r>【附图说明】
[0028]图1在95%置信水平下，长牡蛎家系模拟和实际的累积鉴定成功率结果图。
【具体实施方式】
[0029]下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
[0030] 实施例：
[0031] (1)选取性腺成熟好的1龄长牡蛎亲贝进行人工催产，建立12个全同胞单对交配家 系;收集各个家系的全部亲本个体(共24个)和部分子代个体(每个家系40个D形幼虫）； [0032] (2)使用苯酚氯仿法提取每个亲本的DNA，使用螯合树脂法提取每个幼虫的DNA;
[0033] (3)根据前述筛选的18种引物序列以及通用引物序列合成引物；
[0034] (4)使用前述的6种引物组合方式进行多重PCR扩增，多重PCR的反应体系如表1所 示；
[0035] 多重PCR的反应程序为:94°C3min; 94°C变性30s，退火温度退火60s，72°C延伸75s， 35个循环;94°C变性30s，53°C退火60s，72°C延伸75s，8个循环;72°C延伸lOmin，12°C保存。
[0036] 表1用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星标记多重PCR反应体系
[0037]
[0038]
[0039] 其中，反应体系中3对上下游引物的浓度和组分见前述6种多重PCR组合表所示；
[0040] (5)PCR扩增产物经适当稀释后，与分子量内标混合，在ABI 3130测序仪上进行毛 细管电泳分析；
[0041 ] (6)使用Genemapper ν4·0软件分析电泳结果，得到每个个体微卫星标记的基因型 数据;混合12个全同胞家系的480个子代个体的基因型数据，以检验微卫星多重PCR在亲子 鉴定中的效率;使用Cervus 3.0软件对亲本和子代个体进行亲缘关系分析，计算每个子代 最可能的父母本个体;根据分析结果，将置信度最高的雄性和雌性个体确认为子代个体亲 本。
[0042] 结果显示，在全部的504个个体(24个亲本和480个子代）中，在95 %置信水平下，运 用两组多态性最高的多重PCR(6个位点）即可达到100%的亲子鉴定成功率，如图1所示。
[0043] 家系鉴定的成功率不仅与微卫星的多态性和标记数量有关，而且也与所选择群体 可能配对的亲本数有关。Bentsen and 01esen(2002)建议在群体选择育种中使用50对亲本 可以有效的避免近交并获得长期的选择反应。根据Cervus 3.0软件模拟结果，当亲本数达 到400对时，使用本发明3组多态性最高的多重PCR组合仍可达到100 %鉴定成功率。因此，在 实际生产中进行大批量材料分析时，本发明6组多重PCR仍是可靠的分析工具。
[0044] 本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行 修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA; (2) 长牡蛎多态性微卫星引物的筛选:根据引物筛选软件以及现有文献记载的长牡蛎 弓丨物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的引 物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记； (3) 对步骤（1)得到的长牡蛎亲本和子代个体的DNA进行多重PCR扩增:对步骤(2)中筛 选得到的引物进行组合，并通过优化PCR反应条件得到6组多重PCR组合； (4) 获得长牡蛎亲本和子代的基因型数据:对步骤(3)得到的多重PCR扩增产物进行荧 光信号检测，从而获得亲本和子代的基因型数据； (5) 通过基因序列分析软件对上述得到的基因型数据进行分析对比，以对长牡蛎亲本 和子代进行亲缘关系鉴定。2. 如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(2)中筛选得到的引 物序列如下：该引物序列包括18种正、反向引物以及1种带有荧光标记的通用引物序列。3. 如权利要求2所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述正向引物的5'端添加 M13 (-21)通用引物序列，焚光标记添加在M13(-21)通用引物序列的5'端。4. 如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，根据步骤(2)中得到的引物序 列，步骤⑶中所述的6组多重PCR组合如下：5. 如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的多重PCR扩 增的反应程序分为两步:前35个循环使用50°C~60°C的退火温度，后8个循环使用53°C的退 火温度。6. 如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的引物组合和 优化PCR条件具体操作为:首先将所述各引物两两组合，选出扩增清晰的组合再进行3个位 点的多重PCR体系的构建;通过优化退火温度、引物浓度、反应体系最终得出6组多重PCR组 合。7. 如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(4)中荧光信号检测 采用毛细管荧光电泳方法。8. 如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的基因序列分析软件为 Genemapper ν4·0和Cervus 3.0〇9. 如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的长牡蛎子代DNA提取选 取的实验材料是D形幼虫。
【专利摘要】本发明公开了一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，该方法包括如下步骤：提取亲本和子代DNA；使用18个微卫星位点及带荧光标记的M13（-21）通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。经验证，使用本发明2组多重PCR组合对12个长牡蛎全同胞家系进行亲子鉴定，即可达到100%的鉴定成功率。本发明为长牡蛎提供了一套经济有效、准确度高的基于DNA标记的亲子鉴定技术。通过微卫星标记鉴定获得的系谱关系记录，可以将长牡蛎个体追溯到其产出地，从而建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，为解决当今社会人们日益关注的食品安全问题提供有力的技术支持。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105441576
【申请号】CN201610018599
【发明人】李琪, 刘婷, 于红
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2016年1月12日