专利名称：一种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法
技术领域：
本发明设计绵羊18号染色体末端微卫星标记UMP基因型，分型检测方法，可以快速高效预测陶赛特羊早期生长发育性状，建立了该微卫星标记基因型分型的检测方法。
背景技术：
1983年，在美国的无角陶赛特羊群体中发现了一只后臀极度发达的个体，人们称这种表型为双肌臀性状，根据表型将该基因命名为Callipyge (CLPG)基因，20世纪末，人们将CLPG基因初歩定位于陶赛特羊第18号染色体的末端区域，位于微卫星标记CSSM18和TGLA122 之间。文献检索披露I)Journal of Animal Science, 76(1998), 2549- 2559，作者Freking等研究发现CLPG基因可显著提高双肌臀羊的瘦肉率，也使皮下肌间、肌内和肾周的脂肪減少，能显著提高屠宰率。2)GenetiCS，163(2003)，453-456，作者Maria等研究发现在CLPG基因内的DLKl和GTL2位点间存在ー处碱基突变(A-G)可以决定CLPG表型。3)国内南京农业大学刘国庆等研究陶赛特羊和萨福克羊及其杂交后代CLPG基因多态性，发现18号染色体Meg3. 9位点与肉羊后臀肌肉发达的表型相关，详见论文《遗传》，28 (2006)，815-820。4)《遗传》，28 (2006)，1525-1531，作者任航行等分析了与CLPG基因连锁相关的 10 个微卫星基因座((ILSTS54、TGL A337、HH47、TGLA122、BP33、0B2、BM3413、MCM38、MC MA26和CSSM1)等分别对陶赛特羊和萨福克羊群体的遗传进行了分析，结果显示在陶赛特群体中，微卫星BM3413、MCMA26和CSS M18对臀宽有显著影响；萨福克群体中微卫星基因座TGLA122、BM3413、MCM38和CSSM18对绵羊臀宽存在显著或极显著影响。随着测序技术的发展，绵羊基因遗传连锁图谱也在不断的完善和増加。2010年10月6日第五代绵羊连锁图谱发布，该图谱包含了染色体上的673个DNA标记，连锁群的总遗传长度已经超过3000cMo本发明研究位于绵羊18号染色体末端UMP微卫星基因座的多态性，在陶赛特羊上发现其微卫星基因座的多态性与早期生长发育具有相关性，可以将该微卫星位点作为影响陶赛特羊早期生长发育的分子标记。
发明内容
本发明的目在于提供通过绵羊18号染色体末端的微卫星标记UMP快速检测陶赛特羔羊生长发育性能的方法，对预测陶赛特羊的生长发育速度及性能有着重要的科学价值与实践意义。本发明的目是这样实现的ー种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法，包括I)依据第五代绵羊基因图谱，发现位于绵羊18号染色体末端93. 9cM位置的微卫星标记UMP ；2)人工合成一对核苷酸序列作为检测微卫星标记UMP基因型的引物，其正向引物5，- CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT-3’ ；上下游引物长度分别为24bp和23bp ；3)采集陶赛特羊血液，提取基因组DNA，利用引物扩增PCR，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4)利用荧光标记的PCR引物对多态位点进行扩增并确定扩增片段的长度，实现对微卫星多态位点的分型，确定陶赛特羊微卫星标记UMP 的基因型分别是 104/110,107/110,104/107,110/110,104/104，107/107 ；
其中绵羊基因组DNA体外扩增
采集羊外周血液I. 5ml，使用肝素纳抗凝采血管，-20°C冷冻保存，提取基因组DNA ；
其中绵羊血液基因组DNA的制备
(1)取出-20°C冷冻血液O.5-1.0 ml，在室温下完全融化，于10000 r/min离心10分钟，弃去上层液，中含裂解的红细胞；加入Iml红细胞裂解液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10分钟，于10000 r/min离心10分钟，弃去上层液；再加入Iml红细胞裂解液，弹起管底沉 淀，轻柔的摇勻10分钟，于10000 r/min离心10分钟,弃去上层液；
(2)向管内依次加入600μ1的白细胞裂解液，70ul的10%SDS溶液，15ul浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul浓度为10mg/mL的Rnase A溶液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀；置于55°C振荡水浴锅中振荡过夜；
(3)取出混合液将其冷却至室温，向管内加入600ulTris-HCl饱和酚溶液，将两相上下轻柔颠倒混匀5分钟，于10000 r/min离心10分钟；用直径为O. 2-0. 35cm的Iml枪头将上层清液吸出600ul-650ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入酚氯仿比为1:1的混合溶液600ul，轻柔的摇匀10分钟，于10000 r/min离心10分钟；再用直径大小为O. 25-0. 38cm的Iml枪头将上层清液吸出490-520ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入氯仿溶液600ul，轻柔的摇匀10分钟，于10000 r/min离心10分钟；第三次用直径为O. 28-0. 37cm的Iml枪头将上层清液小心吸出300-350ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入无水こ醇1ml，轻柔的摇匀2分钟，可看到漂浮的絮状物即为DNA，于10000 r/min离心10分钟；
(4)将管内的上清混合液弃去，加入70%酒精200ul，弹起管底DNA沉淀，于10000r/min离心5分钟；将管内的上清液弃去，放置于超净工作台上晾干；
向管内加入超纯灭菌水50ul，将干燥的DNA弹起混匀，室温或4°C保存直至DNA完全溶
解；
(5)用分光光度计来检测基因组DNA的浓度和纯度，提取血样基因组DNA，其纯度，在I. 6-1. 8 ；
(6)用O.8%的琼脂糖凝胶，检测提取好的基因组DNA原液的质量；
(7)对每ー样品的DNA进行相应倍数的调整，使浓度达到45-52ng /uL,作为PCR反应的模版，其余的-20°C保存备用；
其中 PCR 扩增反应体系2. 5 yL 的 10XPCR buffer, 2. OuL 的 25mmol/L MgCl，O. 5μ L 的 10 mmol/L dNTP 混合物，I μ L 的 10 μ mol/L 上游引物，I μ L 的 10 μ mol/L 下游引物，1.25U的Taq酶，I μ的50ng/μ L绵羊基因组DNA L，无菌去离子水补足25 μ L ;
其中PCR反应循环程序95 V 5min I个循环；95 °C变性30s，58°C退火30 S，72 V延伸30 s共35个循环；72で延伸6 min I个循环；
其中微卫星分型标记的检测步骤
(1)将进行PCR反应的96孔板置于冰水混合物上；
(2)将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停；
(3)使用美国ABI公司的3730XL测序列分析仪检测微卫星样本，确定陶赛特羊的微卫星标记UMP基因型；将其不同的基因型作为陶赛特羊早期生长发育速度及特性的分子标记，用于辅助选择育种；
其中实验液体的配制
红细胞裂解液将NH4C1 8. 29g, KHC03 I. Og和EDTA O. 37 g，溶解于800ml去离子水中，定溶至1L，高压灭菌；
白细胞裂解液Tris I. 21g, EDTA O. 7444g, NaCl 23. 376g, SDS 10g，加高压灭菌去离子水至I L ；
10% SDS :将SDS 10g，加高压灭菌去离子水至IOOml ；
I: I的酚氯仿取Tris饱和酚与氯仿各IOOmL混合均匀，棕色瓶中4°C保存；20mg/mL的蛋白酶K溶液将IOOmg蛋白酶K加入5mL无菌双蒸水,终浓度20 mg/mL,分装成小份，-20で冻存；
10mg/mL的Rnase A溶液将IOmg RNase A加入ImL无菌双蒸水，终浓度10 mg/ml,煮沸10 min后使其自然冷却后使用，-20で冻存。所述的方法，选用的肝素纳抗凝采血管购自南昌赣达医疗器械有限公司；dNTP混合物、Taq酶、PCR buffer为Mg2+ free、Tris-HCl饱和酚，氯仿溶液购自上海生エ生物エ程技术服务有限公司；其它试剂均由北京鼎国生物技术有限公司提供。本发明构思及作用机理利用微卫星标记分析技术对陶赛特羊微卫星标记UMP基因型多态性进行了分析，分析发现了 6种基因型个体，分别为104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107;分析比较微卫星标记UMP不同基因型群体平均生长发育性状的相关性，将其不同的基因型作为陶赛特羊早期生长发育速度及特性的分子标记，用于辅助选择育种。该方法由于陶赛特羊微卫星标记UMP基因型多态性，可以作为判断陶赛特羊个体是否具有优良的早期生长性状的ー个分子标记；建立的检测该位点的高效快速检测方法，对提高畜牧业种群的快速生长性能及优选有着重要的实用价值，彰显技术进歩。
具体实施例方式本发明对照实施例作进ー步说明。
实施例一、绵羊基因组DNA体外扩增
采集羊外周血液I. 5ml，使用肝素纳抗凝采血管，-20°c冷冻保存，提取基因组DNA ；
其中绵羊血液基因组DNA的制备
(1)取出-20で冷冻血液1.0ml，放置于室温直至融化完全，于10000 r/min离心10分钟，弃去上层液(含裂解的红细胞)；
(2)向管内加入Iml红细胞裂解液(IX)，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10分钟，于10000r/min离心10分钟,弃去上层液；
(3)再向管内加入Iml红细胞裂解液(IX)，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10分钟，于10000 r/min离心10分钟,弃去上层液；
(4)向管内依次加入600μI的白细胞裂解液，70ul 10% SDS，15ul蛋白分解酶K20mg/mL和3 ul Rnase溶液10mg/mL,弹起管底沉淀,轻柔的摇勻；
(5)置于55°C振荡水浴锅中振荡过夜，以裂解白细胞，消化蛋白质和RNA；
(6)取出混合液将其冷却至室温，向管内加入600ulTris-HCl饱和酚溶液，将两相上下轻柔颠倒混勻5分钟,于10000 r/min离心10分钟；
(7)用直径为O.3cm的Iml枪头将上层清液小心吸出650ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入1:1的酹/氯仿溶液600ul,轻柔的摇勻10分钟,于10000 r/min离心10分钟；
(8)用直径为O.3cm的Iml枪头将上层清液小心吸出500ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入氯仿溶液600ul,轻柔的摇勻10分钟,于10000 r/min离心10分钟；
(9)用直径为O.3cm的Iml枪头将上层清液小心吸出350ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入无水こ醇1ml，轻柔的摇匀2分钟，可看到漂浮的絮状物即为DNA，于10000 r/min离心10分钟；
(10)将管内的上清混合液弃去，加入70%酒精200ul，弹起管底DNA沉淀，于10000r/min离心5分钟；
(11)将管内的上清液弃去，放置于超净工作台上晾干；
(12)向管内加入超纯灭菌水50ul，将干燥的DNA弹起混匀，室温或4°C保存直至DNA完全溶解；
(13)用分光光度计来检测基因组DNA的浓度和纯度，提取血样基因组DNA要符合后续试验其纯度应在1.8;
(14)用O.8%的琼脂糖凝胶(溴化こ锭EB的含量为O. 5ug/mL)检测提取好的基因组DNA原液的质量，配凝胶的溶剂及电泳液都为I XTAE缓冲液；
(15)对每ー样品的DNA进行相应倍数的调整，使浓度达到一致(50ng /uL),作为PCR反应的模版，其余的_20°C保存备用。依据2010年10月11日发表的第五代绵羊基因图谱，发现位于绵羊18号染色体末端93.9cM位置的微卫星标记UMP，该标记与绵羊生长发育性状有夫；人工合成一对核苷酸序列作为检测微卫星标记UMP基因型的引物，其正向引物5，-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT -3，；上下游引物长度分别为24bp和23bp以上引物进行PCR扩增；
其中 PCR 扩增反应体系2. 5 yL 的 10XPCR buffer, 2. OuL 的 25mmol/L MgCl, O. 5μ L 的 10 mmol/L dNTP 混合物，I μ L 的 10 μ mol/L 上游引物，I μ L 的 10 μ mol/L 下游引物，1.25U的Taq酶，I μ的50ng/μ L绵羊基因组DNA L，无菌去离子水补足25 μ L ;
其中PCR反应循环程序95 V 5min I个循环；95 °C变性30s，58°C退火30 S，72 V延伸30 s共35个循环；72で延伸6 min I个循环；
其中实验液体的配制
红细胞裂解液将NH4C1 8. 29g, KHC03 I. Og和EDTA O. 37 g，溶解于800ml去离子水中，定溶至1L，高压灭菌；
白细胞裂解液Tris I. 21g, EDTA O. 7444g, NaCl 23. 376g, SDS 10g，高压灭菌加去离子水至I L ；
10% SDS :将SDS 10g，高 压灭菌加去离子水至IOOml ；
I: I的酚氯仿取Tris饱和酚与氯仿各IOOmL混合均匀，棕色瓶中4°C保存；20mg/mL的蛋白酶K溶液将IOOmg蛋白酶K加入5mL无菌双蒸水,终浓度20 mg/mL,分装成小份，-20で冻存；
10mg/mL的Rnase A溶液将IOmg RNase A加入ImL无菌双蒸水，终浓度10 mg/ml,煮沸10 min后使其自然冷却后使用，-20で冻存。ニ、微卫星分型标记检测
(1)将进行PCR反应的96孔板置于冰水混合物上；
(2)将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停；
(3)使用美国ABI公司的3730XL测序列分析仪检测微卫星样本，确定陶赛特羊的微卫星标记UMP基因型；
三、确定微卫星标记UMP不同基因型个体间的生长发育差别
(I)測定163只陶赛特羔羊早期生长发育性状(出生重，1-6月龄体重及体尺)。(2)用最小ニ乘方法分析微卫星标记不同基因型群体平均生长发育性状的相关性，即6种不同基因型个体间体重和体尺指标的差异。(3)将其不同的基因型作为陶赛特羊早期生长发育速度及特性的分子标记，用于辅助选择育种。四、验证结果
所述检测陶赛特羊生长发育性状的方法，获取的微卫星标记UMP的6种不同基因型，分析163只陶赛特羊群体出生重和1-6月龄体重，用最小二乗法分析该微卫星标记不同基因型群体平均体重之间的差异，结果显示基因型104/110的平均出生重和I月龄、4月龄体重显著高于其他基因型个体，基因型104/104的3月龄平均体重高于其他基因型个体，结果见表I。表I微卫星标记UMP不同基因型对体重的影响
权利要求
1.ー种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法，其特征在干包括I)依据第五代绵羊基因图谱，发现位于绵羊18号染色体末端93. 9cM位置的微卫星标记UMP ；2)人工合成一对核苷酸序列作为检测微卫星标记UMP基因型的引物，其正向引物5’-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT -3，；上下游引物长度分别为24bp和23bp ；3)采集陶赛特羊血液，提取基因组DNA，利用引物扩增PCR，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4)利用荧光标记的PCR引物对多态位点进行扩增并确定扩增片段的长度，实现对微卫星多态位点的分型，确定陶赛特羊微卫星标记UMP的基因型分别是 104/110,107/110,104/107,110/110,104/104，107/107 ； 其中绵羊基因组DNA体外扩增 采集羊外周血液I. 5ml，使用肝素纳抗凝采血管，-20°C冷冻保存，提取基因组DNA ；· 其中绵羊血液基因组DNA的制备 (1)取出-20°C冷冻血液O.5-1.0 ml，在室温下完全融化，于10000 r/min离心10分钟，弃去上层液，中含裂解的红细胞；加入Iml红细胞裂解液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10分钟，于10000 r/min离心10分钟，弃去上层液；再加入Iml红细胞裂解液，弹起管底沉淀，轻柔的摇勻10分钟，于10000 r/min离心10分钟,弃去上层液； (2)向管内依次加入600μI的白细胞裂解液，70ul的10% SDS溶液，15ul浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul浓度为10mg/mL的Rnase A溶液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀，置于55°C振荡水浴锅中振荡过夜； (3)取出混合液将其冷却至室温，向管内加入600ulTris-HCl饱和酚溶液，将两相上下轻柔颠倒混勻5分钟，于10000 r/min离心10分钟；用直径为O. 2-0. 35cm的Iml枪头将上层清液吸出600ul-650ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入酚氯仿比1:1的混合溶液600ul，轻柔的摇匀10分钟，于10000 r/min离心10分钟；再用直径为O. 25-0. 38cm的Iml枪头将上层清液吸出490-520ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入氯仿溶液600ul，轻柔的摇匀10分钟，于10000 r/min离心10分钟；第三次用直径为O. 28_0. 37cm的Iml枪头将上层清液吸出300-350ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入无水こ醇1ml，轻柔的摇匀2分钟，可看到漂浮的絮状物即为DNA，于10000 r/min离心10分钟； (4)将管内的上清混合液弃去，加入70%酒精200ul，弹起管底DNA沉淀，于10000r/min离心5分钟；将管内的上清液弃去，放置于超净工作台上晾干； 向管内加入超纯灭菌水50ul，将干燥的DNA弹起混匀，室温或4°C保存直至DNA完全溶解； (5)用分光光度计来检测基因组DNA的浓度和纯度，提取血样基因组DNA，其纯度为I. 6-1. 8 ； (6)用O.8%的琼脂糖凝胶，检测提取好的基因组DNA原液的质量； (7)对每ー样品的DNA进行相应倍数的调整，使浓度达到45-52ng /uL,作为PCR反应的模版，其余的-20°C保存备用； 其中 PCR 扩增反应体系2. 5 μ L的 10XPCR buffer, 2. OuL 的 25mmol/L MgCl，0. 5μ L 的 10 mmol/L dNTP 混合物，I μ L 的 10 μ mol/L 上游引物，I μ L 的 10 ymol/L 下游引物，1.25U的Taq酶，I μ的50ng/μ L绵羊基因组DNA L，无菌去离子水补足25 μ L ; 其中PCR反应循环程序95 V 5min I个循环；95°C变性30s，58°C退火30 s，72V延伸30 S共35个循环；72で延伸6 min I个循环； 其中微卫星分型标记的检测步骤 (1)将进行PCR反应的96孔板置于冰水混合物上； (2)将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停； (3)使用美国ABI公司的3730XL测序列分析仪检测微卫星样本，确定陶赛特羊的微卫星标记UMP基因型，将其不同的基因型作为陶赛特羊早期生长发育速度及特性的分子标记，用于辅助选择育种；其中实验液体的配制 红细胞裂解液将NH4C1 8. 29g, KHC03 I. Og和EDTA O. 37 g，溶解于800ml去离子水中，定溶至1L，高压灭菌； 白细胞裂解液Tris I. 21g, EDTA O. 7444g, NaCl 23. 376g, SDS 10g，加去离子水至 IL，闻压灭菌； 10% SDS :将SDS 10g，加去离子水至100ml，高压灭菌； I: I的酚氯仿取Tris饱和酚与氯仿各IOOmL混合均匀，棕色瓶中4°C保存；20mg/mL的蛋白酶K溶液将IOOmg蛋白酶K加入5mL无菌双蒸水,终浓度20 mg/mL,分装成小份，-20で冻存； 10mg/mL的Rnase A溶液将IOmg RNase A加入ImL无菌双蒸水，终浓度10 mg/ml,煮沸10 min后使其自然冷却后使用，-20で冻存。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于选用的肝素纳抗凝采血管购自南昌赣达医疗器械有限公司；dNTP混合物、Taq酶、PCR buffer为Mg2+ free、Tris-HCl饱和酚、氯仿溶液，购自上海生エ生物工程技术服务有限公司。
全文摘要
本发明提供的一种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法，包括1)依据第五代绵羊基因图谱，发现位于绵羊18号染色体末端93.9cM位置的微卫星标记UMP；2)人工合成一对核苷酸序列作为检测微卫星标记UMP基因型的引物，其正向引物5'-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT-3'；反向引物5'-GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT-3'；上下游引物长度分别为24bp和23bp；3)采集陶赛特羊血液，提取基因组DNA，利用引物扩增PCR，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4)利用荧光标记的PCR引物对多态位点进行扩增并确定扩增片段的长度，实现对微卫星多态位点的分型，确定陶赛特羊微卫星标记UMP的基因型分别是104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107。检测确定微卫星标记UMP不同基因型个体间的生长发育差别，用于辅助选择育种。
文档编号C12Q1/68GK102719532SQ20121015167
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者刘明军, 史洪才, 杨丹, 梁庆玲, 牛志刚 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心