专利名称：2,3－二氢－3－羟甲基－6－氨基－[1,4]－苯并噁嗪在制备抑制血管内皮细胞凋亡与促 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及苯并噁嗪衍生物的用途，尤其涉及2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制备抑制血管内皮细胞凋亡与促进血管新生药物中的应用。
背景技术：
2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的结构式为 分子式C9H12N2O2分子量180.2，性状浅黄色固体，熔点154-156℃2，3-二氢-[1，4]-苯并噁嗪衍生物是一类非常重要的结构单元，许多天然产物和合成药物中都含有该结构单元。
已知2，3-二氢-2-取代-[1，4]-苯并噁嗪衍生物具有抑菌、抗血栓、心搏徐缓、抗中枢神经系统(CNS)紊乱等药理活性，如专利号为US6649610、WO2005051934、WO2005058847的专利所涉及的2，3-二氢-2-取代-[1，4]-苯并噁嗪衍生物结构；2，3-二氢-2，3-二取代-[1，4]-苯并噁嗪衍生物具有镇痛、镇静、通便等药理活性，如专利号为GB1285711、GB1182770、GB883324的专利所涉及的2，3-二氢-2，3-二取代-[1，4]-苯并噁嗪衍生物结构；另外，其它位置(如氮和苯环)上含有取代基的2，3-二氢-[1，4]-苯并噁嗪类化合物具有肌松、镇痛、抗精神失常、抗震颤麻痹、抗炎、解热、预防冠心病和动脉硬化、抑制磷酸二酯酶等药理作用，如专利号为US3879522、GB1173942、WO8907596、WO2004087694、WO0230914、JP2000327663的专利所涉及的2，3-二氢-[1，4]-苯并噁嗪衍生物结构。然而人们对2，3-二氢-3-取代-[1，4]-苯并噁嗪衍生物的结构、活性及合成研究尚不多见，仅有如专利号为US6872823、US2006014946的专利涉及到的2，3-二氢-3-甲基-[1，4]-苯并噁嗪衍生物，该类化合物主要作为合成喹诺酮类抗菌药及植物保护剂的重要中间体，其制备方法包括1)美国专利US6872823涉及的以2，3，4-三氟苯胺和2-羟基丙酸甲酯作为原料，经过三步反应制备；2)美国专利US2006014946涉及的以邻硝基苯氧基丙酮在异丙醇中以5％Pt/C还原制备。
纵观已经发表的化合物结构，发现2，3-二氢-3-取代-[1，4]-苯并噁嗪衍生物的种类有限。经权威机构检索查新，有关2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪这种苯并噁嗪衍生物在抑制血管内皮细胞凋亡和促进血管新生中的作用研究目前国内外尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制备抑制血管内皮细胞凋亡与促血管新生药物中的应用。
本发明涉及的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制备抑制血管内皮细胞凋亡药物中的应用。
其中所述能有效抑制去除血清和生长因子诱导的血管内皮细胞的凋亡的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪浓度为50μM～200μM。
本发明还涉及的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制备体外或体内促进血管生成药物中的应用。
其中所述体外促进血管生成2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的浓度为50μM～100μM；所述体内促进血管生成2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的浓度为200μM～300μM。
浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在体外Matrigel上作用血管内皮细胞24～96小时，显著促进血管新生。
浓度为200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在体内鸡胚尿囊膜上作用72小时，促进血管生成。
本发明为研究去除血清和生长因子诱导血管内皮细胞凋亡，以及研究血管新生的机制提供了理论和实验依据，本发明涉及的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能作为一种有效的工具，为研制开发有关抑制血管内皮细胞凋亡与促血管新生药物奠定了基础。
为了更好地理解本发明的实质，下面用2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的药理实验及结果来说明其在抑制血管内皮细胞凋亡与促进血管新生中的应用。
2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的制备在回流温度下，向2，4-二硝基苯氧甲基环氧乙烷(0.480g，2mmol)和醋酸(1mL，17.5mmo])的EtOH/H2O(v/v＝6∶1，100mL)溶液中加入铁粉(0.670g，12mmol)。反应混合物继续回流120分钟。冷却至室温，以饱和Na2CO3溶液调pH＝8，以C盐抽滤，浓缩掉滤液中的乙醇和水，所得固体以乙醇洗(10mL×4)。乙醇相以无水MgSO4干燥，过滤，得粗品；将上述粗品以硅胶柱层析(乙醇作展开剂)分离，得2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪(0.149g，42％)。
血管内皮细胞的制备以常规方法培养人脐静脉血管内皮细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞备用。
采用细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验研究2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪抑制血管内皮细胞凋亡以及促进血管新生的作用。
1、用MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性，测定在去除血清和生长因子的培养条件下，血管内皮细胞的存活率将人脐静脉血管内皮细胞接种于96孔细胞培养板中，设置正常组在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养；凋亡诱导对照组在去除血清和生长因子的培养条件下培养；溶剂对照组在去除血清和生长因子的培养条件下加入DMSO培养；实验组在去除血清和生长因子的培养条件下加入浓度为25μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪培养。37℃，CO2孵箱内培养24小时，采用MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性，计算24小时后细胞的相对存活率。(见附图1)结果表明与凋亡诱导对照组和溶剂对照组相比，在去除血清和生长因子的培养条件下，浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理血管内皮细胞24小时，能够显著提高细胞存活率。
2、倒置相差显微镜观察细胞形态学变化将人脐静脉血管内皮细胞接种于24孔细胞培养板中，设置正常组在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养；凋亡诱导对照组在去除血清和生长因子的培养条件下培养；实验组在去除血清和生长因子的培养条件下加入浓度为25μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪培养；溶剂对照组在去除血清和生长因子的培养条件下加入DMSO培养。37℃，CO2孵箱内培养24小时之后，倒置相差显微镜下观察血管内皮细胞凋亡的形态学变化和凋亡小体的形成。(见附图2)结果表明用浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理血管内皮细胞24小时，能有效的抑制去除血清和生长因子诱导的血管内皮细胞的凋亡。与对照组相比，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理组中的细胞皱缩现象和凋亡小体的形成都明显减弱。
3、用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡率TUNEL通常用于检测核DNA的片断化和测定细胞凋亡率。将人脐静脉血管内皮细胞接种于48孔细胞培养板中，设置正常组在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养；对照组在去除血清和生长因子的培养条件下培养；实验组在去除血清和生长因子的培养条件下加入浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪培养。37℃，CO2孵箱内培养24小时之后，使用DeadEndTMFluorometric TUNEL试剂盒和激光扫描共聚焦显微镜观察DNA的片断化并根据TUNEL阳性率定量测定细胞凋亡率。(见附图3)结果表明正常组细胞几乎没有凋亡阳性细胞，凋亡率仅为2.22％；对照组细胞凋亡阳性细胞较多，凋亡率为29.13％；实验组细胞的凋亡阳性细胞较对照组显著降低，凋亡率为9.54％。说明浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能显著抑制血管内皮细胞凋亡。
4、体外血管形成检测将人脐静脉血管内皮细胞接种于事先铺好Matrigel的24孔细胞培养板中，给细胞换四种不同的检测培养系统，置于37℃，CO2培养箱中培养24小时～96小时。分别在24小时，48小时，72小时和96小时，倒置相差显微镜下观察血管内皮细胞在Matrigel上的血管形成情况。
(1)在去除血清和生长因子的培养条件下，没有加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的对照组细胞，几乎不能在Matrigel上分化形成血管样结构，并且随着培养时间的延长，大量的血管内皮细胞凋亡。与之相反，加入浓度为50μM～100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的实验组细胞在Matrigel上形成围成管腔状的血管样结构，并且随着培养时间的延长，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能有效抑制去除血清和生长因子诱导的凋亡。(见附图4)(2)在只含有生长因子的培养条件下，没有加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的对照组细胞，可以在生长因子的刺激下，在Matrigel上分化形成血管样结构。同样，加入浓度为50μM～100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的实验组细胞，在Matrigel上分化形成大量的围成管腔状的血管样结构，说明2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪和生长因子在体外成血管方面具有协同促进作用。(见附图5)(3)在只含有血清的培养条件下，不论是否加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪，对照组和实验组细胞都不能在Matrigel上分化形成血管样结构，说明血清具有很强的抑制血管内皮细胞分化为血管样结构的能力。但是，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪仍然能抑制去除生长因子诱导的细胞凋亡。(见附图6)(4)在含有血清和生长因子的培养条件下，没有加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的对照组细胞，在Matrigel上几乎不形成血管样结构。加入浓度为50μM～100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的实验组细胞在最初48小时之内，在Matrigel上形成血管样结构并不明显。随着培养时间的延长，尤其在96小时的时候，尽管血清抑制血管内皮细胞分化为血管样结构，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪仍然可以协同生长因子，一起发挥促血管生成的作用，在Matrigel上形成典型的血管样结构。(见附图7)以上结果表明在体外成血管的检测中，浓度为50μM～100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪具有在Matrigel上促进血管生成的作用。
5、体内鸡胚尿囊膜血管形成检测受精的鸡蛋在37℃，相对湿度80％的培养箱中孵育4天。将浸有50μl，浓度为50μM～300μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的滤膜片放置在鸡胚尿囊膜表面，再将鸡蛋放入37℃，相对湿度80％的培养箱中孵育3天。孵育结束之后，用4％多聚甲醛固定放置有滤膜的鸡胚尿囊膜20分钟，观察拍照。将浸有50μl PBS缓冲液的滤膜片处理的鸡胚尿囊膜作为对照组。(见附图8)。
结果表明与对照组相比，实验组中有大量的以滤膜片为中心呈放射状的三级和四级毛细血管的生成。说明在体内成血管的检测中，浓度为200μM～300μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪具有促进血管生成的作用。
上述的实验数据统计学处理实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验*，P＜O.05表示有显著性差异；**，P＜O.01表示有极显著性差异。
由上述实验及其结果，可以得出如下结论在去除血清和生长因子的培养条件下，用浓度为2μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理血管内皮细胞24小时，均能提高血管内皮细胞的存活率。但是，浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能够显著性提高细胞的存活率。倒置相差显微镜下观察浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理24小时的血管内皮细胞，发现去除血清和生长因子诱导的细胞凋亡被抑制并且凋亡小体的形成明显降低。综合TUNEL检测结果，说明浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能有效抑制去除血清和生长因子诱导的血管内皮细胞的凋亡。体外Matrigel上的血管形成实验结果表明，浓度为50μM～100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在体外能明显促进血管生成。体内鸡胚尿囊膜的成血管实验结果表明，浓度为200μM～300μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪具有促进体内血管生成的作用。因此，本发明为研究去除血清和生长因子诱导血管内皮细胞凋亡，以及研究血管新生的机制提供了理论和实验依据，本发明涉及的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能作为一种有效的工具，为研制开发有关抑制血管内皮细胞凋亡与促血管新生药物奠定了基础。
图1 MTT法检测血管内皮细胞琥珀酸脱氢酶的活性，统计血管内皮细胞在去除血清和生长因子培养条件下的存活率。
其中正常血管内皮细胞在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养24小时，存活率为100％；对照血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下培养24小时，存活率为35.59％；DMSO血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下加入DMSO培养24小时，存活率为29.62％；25μM、50μM、100μM、200μM血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下用浓度分别为25μM、50μM、100μM、200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理24小时，存活率分别为42.38％、65.03％、58.55％和74.91％。*P＜0.05 vs对照。
图2倒置相差显微镜下所示血管内皮细胞形态变化情况。
其中a正常组血管内皮细胞在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养24小时；b对照组血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下培养24小时；c实验组血管内皮细胞去除血清和生长因子的培养条件下用浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理24小时；d DMSO溶剂对照组血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下加入DMSO培养24小时。
图3末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡率。
其中A激光扫描共聚焦显微镜下所示血管内皮细胞TUNEL标记凋亡阳性细胞。a正常组血管内皮细胞在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养24小时；b对照组血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下培养24小时；c实验组血管内皮细胞去除血清和生长因子的培养条件下用浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理24小时。B细胞凋亡率的定量图。正常血管内皮细胞在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养24小时，凋亡率为2.22％；对照血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下培养24小时，凋亡率为29.13％；实验血管内皮细胞在去除血清和生长因子的培养条件下用浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理24小时，凋亡率为9.54％。*P＜0.05 vs正常，**P＜0.01 vs正常。
图4倒置相差显微镜下所示在不含血清和生长因子的培养条件下，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上促血管内皮细胞的成血管作用。
其中a，b，c，d血管内皮细胞在不含血清和生长因子的培养条件下，在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。e，f，g，h血管内皮细胞在不含血清和生长因子的培养条件下，加入浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。
图5倒置相差显微镜下所示在只含有生长因子的培养条件下，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上促血管内皮细胞的成血管作用。
其中a，b，c，d血管内皮细胞在只含有生长因子的培养条件下，在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。e，f，g，h血管内皮细胞在只含有生长因子的培养条件下，加入浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。
图6倒置相差显微镜下所示在只含有血清的培养条件下，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上促血管内皮细胞的成血管作用。
其中a，b，c，d血管内皮细胞在只含有血清的培养条件下，在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。e，f，g，h血管内皮细胞在只含有血清的培养条件下，加入浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。
图7倒置相差显微镜下所示在含有血清和生长因子的培养条件下，2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上促血管内皮细胞的成血管作用。
其中a，b，c，d血管内皮细胞在含有血清和生长因子的培养条件下，在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。e，f，g，h血管内皮细胞在含有血清和生长因子的培养条件下，加入浓度为50μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在Matrigel上培养24小时，48小时，72小时和96小时。
图8 2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在体内鸡胚尿囊膜上的促血管生成作用。
其中对照鸡胚尿囊膜用浸有50μl PBS缓冲液的滤膜片处理3天。实验鸡胚尿囊膜用浸有50μl，浓度为200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的滤膜片处理3天。
具体实施例方式
实施例1 2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的制备在回流温度下，向2，4-二硝基苯氧甲基环氧乙烷(0.480g，2mmol)和醋酸(1mL，17.5mmol)的EtOH/H2O(v/v＝6∶1，100mL)溶液中加入铁粉(0.670g，12mmol)。反应混合物继续回流120分钟。冷却至室温，以饱和Na2CO3溶液调pH＝8，以C盐抽滤，浓缩掉滤液中的乙醇和水，所得固体以乙醇洗(10mL×4)。乙醇相以无水MgSO4干燥，过滤，得粗品；将上述粗品以硅胶柱层析(乙醇作展开剂)分离，得2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪(0.149g，42％)。
实施例2 用MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性，测定在去除血清和生长因子的培养条件下，血管内皮细胞的存活率将人脐静脉血管内皮细胞接种于96孔细胞培养板中，设置正常组在含有血清和生长因子的正常培养条件下培养；凋亡诱导对照组在去除血清和生长因子的培养条件下培养；溶剂对照组在去除血清和生长因子的培养条件下加入DMSO培养；实验组在去除血清和生长因子的培养条件下加入浓度为25μM、50μM、100μM、200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪培养。37℃，CO2孵箱内培养20小时之后，加入5mg/ml的MTT溶液0.02ml，继续在37℃，CO2孵箱内培养4小时，吸出孵育液并加入0.1ml二甲基亚砜(DMSO)，避光摇床振荡20分钟。最后用酶联免疫检测仪在570nm处测定光密度(OD值)，取各平行孔OD值的平均值，根据公式计算24小时细胞的相对存活率存活细胞％＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％(以不含细胞的培养液为空白组调零)。
结果表明与凋亡诱导对照组和溶剂对照组相比，在去除血清和生长因子的培养条件下，浓度为50μM～200μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪处理血管内皮细胞24小时，能够显著提高细胞存活率。
实施例3 体外血管形成检测按照4～5×104个细胞/孔的密度，将悬浮于不含血清和生长因子的M199基础培养液中的血管内皮细胞接种于事先铺好Matrigel的24孔细胞培养板中，置于37℃，CO2培养箱中孵育30分钟～60分钟。然后给24孔培养板中的细胞换四种不同的检测培养系统，置于37℃，CO2培养箱中培养24小时～96小时。分别在24小时，48小时，72小时和96小时，倒置相差显微镜下观察血管内皮细胞在Matrigel上的血管形成情况。其中，检测培养系统1在去除血清和生长因子的培养条件下，没有加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为对照组；加入浓度为25μM、50μM、100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为实验组。
检测培养系统2在只含有生长因子的培养条件下，没有加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为对照组；加入浓度为25μM、50μM、100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为实验组。
检测培养系统3在只含有血清的培养条件下，没有加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为对照组；加入浓度为25μM、50μM、100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为实验组。
检测培养系统4在含有血清和生长因子的培养条件下，没有加入2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为对照组；加入浓度为25μM、50μM、100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪作为实验组。
结果表明在体外成血管的检测中，浓度为50μM～100μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪能促进血管内皮细胞在Matrigel上的血管新生。
实施例4 体内鸡胚尿囊膜血管形成检测受精的鸡蛋在37℃，相对湿度80％的培养箱中孵育4天。在孵育期间，鸡蛋的尖头一端向下放置，并且将鸡蛋轻微旋转晃动几次。孵育结束后，将鸡蛋的气囊面打开一个小洞，用镊子仔细剥离蛋壳和蛋膜，将浸有50μl，浓度为50μM、100μM、200μM、300μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪的滤膜片放置在鸡胚尿囊膜表面，滤膜所处的位置尽量远离鸡胚尿囊膜的一级大血管。腔洞用石蜡膜封口。然后再将鸡蛋放入37℃，相对湿度80％的培养箱中孵育3天。孵育结束之后，用4％多聚甲醛固定放置有滤膜的鸡胚尿囊膜20分钟，进行拍照。将浸有50μl PBS缓冲液的滤膜片处理的鸡胚尿囊膜作为对照组。
结果表明在体内成血管的检测中，浓度为200μM～300μM的2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪具有促进血管生成的作用。
权利要求
1.2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制备抑制血管内皮细胞凋亡药物中的应用。
2.如权利要求1中所述的应用，其特征是所述能有效抑制去除血清和生长因子诱导的血管内皮细胞的凋亡的药物浓度为50μM～200μM。
3.2，3-二氢-3-羟甲基-6-氨基-[1，4]-苯并噁嗪在制备体外或体内促进血管生成药物中的应用。
4.如权利要求3中所述的应用，其特征是所述体外促进血管生成药物的浓度为50μM～100μM；所述体内促进血管生成药物的浓度为200μM～300μM。
全文摘要
本发明公开了一种2，3－二氢－3－羟甲基－6－氨基－[1，4]－苯并噁嗪在制备抑制血管内皮细胞凋亡与促血管新生药物中的应用。其中所述能有效抑制去除血清和生长因子诱导的血管内皮细胞的凋亡的药物浓度为50μM～200μM。所述体外促进血管生成药物的浓度为50μM～100μM；所述体内促进血管生成药物的浓度为200μM～300μM。本发明所述2，3－二氢－3－羟甲基－6－氨基－[1，4]－苯并噁嗪能作为一种有效的工具用于研究血管内皮细胞凋亡和血管新生的分子机制。
文档编号A61P9/00GK101084902SQ200710016649
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者苗俊英, 赵宝祥, 张尚立, 赵静, 程轶喆 申请人:山东大学