酶抑制剂的结构域。每个结构域都能形成3对二硫键，一个a-螺旋结构和3个e-折叠结构。来源伟孔扇贝(0 7s忍/s /arrer力序列描述PCRG
权利要求
1. 一种栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因，其特征在于具有序列表SEQIDNal 中碱基序列。
2. —种权利要求l所述栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因编码蛋白，其特征在于: 具有序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列。
3. —种权利要求2所述栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的应用，其特征在于栉孔 扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因的重组表达产物可作为胰蛋白酶类抑制剂药物的生 产，应用于人类相关疾病的治疗，或用于饲料添加剂的生产。
全文摘要
本发明涉及栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因克隆及体外重组表达技术，栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因，具有序列表SEQ ID No.1中碱基序列。本发明利用构建的栉孔扇贝cDNA文库，采用RACE技术及体外重组表达技术，对栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI进行了研究，从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA全长序列，该基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重组技术表达了具有较强胰蛋白酶抑制活性的重组蛋白。
文档编号A61K38/57GK101121935SQ20071001669
公开日2008年2月13日 申请日期2007年7月6日 优先权日2007年7月6日
发明者宋林生, 波 王, 赵建民 申请人:中国科学院海洋研究所