鉴别当归早薹的dna分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种当归早薹的鉴别方法，具体涉及一种鉴别当归早薹的DNA分子标 记序列及其具体应用。
【背景技术】
[0002] 核酸序列的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于药用植物特异性状的分 子标记以及在药用植物的种质选育具有重要意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法 有生理、生化指标的检测、显微检测等方法，这些方法需要复杂的操作和特殊的设备。1993 年PE公司的Dr.Kary B.Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简 称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物研究和临床治疗中，对DNA的检测进入了新时代。
[0003] 扩增片段产度多态性(AFLP)分析技术基本原理是先利用限制性内切酶水解基因 组DNA产生不同分子量的DNA片段，再使用双链人工接头和酶切片段相连接，连接产物作为 扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基 础上添加1-3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，一般以DNA作为模 板需要添加3个选择性核苷酸作为引物分离效果较好。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 检测选择性扩增获得的DNA片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组 成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3'端的选择碱基序列 (l_3bp)。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在不知道DNA信息的前提下就可对酶切 片段进行PCR扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多 切点，另一个酶切点数较少，因而AFLP分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP具 有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。AFLP高效可靠的特点使它在基因组研究中有广阔的 应用前景。
[0004] 当归早薹影响当归的产量和品质，因此选育出优良品种的当归具有重要意义，但 是目前关于当归早薹的鉴别方法未见报道。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种鉴别当 归早薹的DNA分子标记和其应用。
[0006 ]技术方案，为了解决以上问题，本发明采取的技术方案为：
[0007] 鉴别当归早薹的DNA分子标记，所述的DNA分子标记是通过扩增片段长度多态性分 析技术研究早薹当归和正常当归在基因组学水平的差异，获得早薹当归的特异分子标记片 段，并通过PCR和测序技术对差异片段的序列进行分析，获得DNA分子标记ZT-1、ZT-2和ZT-3,它们的序列分别为SEQ ID No:l，SEQ ID Νο:2和SEQ ID Νο:3。
[0008] SEQ ID No :1 的序列为：
[0009] CAAGCAAACCATTGTAGATGGGGTTACTTTTGCACCTAACAACATTGTTGCTTTGTTAGATCATAAGGATTTCCCTA GTGATTTTCATATCATTCAGGATTTCCTCGCCTGTAGTCCATTGAACTTTGCTCTAACTCAACCTTTGAAGGTTTCG TGTAAGAGTGTTATGCAGGTATGGACCACTGCTAAGTTTGCGAAGCTGGCATCGTCAGGACAGCTCCACATGTCGTT TGTTCACAATGGGACTGTCTATGGGGTCACTCCTGAAGTTGTAGAAGATGCACTCCAATTACCCAAGCTCGGTACTA o
[0010] SEQ ID No :2的序列为：
[0011] CATCCAGATGTACCTGCAAAGAAATTTCCTTGTCAAAGACAAGTTGCTGACCAGTCCCGTAGGCTGATCCTTCCCTT AGAGGGTACCATAGGATTTAAGTCTGGTAGGGTATACGAGGGTTCTGTAGTTAGCTAGAATCCCAAGTTTCACTTGA CGCCTGTGAAGGCACTTGGTTCATGGAACCACTAACCGTTGTCATTGACCATGAAATGGTTGAACAAATAGTTGCTT CCATCAACTTTTCCTCTGTGTGT 〇
[0012] SEQ ID No :3的序列为：
[0013] AGTCCTAGAGTACCTAGGCGGAGTACAATTGTTTGTAGAGCACTATCTTGAGTTTTCTTGTTGTCTGAGCATTGATG TTATCTGAGGTTTACCTCACATATTTTATTGAAACTTCTTCCTCAAAATTCCGGAAGAAGGGTGATGGTTATTGGGT GT〇
[0014] 作为优选方案，以上所述的鉴别当归早薹的DNA分子标记，对早薹当归和正常当归 进行基因组水平多样性分析，在6%的聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳，电泳结果用硝酸银染 色，染色后的聚丙烯酰胺凝胶比较早薹当归和正常当归基因组水平差异，割取差异明显、分 子量较大的片段，获得早薹当归的特异分子标记片段。
[0015] 本发明所述的DNA分子标记在早薹当归的种质鉴定中的应用。
[0016] -种早薹当归的种质鉴定试剂盒，其含有本发明提供的DNA分子标记。
[0017] 有益效果:本发明提供的鉴别当归早薹的DNA分子标记具有以下优点：
[0018] 本发明采用AFLP筛选当归和早薹性状相关的分子标记，通过大量实验建立、优化， 摸索出适合当归种的AFLP的反应体系及银染反应体系，获得清晰的DNA指纹图谱，并在此基 础上筛选当归早薹的分子连锁标记。本发明优选得到的早薹当归种质中的特异性DNA序列， 序列可以应用于早薹当归的种质鉴定，对选育抗早薹品种的当归具有重要意义。本发明提 供的当归早薹的DNA分子标记稳定性好，重复性好。
【附图说明】
[0019] 图1为基因组DNA电泳图。
[0020] 图2为早薹和正常当归选择性扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0021] 图1中1为正常当归;2为早薹当归；图2中ZC:正常生长当归;ZT:早薹当归。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各 种等价形式的修改均属于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0023] 实施例1
[0024]当归早薹的DNA分子标记序列筛选方法：
[0025] 1.当归基因组总DNA提取
[0026] 提取植物基因组DNA用改良的CTAB法。称取当归叶片1 g，用液氮充分磨成粉末，收 集粉末于离心管中，加4mL预热至65°C的CTAB提取液，65°C保温lh。加入等体积氯仿/异戊醇 (24:1)抽提、颠倒使混勾，5500rpm/min离心10min，取上清液，重复抽提2-3次。吸取上清液 加入2/3体积预冷的异丙醇，在-20°C静置211。750(^离心10min，沉淀用400yLTE溶解，加入预 煮沸的RNase A 4yL，37°C保温30min。再用等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提1-2次，取上清液 加入等体积异丙醇沉淀DNA，轻摇管子混匀至出现白色絮状沉淀。用牙签挑出DNA，放入800μ L76 %乙醇、0.2Μ乙酸钠中洗涤20min，将牙签及其上的DNA在70 %冷乙醇中洗涤几秒钟后放 入一支装有300yLTE的1.5mL离心管中，轻摇，4°C下过夜使DNA溶解。分装，置于-20°C长期保 存。
[0027] 2.DNA浓度与质量测定 [0028] (1)琼脂糖电泳法
[0029]将提取的模板DNA在1 %琼脂糖凝胶电泳上检测，以1 X TAE为缓冲液，指示剂为溴 酚兰，电泳结束后EB染色，胶块于成像系统中观察照相，如图1所示。纯的DNA样品在紫外线 下应呈现一条迀移率很小的整齐条带。如果溴酚兰前有弥散的荧光区出现，则表明样品中 存在RNA杂质，若DNA在凝胶上不形成清晰的条带，而只是弥散的一片，则表明DNA已严重降 解。
[0030] (2)紫外分光光度法
[00311取50yL DNA溶液稀释20倍，以双蒸水为对照用紫外分光光度计测定波长为260、 280nm下的光吸收值。DNA浓度(yg/yL)按0D260 X 50/1000 X稀释倍数计算；纯度按0D260/ 0D280之比值判断。纯的DNA溶液其0D260/0D280应在1.9-1.6之间，如0D260/0D280大于1.9 时，表明有RNA污染，小于1.6则表明有蛋白质或酚类物质污染。
[0032] 3.AFLP方法的建立
[0033] AFLP体系及程序参照Vo s等的方法。
[0034] (1)酶切反应
[0035] DNA用EcoRI和Msel双酶切，37°C过夜，65°C2小时。反应体系：DNA200ng，10X Buffer2yL，MseI0 · 3yL( lOU/yL)，EcoRI0 · 25yL( lOU/yL)，加 ddH20至总体积 10yL。
[0036] (2)连接反应
[0037]
[0038]
[0041]
[0042] 预扩增条件：94°C变性3min; 94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin( 26个循 环）；72°C延伸5min。反应体系:模板]^1^(：〇1?1(1001^凡)预扩引物0.3以1^，]\1861(100即凡)预 扩引物0 · 3yL，Buffer 2yL，dNTP (1 OmM) 0 · 4yL，MgC 12 (25mM) 1 · 2yL，Tag酶（5U/yL) 0 · 2yL，加 ddH2〇至总体积20yL。
[0043] (4)预扩增产物为模板进行选择性扩增
[0044]
[0045]优化选择性扩增反应条件，设立模板浓度梯度、酶离子浓度梯度、dNTP浓度梯度； 扩增结果电泳检测。选择性扩增条件:94°C变性3min; 94°C变性30s，65°C退火30s (每次循环 下降0.7°C)，72°C延伸lmin( 13个循环）；94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin(24个循 环）；72°C延伸5min。
[0046] (5)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
[0047] 参照优化条件进行早薹、正常当归基因组水平多样性分析。选择性扩增产物在6% 的聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳，电泳结果硝酸银染色。如图2所示。
[0048] 4.差异表达片段的分离和再扩增 [0049] (1)差异表达片段的分离
[0050]染色后的聚丙烯酰胺凝胶比较早薹和正常当归基因组差异，割取差异明显、分子 量较大的片段。50yL ddH20溶解，95°C加热15min，4°C过夜，_20°C冷冻保存。
[0051 ] (2)差异片段的PCR扩增
[0052] 2yL差异片段溶解液作为反