一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水产动物亲子鉴定的方法，具体涉及了一种采用微卫星多重PCR 方法进行长牡蛎亲子鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 微卫星标记方法具有多态性丰富、高度杂合、稳定性好、遵循孟德尔分离定律、共 显性遗传、易于PCR扩增等特点，是当今最流行的分子标记之一。在亲子鉴定中，相比于SNP 标记，使用微卫星标记所需位点数少，但相对鉴定力可达5倍以上;微卫星标记方法不需特 殊仪器，具有操作便捷、易于检测、省时高效以及准确度高的特点。
[0003] 利用微卫星标记进行亲子鉴定，传统的分析方法是将PCR扩增产物在变性或者非 变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分型，利用银染的方式对电泳结果进行显色，进而获得 所需要的目的条带。这种方法存在许多不足之处，如判读误差较大、分辨率不高、操作无法 自动化及存在有害物质、处理通量低等问题，不适合于大量样本的分析，也满足不了亲子鉴 定对基因型分型的精度要求。
[0004] 微卫星多重PCR方法是指在同一反应体系里加入多对引物，同时进行多个扩增反 应，得到多个产物，因而具有提高反应效率，避免样品浪费，节约实验成本等优点。微卫星多 重PCR在大黄鱼（Pseudosciaena crocea)，大菱鲜（Scophthalmus maximus)，斑节对奸 (Penaeus monodon)，以及!ti下夷扇贝（Patinopecten yessoensis)、皱纹盘鲍（Haliotis di scus hannai)等的亲权分析及系谱认证中均有应用。
[0005] 长牡蛎(Crassostrea gigas)是世界上养殖范围最广、产量最大的经济贝类，素有 "海中牛奶"之美誉，深受消费者青睐。为了确保食品安全和增强消费者对养殖牡蛎产品的 信赖，建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，以实现从苗种到餐桌的全程质量控制至关重要。长 期以来，养殖水产品大都采用物理方法进行标记，但是物理标记容易丢失和改变，可靠性较 低。使用DNA标记进行跟踪具有标记稳定、可靠，且易于检测的优势。
[0006] 因此，开发精确的适用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR技术体系对于开展养 殖牡蛎产品的DNA鉴定具有重要意义。此外，牡蛎亲子鉴定技术在牡蛎种质资源保护、优良 品种选育等方面也具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0007] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种高通量、鉴定准确率高的长牡蛎亲子鉴 定的多重PCR方法，该方法采用加尾引物，能够快速、准确的对未知亲缘关系的长牡蛎亲本 与子代间进行亲子鉴定，以弥补现有技术的不足。
[0008] 为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：
[0009] -种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0010] (1)提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA，其中长牡蛎子代选取的是D形幼虫，这是由 于在海洋贝类中，经常会出现偏分离的微卫星等位基因，因此利用幼虫进行家系分析可以 减少或排除偏分离位点的影响；
[0011] (2)长牡蛎多态性微卫星引物的筛选:根据引物筛选软件以及现有文献记载的长 牡蛎引物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的 引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记；
[0012] (3)对步骤（1)得到的长牡蛎亲本和子代个体的DNA进行多重PCR扩增:对步骤(2) 中筛选得到的引物首先两两组合，选出扩增清晰的组合再进行3个位点的多重PCR体系的构 建;然后优化退火温度、引物浓度和反应体系，最终将18个微卫星位点组成了 6组最佳多重 PCR体系，这使微卫星标记基因分型的工作量降低了 2/3,节省了大量的时间、人力和物力；
[0013] (4)获得长牡蛎亲本和子代的基因型数据:对步骤(3)得到的多重PCR扩增产物进 行荧光信号检测，从而获得亲本和子代的基因型数据；
[0014] (5)通过基因序列分析软件对上述得到的基因型数据进行分析对比，从而对长牡 蛎亲本和子代进行亲缘关系鉴定。
[0015]上述步骤⑵中筛选得到的引物序列如下：
[0016]
[0018] 该引物序列包括18种正、反向引物以及1种带有荧光标记的通用引物序列。
[0019]所述正向引物的5'端添加 M13(-21)通用引物序列，荧光标记添加在单独合成的 M13(-21)通用引物序列的5'端，所述荧光标记为FAM、VIC、NED其中的一种;本发明使用了加 尾引物，相比于直接在正向引物5'端添加荧光标记，本发明不仅大大降低了在每个位点添 加荧光标记的昂贵费用，同时也避免了只进行了 10~30个反应的带荧光标记的正向引物的 浪费。
[0020] 根据步骤(2)中得到的引物序列，步骤(3)中所述的6个多重PCR组合如下：
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[0022]上述步骤（3)中的多重PCR扩增的反应程序分为两步：前35个循环使用50°C~60 °C，的退火温度，后8个循环使用53°C的退火温度;优选的，前35个循环6组中退火温度为58 °C、50〇C、54〇C。
[0023] 上述步骤(4)中荧光信号检测采用毛细管荧光电泳方法，毛细管电泳采用荧光标 记的方式对位点进行区分，不同的荧光染料在被激光激发后，会释放出不同波长的荧光信 号，利用虚拟滤镜技术，可使得不同荧光获得区分，在同一根毛细管中可以同时混合多个位 点，大大增加了处理通量。
[0024] 所述的基因序列分析软件为Genemapper ν4·0和Cervus 3.0。
[0025] 本发明具有的优点和有益效果如下：
[0026] 本发明利用多重PCR的方法，使用荧光标记通用引物，结合毛细管电泳技术，可以 提高分析精度和实验效率。经过已知遗传背景的家系实际验证，使用本发明2组多重PCR组 合对12个长牡蛎全同胞家系进行亲子鉴定，即可达到100%的鉴定成功率。
[0027]为保证养殖牡蛎产品的食品安全，进行牡蛎产品溯源具有重要意义。传统的物理 标记容易改变或者丢失，缺乏足够高的可信度和准确度。本发明的方法是基于DNA微卫星标 记的长牡蛎亲子鉴定技术，采用亲本重建法对养殖个体进行家系分析，可以将长牡蛎个体 成功追溯到其产出地，为确保其食品安全、建立消费者的信赖提供强有力的技术支持。